Detection of specific bacteria in water: implications of survival strategy

It is widely recognised that conventional culture techniques may underestimate true viable bacterial numbers by several orders of magnitude. The basis of this discrepancy is that a culture in or on media of high nutrient concentration is highly selective (either through ”nutrient shock” or failure to provide vital co-factors) and decreases apparent diversity; thus it is unrepresentative of the natural community. In addition, the non-culturable but viable state (NCBV) is a strategy adopted by some bacteria as a response to environmental stress. The basis for the non-culturable state is that cells placed in conditions present in the environment cannot be recultured but can be shown to maintain their viability. Consequently, these cells would not be detected by standard water quality techniques that are based on culture. In the case of pathogens, it may explain outbreaks of disease in populations that have not come into contact with the pathogen. However, the NCBV state is difficult to attribute, due to the failure to distinguish between NCBV and non-viable cells. This article will describe experiences with the fish pathogen Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida and the application of molecular techniques for its detection and physiological analysis.

Papel das hemaglutininas 67-72p de Corynebacterium diphtheriae na ligação a proteínas plasmáticas, superfícies celulares, invasão e indução de apoptose

Corynebacterium diphtheriae pode ser isolado tanto de quadros de difteria clássica, quanto de infecções sistêmicas, como endocardite. O fibrinogênio (Fbn) e a fibronectina (Fn) são glicoproteínas presentes na matriz extracelular de tecidos conjuntivos. A influência destas proteínas na patogênese das infecções locais e invasivas causadas por C. diphtheriae é objeto de estudo devido ao fato do bacilo diftérico poder ser encontrado em lesões nas quais o Fbn e a Fn são predominantes, incluindo a pseudomembrana diftérica e vegetações cardíacas presentes na endocardite infecciosa. São crescentes as evidências de que o C. diphtheriae pode, além de aderir, ser internalizado por células em cultura. No presente estudo, investigou-se a participação de C. diphtheriae e das proteínas de superfície 67-72p na aderência à Fn e ao Fbn de plasma humano e a eritrócitos. A aderência às células HEp-2 e internalização também foram analisadas. A participação de 67-72p nos mecanismos de morte celular foi avaliada através das colorações por Azul de Tripan e 46-diamidino-2-fenil indol (DAPI), pelo ensaio de redução utilizando dimetil-tiazol-difenil tetrazólio (MTT) e por citometria de fluxo. As 67-72p foram extraídas da superfície da amostra toxigênica C. diphtheriae subsp. mitis CDC-E8392 através de processos mecânicos e precipitação com sulfato de amônio saturado. Análises por SDS-PAGE e immunoblotting detectaram a presença das bandas protéicas de 67 e 72kDa nas amostras toxinogênicas e atoxinogênicas analisadas, as quais pertenciam aos biotipos fermentador e não fermentador de sacarose. C. diphtheriae foi capazes não só de formar agregados na presença de plasma de coelho, mas também de converter Fbn em fibrina independentemente da presença do gene tox. No entanto, a amostra atoxinogênica ATCC 27010 (tox-) foi menos aderente ao Fbn do que a homóloga ATCC 27012 (tox+). A interação bacteriana com eritrócitos foi inibida somente pela Fn. Ligações entre Fn e/ou Fbn com 67-72p foram demonstradas por dot blotting, ELISA e/ou ensaios utilizando fluorescência. As 67-72p foram capazes de inibir as interações bacterianas com o Fbn, indicando que 67-72p podem participar do processo de aderência do patógeno aos tecidos do hospedeiro. Através da microscopia óptica, demonstrou-se a ligação de 67-72p adsorvidas em microesferas de látex com células HEp-2. Anticorpos de coelho do tipo IgG anti 67-72p interferiram somente com a expressão do padrão de aderência do tipo difuso, normalmente apresentado pela amostra CDC-E8392. A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e a inibição da internalização bacteriana pela IgG anti 67-72p ou por 67-72p indicaram o papel de 67-72p como invasina. Alterações do citoesqueleto de células HEp-2 com acumulação de actina polimerizada, induzida por microesferas sensibilizadas com 67-72p, foi observada pelo fluorescent actin staining (FAS) test. Foi visualizado um aumento no número de bactérias viáveis no compartimento intracelular após tratamento de células HEp-2 ou dos microrganismos com Fn. A presença de partículas de látex adsorvidas com 67-72p no interior de vacúolos frouxos em células HEp-2 sugeriu que estas proteínas podem causar efeito citotóxico. A avaliação através das colorações com Azul de Tripan, DAPI e os ensaios de redução utilizando MTT demonstraram um decréscimo na viabilidade de células tratadas com 67-72p. As mudanças morfológicas observadas 3 horas após o início do tratamento com 67-72p incluíram vacuolização, fragmentação nuclear e formação de corpúsculos apoptóticos. A citometria de fluxo revelou um decréscimo de 15,13% no volume/tamanho de células tratadas com 67-72p. Além disso, o ensaio utilizando Iodeto de Propídio (IP) e Anexina V (AV)-FITIC demonstrou que havia 66,1% de células vivas (IP-/AV-), 16,6% de células em apoptose inicial (IP-/AV+) e 13,8% de células em apoptose tardia ou necrose secundária. Em conclusão, as 67-72p estão diretamente envolvidas na interação com Fn e Fbn. As proteínas não fimbriais 67-72p são hemaglutininas implicadas na aderência a células respiratórias e na internalização. Além disso, estas proteínas podem atuar como fatores de virulência em potencial para induzir apoptose de células epiteliais nos estágios iniciais da difteria e nas infecções invasivas causadas pelo C. diphtheriae

Marcadores fenotípicos e genotípicos de resistência aos antimicrobianos em enterobactérias e Staphylococcus spp. e detecção de genes para a produção de enterotoxina estafilocócica em cepas isoladas de equipamentos da cozinha de um hospital universitário no município do Rio de Janeiro

A resistência aos antimicrobianos pela produção de β-lactamases em enterobactérias é um problema adicional neste cenário. Staphylococcus spp é considerado um patógeno humano freqüentemente associado a infecções adquiridas no ambiente hospitalar. O objetivo desse trabalho foi estudar a resistência aos antimicrobianos em cepas de Enterobactérias e Staphylococcus spp. isoladas de equipamentos utilizados no preparo de dietas destinadas à pacientes internados em um hospital universitário no município do Rio de Janeiro, além de verificar a presença de genes codificadores de enterotoxinas nas cepas de Staphylococcus spp. As enterobactérias e os Staphylococcus spp. foram isolados e identificados por metodologia convencional. Para o teste de susceptibilidade aos antimicrobianos foram utilizados discos contendo antimicrobianos clinicamente relevantes. Foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) pela técnica de microdiluição em caldo para os antimicrobianos clinicamente relevantes. A pesquisa de genes que codificam β-lactamases em enterobactérias foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento para os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA-1 e blaCMY-2. Para Staphylococcus spp. foram pesquisados, através da PCR e sequenciamento, os genes de resistência a meticilina, gentamicina e eritromicina e os genes codificadores de enterotoxinas (sea-see, seg-sej, sen-ser e seu). Foram isoladas 97 cepas de enterobactérias, 40 de liquidificador e 57 de batedeira e 40 cepas de Staphylococcus spp., 20 de cada equipamento. Dentre as enterobactérias, o gênero Enterobacter foi isolado com maior frequencia (n=37, 38%). Foram ainda isoladas seis cepas de Salmonella spp. Das enterobactérias, 80% (n=79) foram resistentes a pelo menos um antimicrobiano e 38% (n=37) a três ou mais. A expressão fenotípica presuntiva de b-lactamases do tipo AmpC foi detectada em 32 cepas. O gene blaCMY-2 não foi encontrado. Doze cepas apresentaram halos de inibição com screaning positivo para a pesquisa de ESBL. Foi detectada a presença do gene blaSHV em K. pneumoniae subsp. pneumoniae. O sequenciamento desse gene permitiu identificá-lo como sendo blaSHV-36. Dentre os Staphylococcus spp., oito foram identificados como coagulase-positivas (SCP) e 32 como coagulase-negativas (SCN). As oito cepas de SCP foram identificadas como S. aureus subsp. aureus. Dentre os SCN, as espécies identificadas com maior frequência foram: S. caprae (n=7, 17,5%), S. simulans (n=5, 12,5%) e S. epidermidis (n=4, 10%). Destas, 83% (n=33) foram resistentes a pelo menos um antimicrobiano e 30% (n=12) foram resistentes a mais do que três. Duas cepas (5%) de S. epidermidis apresentaram perfil de resistência a até seis antimicrobianos e genes de resistência a meticilina, a eritromicina e a gentamicina. Todas as sete cepas que foram resistentes no TSA e na CIM a gentamicina, apresentaram o gene aac(2)/aph(6). O gene ermB foi observado ainda em uma S hominis subsp hominis que apresentou resistência na CIM e no TSA. Foi detectada a presença de pelo menos um gene codificador de enteroxotxina em 83% (n=33) das cepas. O gene seg foi detectado em 11 cepas, o gene sei em 17 cepas e o gene sen em 31 cepas. Os resultados encontrados implicam as dietas preparadas com esses equipamentos como veículo de disseminação de enteropatógenos e Staphylococcus spp. com marcadores de resistência e genes codificadores de enterotoxinas relevantes no ambiente hospitalar.

Estudo da resistência aos antimicrobianos em enterobactérias isoladas de mãos de manipuladores de alimentos em cantinas permissionárias de uma universidade no Município do Rio de Janeiro

A contaminação dos alimentos e transmissão de patógenos via manipuladores pode ocorrer se as condições de higiene, armazenamento e preparo não estiverem satisfatórios. Procedimentos inadequados de manipulação oferecem um perigo potencial à saúde pública devido ao alto risco de ocorrência de doenças de origem alimentar por microrganismos resistentes aos antimicrobianos. Neste estudo foram coletados swabs das mãos de 49 manipuladores de alimentos, isoladas e identificadas por metodologia convencional 244 enterobactérias de 7 cantinas permissionárias em uma Universidade do Município do Rio de Janeiro. Foram utilizados discos contendo os seguintes antimicrobianos: aztreonam, tobramicina, ceftazidima, cloranfenicol, tetraciclina, sulfa, amicacina, ampicilina e sulbactam, ciprofloxacina, gentamicina, cefalotina, cefepime, cefoxitina, imipenem, ampicilina, cefotaxima. A pesquisa de genes que codificam β-lactamases foi realizada pela Reação em Cadeia da Polimerase para os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX, blaOXA-1 e blaCMY-2. As espécies mais prevalentes identificadas foram: Enterobacter cloacae (21,3%), Citrobacter braakii (15,2%), Escherichia coli (12,7%), Klebsiella pneumoniae subesp. Pneumoniae (12,2%). O perfil de resistência aos antimicrobianos revelou que 94 (38,5%) cepas identificadas apresentaram resistência a pelo menos dois antibióticos, 55 cepas (22,5%) a pelo menos um antibiótico, 34 cepas (13,9%) a três antibióticos, 14 cepas (5,7%) mostraram-se resistentes a quatro antibióticos. Uma cepa de E. cloacae mostrou resistência múltipla a dez antibióticos e 140 cepas (57,3%) foram resistentes simultaneamente a cefalotina e cefoxitina. Nenhuma cepa foi resistente ao aztreonam e a sulfa e apenas 01 foi resistente ao ciprofloxacina, 01 ao imipenem e 02 a cefotaxima. Foi identificado a presença do gene blaSHV em uma cepa de K. pneumoniae subsp. pneumoniae. Este dado aponta para uma mudança no perfil dessas bactérias isoladas da comunidade que passam a ter características semelhantes com as de origem hospitalar. Os resultados alertam para um perigo à saúde dos consumidores e conseqüentemente à saúde pública, devido a presença de enterobactérias resistentes aos antimicrobianos nas mãos de manipuladores de alimentos.

黄芪复合体Astragalus penduliflorus Lam. complex (Leguminosae)的物种生物学研究

本文对黄芪复合体（Astragalus penduliflorus）复合体进行了物种生物学研究，主要内容包括如下： 1、形态学与物种生物学证据支持目前承认的黄芪复合体5种4变种应分为1种5亚种（其中新亚种一个）。它们是A. penduliflorus subsp. penduliflorus, A. penduliflorus subsp. seiceocanus, A. penduliflorus subsp. mongholicus, A. penduliflorus subsp. qinhaiensis（新亚种）和A. penduliflorus subsp. pallidipurpureus等5个分类实体。 2、讨论了分类群间的形态演化关系。黄芪复合体的进化趋势可能为：A. penduliflorus subsp. pallidipurpurous A. penduliflorus subsp. Qinhaiensis → A. penduliflorus subsp. Mongholius → A. penduliflorus subsp. Sericeocanus → A. penduliflorus subsp. pendulifloras。 3、分析了黄芪复合体3个亚种10个居群的染色体核型，它们的染色体2n=16，各居群间的核型呈现连续的变异式样。 4、分析了黄芪复合体5个亚种13个居群和两个近缘种的种子蛋白，并进行了聚类分析，认为种子蛋白性状在黄芪复合体的居群内比较稳定，且同一居群内的不同个体间无明显差异。同时，种子蛋白分析说明了复合体内居群也呈现连续变异。 5、应用最大同步分支分类法及最小平行进化分支分类法分析了黄芪复合体的谱系分支发生，确认复黄芪复合体为一自然复合种是比较客观的。

牡丹复合体的研究

牡丹复合体属芍药属(Paconia)牡丹组(Sect. Moutan)．原有6个种名，包括花壬 牡丹、名贵野生花卉紫斑牡丹，著名中药牡丹皮原植物，野生种类为我国特有，仅分 布在以秦岭为中心的较小区域．本研究从山西、陕西、河南、湖北、甘肃共采集14 个居群（包括复合体不同类型）．通过野外居群调查、样方研究，移栽实验，以及细 胞学观察、孢粉学观察分析、种子蛋白和DNA水平多样性的探索性的工作，并结合 聚类分析方法，对牡丹复合体进行了分类学和保护生物学两方面的研究，主要结论 为： 1．本复合体为多年生木本植物，生长缓慢，在天然状况下，从种子播种到开花结实长达7年．枝条通常具隔年开花习性．严格单花顶生，花期短(5-10天)．雄蕊先熟，以异花传粉为主（主要传粉者有甲虫和野蜂）．自交亲和，甲虫在传粉过程中常常破坏心皮和胚珠．胚珠败育比例很高，紫斑牡丹50%．其它类群达90%． 2．种子生物学特性研究，发现本复合体种子属正统种子，但种子衰变快．种子萌发时间长，一般的化学及物理处理对种子萌发无明显促进作用，种子具上胚轴休眠特性．打破休眠需要两个条件：一是胚根长足3 cm．二是10℃左右的低温或GA3处理，野生紫斑牡丹种子较大，复合体其它野生类群种子较小．野生牡丹的种子活力相当低，萌发时间更长． 3．样方的调查统计表明，稷山和永济两地区的矮牡丹株数一龄级分布规律是2—5年生个体最多，随年龄级的增加，个体数目减少．居群呈增长趋势．紫斑牡丹株数一龄级分布规律是青壮年时期个体数目多，幼年时间和老年时期个体数目少，居群呈衰退的趋势，这与其本身繁殖方式和人为破坏程度相关． 4．对13个居群花粉扫描电镜观察表明，本复合体紫斑牡丹(P. rockii)为粗网纹，网眼大，其它类群为细网纹、网眼小． 5．通过18个居群的核型分析并结合前人工作，发现本复合体染色体数目稳定2n =10．核型差别不大，野生类群和栽培品种间有一定分化，但总体上核型多样性比较贫乏．通过8个居群C带研究，发现带纹很少，但多样性很丰富．8个居群表现出7种带型． 6．种子蛋白和DNA水平多样性的初步研究，发现复合体具有较丰富的多样性．但多样性的分布对类群的划分帮助不大，有待进一步研究． 7．通过形态性状分析发现产自各地区矮牡丹、河南粉花类型、神农架红花类型具根出条现象，并以此为主要繁殖方式，紫斑牡丹无此现象．神农架红花类型植株矮小，复合体其它类群较高．产自各地区的矮牡丹和神农架红花类型为二回三出复叶．小叶数目多为9．矮牡丹顶生小叶具浅裂、中裂或深裂，裂片具齿，神农架红花类型顶生小叶仅具浅裂或齿（全缘）．河南粉花类型为二回羽状复叶．小叶数目12-15．紫斑类型叶为二回或三回羽状复叶、小叶数目15-40．小叶分裂方式分两种类型，秦岭西部居群以浅裂、全缘为主，东部居群以中裂或深裂为主，裂片具齿．神农架红花类型花为平展型、较小，其它地区花杯状、较大．花盘有二种类型．紫斑类群花盘黄色或白色．1／2-4／5包被心皮，心皮被稀疏长柔毛，其它类群花盘紫红色，全包心皮，心皮密被短硬毛．根据形态性状分析．并结合细胞学、孢粉学和地理分布研究，对复合体做如下处理：(l)把神农架红花类型做为新种处理P．quii Y.L．Pei et Hong．(2)保留P.rockii(S.G.Haw et L.A. Lanener)T.Hong ct J.J.Li和P.ostii T.Hong et J．X. Zhang．前者进一步分成二亚种：subsp. rockii和subsp. lanceolata Y.L．Pei et Hong（新亚种）．后者包括河南粉花类型，中药丹皮原植物．(3)保留P．suffruticosa Andr.种内分二亚种：subsp. suffruticosa和subsp. spontanea (Rehd．)S．G. Haw et L．A, Lauener. (4)废弃P.papaveracea Andr.和P.jishanensis T.Hong et W.Z.Zhao (5)P．yanancnsis T．Hong et M.R．Li作为存疑种处理． 8．通过上述研究对野生牡丹濒危原因加以分析，认为致濒原因主要是人为干扰和种子萌发和传粉特点等生物学特性造成，但以前者为主，建议应广泛开展各个层次多样性研究，为生物多样性保护利用奠定基础。

中国三种野生稻的遗传变异与保护生物学研究

稻属(OryzaL．)隶属禾本科(Poaceae)之稻族(OryzeaeDUmort.)，广布于全球热带与亚热带地区。目前认为该属约含20个野生种和2个栽培种，中国产4个种。亚洲栽培稻(O. sativaL．)是世界上最重要的粮食作物之一，而在中国则为第一粮食作物。在稻种基因库中，发掘野生稻中丰富的遗传多样性是解决当今人口与粮食矛盾的必由之路。因此，保护野生稻的遗传多样性举世瞩目。针对热带与亚热带地区的环境恶化而导致野生稻居群的大量绝灭与急剧萎缩的状况，制订有效的策略，最大限度地保护野生稻的遗传多样性已迫在眉睫。然而，目前对野生稻种内遗传多样性的知识十分贫乏，缺乏制订保护策略的科学基础。这一问题在中国尤为突出。本文基于1994-1995年对中国三种野生稻濒危状况的调查结果，利用等位酶分析对普通野生稻26个居群，药用野生稻8个居群和疣粒野生稻l7个居群进行了遗传多样性的研究，并重点对目前育种价值最大而濒危程度最高的普通野生稻从五个方面作了进一步的探讨。最后根据遗传多样性的研究结果讨论了它们的濒危原因，并提出了初步的保护策略。主要结果如下： 一．普通野生稻D．rufipogon Griff. 在中国的三种野生稻中，普通野生稻的遗传多样性水平最高(A=1.33，P= 0.227，Ho=0.033和He=_0.068)，遗传分化水平较低(Fst=0,310)。广西与广东的居群较其它地区的居群具有较丰富的遗传变异。因此，华南可能是中国普通野生稻的遗传多样性中心;云南现存的所有三个居群的遗传多样性水平偏低(A=1.10.p=0.148，Ho=0.007和He=0.079)，与该地区栽培稻丰富的遗传多样性形成鲜明对照，普通野生稻居群间的遗传一致度与地理距离无明显相关。 1．通过14个中央居群与5个边缘居群的对比研究表明了边缘居群的遗传结构明显不同于中央居群：其遗传多样性水平与遗传分化均低予中央居群，杂合子比中央居群更为不足。而且，从中央居群到边缘居群，位点的多态性逐渐丧失，遗传多样性水平递减，一些多态位点的等位基因频率逐渐地发生变化。 2. 通过7个受栽培稻基因渗入的居群与5个隔离较好居群的对比研究表明，被渗入居群虽然在形态上表现出复杂的变异式样，但遗传多样性水平并无相应的增高。栽培稻基因流对野生居群遗传结构的影响可能主要是遗传同化，即阻止其居群内与居群间的遗传分化。 3. 通过对2个低纬度居群与2个北缘居群两个生活史阶段的遗传多样性研究表明繁育系统是影响普通野生稻居群遗传结构的因素之一。在低纬度居群中种子阶段的遗传变异高于植株阶段，在高纬度居群中则相反。 4．通过对北缘居群(江西东乡)1980年，1985年和1994年的居群遗传结构的研究，发现该居群的遗传结构逐渐在发生变化，表现为遗传多样性水平不断下降，居群越来越偏移哈迪一温伯格平衡和杂合子变得越来越缺乏。 5．通过对一个典型的普通野生稻居群（元江居群）的居群内遗传结构的研究，表明遗传变异在3个亚居群间分布不均衡，基因型里聚集分布，使得亚居群间有一定的遗传分化。导致其居群遗传结构的亚划分的主要原因可能是有限的基因流(Nm=0.964subsp.granulata Nees et Arn.ex Watt. 疣粒野生稻的遗传多样性水平(A=1.Ot5，p—0.0633，Ho- 0.022和He=O.O16)在三种野生稻中最低，但居群遗传分化却很高(FsT=0.859)。海南的遗传多样性水平与云南差别不大。剧烈的遗传分化不仅发生在海南与云南之间，而且还发生在地区内，甚至在很小地区内的居群阍。对每个地区来说，居群间的遗传一致度与地理距离明显相关，符合“隔离一距离”模型。该物种是克隆植物，遗传变异贫乏但居群遗传分化剧烈是这类植物的特征。 四. 对保护中国野生稻遗传资源的启示 中国的三种野生稻是居群水平上而非物种水平上的的濒危。人类的剧烈干拢和生境遭受破塥是导致它们濒危的主要原因。对普通野生稻和药用野生稻来说，人为的干扰导致了它们现存的居群变小且相互隔离，居群间的基因流受阻，遗传漂变的作用在小群体中显得尤为突出，并与严重的近交相交织，导致遗传多样性大量丧失，居群的遗传结构也进一步改变，从而产生真正遗传学上的濒危，甚至灭绝。对于普通野生稻的大多数居群来说，栽培稻频繁的基因流带来的遗传同化，也会直接或间接地引起濒危甚至消亡。 鉴于普通野生稻有69.0%的遗传多样性存在于居群内，收集种质资源时应在遗传变异丰富的居群中，特别在其遗传多样性中心的居群中取较多数量的个体，还应在不同的地理区域选择2～3个遗传变异丰富、彼此遗传差异大的居群作为代表，捕获存在于居群间的遗传变异。原位保护点的设置应优先考虑以下类型的居群：a．与栽培稻基因流隔离好的居群;b．边缘居群;c．严重受威胁的居群;原位保护区应在其遗传多样性中心设立，选择有数个相邻的较大居群。 鉴于药用野生稻有21.2%的遗传多样性存在于居群内，在收集种质资源时原则上应选择较多的居群，而在每个居群中取较少的个体。海南与大陆居群间的遗传差异较大，故两地的居群都必须收集;药用野生稻的居群通常较小，建议设立原位保护点即可。海南与大陆均须设立保护点，而且在每个地区内应保护尽可能多的居群。对地区间或地区内的居群间进行人工移植，促进基因流，对增强各居群的适应能力会有裨益。 鉴于仅有14.1%的遗传变异存在予疣粒野生稻的居群内，取样的原则是在云南和海南均取尽可能多的居群，而对每个居群取少数个体即可;该种的居群有时较大，其居群内往往有一定的遗传分化，故收集遗传资源时应按亚居群取样;建议在云南与海南各设置2～3个原位保护区，其中可优先考虑我国分布面积最大的云南思茅地区的居群。

绵枣（Scilla sinensis Merr.）多倍体复合体（广义百合科）的物种生物学研究

本文采用物种生物学的方法分析了绵枣[Scilla sinensis (Lour.) Merr.]多倍体复合体细胞地理、形态、生态适应和发育节律的变异。此外，还对AA细胞型居群进行了等位酶分析和杂交实验。结果如下： 1. 细胞学检查秀自中国境内45个居群，检出AA、AB、BB、AAA、BBB和AABB 6个细胞型。多数居群由1种细胞型组成。AA几乎占据着该复合体在中国的整个分布区。BB仅局限于华中和华东地区。AABB分布于华中和华东地区的北侧、东北地区的东南部及台湾岛。45个居的细胞型组成以细胞地理分布图表示。总结前人与我们的工作，该复合体中已发现12个整倍体细胞型（AA、AB、BB、AAA、ABB、BBB、AAAA、AABB、ABBB、BBBB、AABBB和AAABBB）和各种基于多倍体的非整倍体。其基本细胞型为AA、BB和AABB。AA分布于除日本和大陆上BB分布区中心外该复合体的整个分布区。BB分布中国华东和华中地区、朝鲜的济州岛和日本。AABB分布日本、朝鲜和中国东北地区的东南部及华中、华东地区的东侧。另外，BB居群染色体数量最多，AABB次之，而AA最低。 2. 野外调查和栽培实验表明AA细胞型在中国东部和西部地区间存在形态和生态分化，东部居群形态变异较小，其共同特征是纺锤形鳞茎，红褐色;根茎短柱状;叶多灰绿色，蜡质明显，斜升;花葶较强壮而直立;花紫红色;子房每室1胚珠。西部为AA细胞型的现代变异中心，居群间形态变异大，区别于东部居群的特点是鳞茎纺锤形或近球形，根茎短柱状或盘状，叶鲜绿色，蜡质不明显，平卧地面;花葶1－4枝，直立，多花葶时斜升;花白色或淡红色，子房每室胚珠1 ～ 2枚。AA和BB细胞型是向着适于不同地理区的环境发展，因而具有不同的形态和生物学特性的两个类型。BB鳞茎近球形，黄褐色，根茎不明显，为盘状;叶墨绿色，柔软而平卧地面，是适于阴湿的林下环境的结果。春季萌发较早，约在3月初，其夏季休眠特性刚好可渡过华中地区东部夏季的高温多雨，待秋季温度下降时开花结实。而AA划适应了光照较强而干旱的山坡草地灌丛的类型。其发育节律变异较大，但萌动较BB晚，无夏季休眠。AABB细胞型的形态介于两祖先二倍体之间，没有形成独特的生态适应和发育节律。 3. 对AA细胞型的等位酶分析表明，该种的居群表现出较高的遗传变异（A = 2.0, P = 58.6%, H_o = 0.172 和 H_e = 0.185）。居群间存在较明显的分化(F_(ST) = 0.314)。东西两地区间也存在遗传分化。 4. AA居群间多数组合的F_1都低于对照的花粉育性和结实率。尤其是东部和西部居群间组合的F_1花粉育性和结实率极低，几近不育。如果仅仅考虑该复合体的形态变异，它只能作为一个形态复杂多变的种，Scilla sinensis (Lour) Merr.。可是如此处理就掩盖了其细胞型间清晰的进化关系。为弥补这一缺陷，当研究细胞型间的进化关系时，可采用生物学和概念。AA细胞型为S. sinensis (Lour.) Merr.， 可分两亚种：subsp. sinensis 和 subsp. alboviridis (Hand.-Mazz.) K. Y. Ding。BB细胞型为S. thunbergii Miyabe et Kudo。而ABB及含有A和B染色体组的多倍体作为杂交种S. x sino-japonica K.Y.Ding。两个二倍体种形态界限很清楚，但AABB的存在湮灭了两者的间断。

中国堇菜属的分类修订

堇菜科堇菜属全世界约有525–600种，分布于除南极洲之外的广大地区，大部分种类分布于北温带地区和南美洲安第斯山脉地区。我国是堇菜属的主要物种多样性中心之一，《中国植物志》(51卷)记载了111种，另外有58个基于中国产的模式标本描述的学名在该著作中没有处理。由于本属形态变异复杂，分类相当困难，我国该属植物同物异名、名实不符的问题相当常见，《中国植物志》遗漏种类过多，因此需要全面修订。 通过文献查阅、标本研究、野外考察和部分种类的移栽实验，本文对中国堇菜属进行了力所能及的分类修订。描述新种和新变种9个(Viola dimorphophylla、 V. muliensis、 V. bulbosa var. oblonga、 V. gongshanensis、 V. guangxiensis、 V. hui、V. magnifica var. qianshanensis、 V. miaolingensis和V. nitida;其中V. dimorphophylla为全世界堇菜属中发现的唯一具轮生叶的种类)，做出新组合6个(V. biflora var. rockiana、 V. dissecta var. incisa、 V. prionantha var. taishanensis、 V. philippica var. stenocentra、V. kosanensis subsp. pendulicarpa、V. kosanensis subsp. serrula)，补充记载11个以前发表而后来未再在我国有 关分类学著作中提及的种(V. belophylla、V. yunnanfuensis、V. tienschiensis、 V. duclouxii、 V. fargesii、 V. hondoensis、V. kosanensis、V. japonica、 V. striatella、 V. kwangtungensis 和 V. perpusilla)， 确认我国没有V. yezoensis和V. faurieana的分布，发现中国分布新记录种和变种各1个(V. violacea和V. tokubuchiana var. takedana)，将85个学名降为异名，另外对58个《中国植物志》(51卷)中没有处理的学名全部进行了分类处理。我们的修订结果承认中国有堇菜属植物101种、3亚种和13变种，1种因未见模式标本暂存疑。本文对所有种给出了分种检索表、形态描述和标本引证，对大多数种进行了分类学评论和绘出了地理分布图以及形态图解。此外, 本文指定了33个名称的后选模式。 根据形态学、地理分布和细胞学证据，本文将匍匐堇菜组和蔓茎堇菜组予以归并;根据形态特征，在合生托叶组内建立了两个新系，即圆叶堇菜系和鳞茎堇菜系;我们认为前人在二裂花柱组内单纯强调距的长短而完全忽略其他性状划分的两个亚组——长距堇菜亚组和短距堇菜亚组——不合理，故结合根状茎、根、地下匍匐茎和花冠的有关性状对本组重新进行了亚组划分，合并长距堇菜亚组和短距堇菜亚组，建立一个新的亚组，即灰叶堇菜亚组。此外, 本文对3种(V. magnifica、V. henryi和V. pendulicarpa)的系统位置进行了调整。 本文对我国堇菜属34种共42个居群进行了染色体记数，其中20种的数目为首次报道。我们发现合生托叶组的染色体基数应该为x=6,而不是先前认为的x=12, 合生托叶组的大部分种类为多倍体，其中具有种内多倍性的种类具有很强的杂草习性。蔓茎堇菜组的多数种类的染色体数目为2n=24, 与合生托叶组很相似，另外这两个组具有相似的形态和地理分布特征，我们认为蔓茎堇菜组与合生托叶组的亲缘关系较紧密。

丁香属（Syringa L.）的分类学修订

丁香属隶属于木犀科，分布于东南欧和东亚至喜马拉雅地区，我国是丁香属的现代分布中心。《中国植物志》（61卷，1992）记录了我国野生丁香种类16种;《Flora of China》（15卷，1996）记录了中国原产丁香种类16种，并认为全世界大约有20种。丁香属属下分类等级划分分歧较大，很多种的划分也存在争议。花叶丁香、四川丁香等种类是根据栽培植物描述的，没有指定模式标本，给分类处理带来了一定困难。另外，丁香属很多分类群的性状变异非常复杂，仅根据有限的标本很难做出合理的分类处理。本研究通过广泛查阅文献和标本，同时进行野外居群取样和性状观察，对各类群的性状在居群内和居群间的变异进行统计学分析，判断其分类价值，并运用多变量分析的方法，为各类群的合理划分提供依据。结合性状分析和地理分布等证据，做出分类处理。 作者查阅了国内外16个标本馆的近2000份标本，其中模式标本约70份。对我国12个省市的40余个居群进行了取样和观察，采集标本500余份，涉及了《中国植物志》61卷收录的除了藏南丁香以外的所有类群。通过对9个复合体的40余个性状在居群内和居群间的变异进行统计分析，发现叶片类型、叶柄长度、花序着生类型、花冠大小、花丝长度、花药颜色在不同类群间差异明显，可以用作划分种的依据;叶片形状、叶片毛被、花序轴毛被、花冠管形状等性状在有些复合体内的居群间呈现连续的变异，只能用作种下等级（亚种）的划分;叶片大小、花序轴形状、花药着生在花冠的位置、蒴果是否被皮孔等性状在不同复合体的居群间呈现间断或连续的变异，视不同情况可以用作种间或种下等级的划分依据，或作种内变异处理;而叶脉、花色、花萼齿裂、花冠裂片形状等性状在居群间差异不大，不适合用作分类依据。 在性状分析和多变量分析的基础上，本文将丁香属划分为2组2系12种13亚种，其中短花冠管组有1种3亚种;长花冠管组的顶生花序系有5种5亚种，侧生花序系有6种5亚种，并指定了各组和系的模式种;编制了属下各组、系、种和亚种划分的检索表，对12种13亚种进行了形态描述、标本引证，给出了地理分布图和生境，并提出了分类处理依据。文中对巧玲花、皱叶丁香、红丁香和云南丁香等复合体内的一些分类群进行了归并，做出4个新组合：S. pubescens ‘Meyer’、S. villosa subsp. wolfii、S. yunnanensis subsp. sweginzowii和S. yunnanensis subsp. tomentella，处理了11个新异名（S. fauriei H. Lév.、S. julianae C. K. Schneid.、S. meyeri var. spontanea M. C. Chang、S. pinetorum W. W. Sm.、S. wardii W. W. Sm.、S. oblata var. donaldii R. B. Clark et J. L. Fiala、S. afghanica C. K. Schneid.、S. protolaciniata P. S. Green et M. C. Chang、S. tibetica P. Y. Bai、S. reflexa C. K. Schneid. 、S. wilsonii C. K. Schneid.）。作者指定了3种4亚种(S. reticulata subsp. reticulata、 S. reticulata subsp. amurensis、S. pubescens subsp. microphylla、S. oblata subsp. dilatata的后选模式，并对其它10个名称指定了后选模式。文中还提出了分类处理原则，对我国丁 香属的分布及各地方植物志的记载进行了评述，并对丁香属的分布格局提出了作者的看法。 作者还对13个分类群的16号材料进行了染色体观察，发现除了毛丁香有染色体2n=48外，其它均为2n=46，其中朝阳丁香的染色体数目为首次报道。对小叶巧玲花不同异名（包括小叶蓝丁香、小叶巧玲花与小叶蓝丁香的杂交种）的材料进行染色体观察时，发现它们之间差异很小，进一步佐证了作者将其合并的合理性。另外野生的花叶丁香（华丁香）与栽培的花叶丁香在染色体数目上也无差异，支持了作者认为二者为同物异名的观点。

蕨属的系统发育及谱系地理学研究

蕨属（Pteridium Gled. ex Scop）分布范围极广，几乎遍布于全世界。关于此属的属下分类一直争论不休，主要是因为此属的分布广，形态变异比较大，变异类型之间形态差异不显著，缺乏明确的鉴别性状，或者变异类型之间存在过渡。 本研究利用叶绿体rps4-trnS DNA序列和trnS-G DNA序列构建了世界不同地区蕨属植物的系统关系及中国区域蕨属植物的系统关系，同时构建了世界不同地区蕨属植物的单倍型关系。我们发现，（1）南美洲和澳洲的蕨属植物分化最早;（2）北美洲的蕨属植物遗传变异最丰富，有多条相互独立的进化线（evolutionary lineages）;（3）欧亚大陆和非洲的蕨属植物都与北美洲具有密切关系;（4）大洋洲的蕨属植物同时受南美洲和亚洲蕨属植物的影响;（5）东亚的蕨属植物直接受北美洲蕨属植物的影响，与欧洲和非洲没有直接的关系;（6）非洲和欧洲的蕨属植物关系密切，有着相同的起源。 根据不同地点的蕨属植物的系统关系和单倍型Network关系，我们认为，蕨属植物起源于南美洲，而后向北美洲和澳洲扩散。在北美洲东部和东南部蕨属植物得到繁荣并分别向三个方向扩散与分化。第一个方向是朝北美西部扩散，第二个方向是两次独立扩散到亚洲，第三个方向是扩散到非洲，进而由非洲向欧洲扩散。 根据叶绿体基因所揭示的世界不同地区蕨属植物的发生和发展规律结合前人的研究，我们认为蕨属包含四个物种。Pteridium aquilinum (L.) Kuhn，分布于北美洲、亚洲、非洲和欧洲。该种分布广泛，存在一定的地理分化，可进一步划分8个亚种。Pteridium esculentum (G. Forst.) Cokayne，分布于南美洲，并扩散到澳大利亚，甚至东南亚国家。Pteridium caudatum (L.) Maxon，分布于中美洲和南美洲，是个异源四倍体。Pteridium semihastatum (Wall. ex Ag.) S.B.Andrews，分布于澳洲和东南亚，是个异源四倍体。 通过分子数据和形态分析相结合，作者认为中国蕨属包括两个亚种，即蕨[Pteridium aquilinum (L.) Kuhn subsp.japonicum (Nakai) Á.Löve & D.Löve]和毛轴蕨[Pteridium aquilinum (L.) Kuhn subsp. revolutum (Bl.) X. Q. Chen, stat. nov.]。作者认为，《中国植物志》中记载的食蕨，特有种云南蕨、糙轴蕨、镰羽蕨和长羽蕨并不存在或只是蕨或毛轴蕨的变形，或者毛轴蕨与蕨的杂交个体。 为了今后更进一步研究蕨属植物的系统与进化关系、居群的遗传结构等问题，作者还分离了8个具有多态性的微卫星位点，探讨了微卫星引物开发设计过程中如何提高效率等问题。

秦岭苔类植物的研究和中国剪叶苔属（Herbertus S. Gray）的分类学修订

本论文包括两部分的内容，第一部分是秦岭苔类植物的区系研究，第二部分是中国剪叶苔属Herbertus的分类学修订。 秦岭位于我国的中部，东经104º30´～112º52´，北纬32º50´～34º45´N，约76 500 km2。它主要位于陕西省的南部地区，并包括了河南、甘肃和湖北的部分县、市。秦岭的最高峰是太白山，海拔3 767米。秦岭是长江和黄河的分水岭，也是我国温带和亚热带气候的过渡地带。 本研究包含了对自19世纪开始对秦岭苔藓植物的主要采集活动的回顾，和截止2008年以来对秦岭苔类和角苔类植物报道的总结和分析，且首次给出了一份秦岭地区详细的苔类植物的名录，并包括了各个种在秦岭地区的详细分布。根据目前的研究，现已知秦岭的苔类植物有226种（包括种下单位，以下同），其中角苔纲1科3属6种，苔纲30科59属220种；提出了1个新异名：Radula constricta Steph.被处理为Radula lindenbergiana Gottsche var. atypa Massalongo的异名；并提出了1个新组合Metzgeria pubescens var. kinabaluensis (Kuwah) F.X. Li & Y. Jia；发现秦岭新分布的苔类有78种。根据种数，秦岭地区苔类的优势科为光萼苔科（34种），其次为耳叶苔科（23种），裂叶苔科（23种）和羽苔科（19种）。 通过对这些种地理成分的统计，发现秦岭苔类的地理成分以北温带成分为主，占35.05%；其次是东亚成分占到31.78%，这两种地理成分在秦岭占了很大比例，高达66.83%。热带成分相对较少，有22种，占到10.29%。对于苔类来说，中国特有成分在秦岭地区较多，已知有34种，占到15.89%。说明秦岭地区苔类地理成分以温带为主，热带成分占少量比例，且秦岭地区的特有性也比较高。 文章第二部分是对中国剪叶苔属Herbertus S. Gray的分类学修订。剪叶苔属隶属于剪叶苔科，是一个古老而自然的类群，广泛分布于热带和南北温带地区。剪叶苔属植物由于其叶横生或近于横生，侧叶2裂，腹叶2裂或部分不对称3裂，并具假肋，叶细胞具大的三角体而明显区别于苔类的其它属。虽然这个属的概念比较清楚，但在属内种间的划分上存在较大的问题，是苔类中分类较混乱的一个类群。剪叶苔属种的概念多基于叶片形态，包括裂瓣的顶端细胞和假肋的形态及叶基盘边缘附属物的形态。但这些形态特征具很大的可塑性，性状不稳定，造成该属种的概念很模糊。目前全世界剪叶苔属约100余种。中国剪叶苔属的种类尚不确定，《中国苔藓志》中报道了中国有25种l亚种，但Juslen在2006年对亚洲剪叶苔属的修订中，提到中国分布的仅有6种。二者的研究中都存在有一些疏漏和不足之处，对有些种还有争议；且他们的研究中引证的标本都很少，不能全面反映中国剪叶苔属的种类和分布情况。 本研究着手于中国的剪叶苔属，从模式标本入手，从模式标本入手，结合对前人文献中引证标本的查阅，并检视了全国各大标本馆收藏的大量该属的普通标本，对于分类归并上有争议的种，采用扫描电镜和分子生物学的手段进行实验性的研究，对中国的剪叶苔属进行一个全面系统的分类学修订。期望通过本研究，明确中国剪叶苔属的种类和分布情况，为东亚乃至世界剪叶苔属的分类修订提供一份翔实的资料。共查阅了剪叶苔属26个种的模式标本，并检视了中科院北京植物研究所、华南植物园和深圳仙湖植物园馆藏的大量该属植物标本，约600余份。 通过本研究，提出2个新异名：将H. buchii Juslén和H. longispinus var calvs Massalongo处理为H. dicranus (Taylor) Trevis.；将樱井剪叶苔H. sakuraii (Warnst.) S. Hatt.（原并入H. dicranus）和H. minimus Horik.（原并入H. dicranus）重新提出；发现1个中国新分布：H. setigerus (Steph.) H. A. Mill.；确认中国的剪叶苔属17种1亚种：剪叶苔H. aduncus (Dicks.) Gray，剪叶苔纤细亚种H. aduncus subsp. tenuis (A. Evans) H. A. Mill.et E. B. Bohrer，H. armitanus (Steph.) H. A. Mill.，南亚剪叶苔H. ceylanicus (Steph.) Abeyw.，长角剪叶苔H. dicranus (Taylor) Trevis.，高氏剪叶苔H. gaochienii Fu，广东剪叶苔H. guangdongii P.J. Lin & Piippo，卵叶剪叶苔H. herpocladioides Scott. et. Miller，红枝剪叶苔H. huerlimannii Miller，细指剪叶苔H. kurzii (Steph.) H. A. Mill.，长肋剪叶苔H. longifissus Steph.，长刺剪叶苔H. longispinus Jack et Steph.，H. minimus Horik.，长茎剪叶苔H. parisii (Steph.) H. A. Mill.，多枝剪叶苔H. ramosus (Steph.) H. A. Mill.，樱井剪叶苔H. sakuraii (Warnst.) S. Hatt.，短叶剪叶苔H. sendtneri (Nees) Lindb.和H. setigerus (Steph.) H. A. Mill.。本研究还在扫描电镜下观察了H. armitanus、长角剪叶苔H. dicranus和多枝剪叶苔H. ramosus的孢子形态。对于剪叶苔属的修订，还需要更多模式标本的借阅，随着研究深入，剪叶苔属的种类可能会有大量的减少，中国剪叶苔属的种类也将会有一定的减少。

芍药花色形成的化学机制及其化学分类研究

本文以9 个芍药野生种（15 份种质）、104 个品种及2 个牡丹芍药组间杂种的花瓣为材料，利用液质联用技术鉴定了花瓣中的色素成分并探讨了芍药花色形成的化学机制和化学分类法。 结果表明，芍药花中主要含有5 种花青素，即芍药花素-3，5-二葡糖苷（ peonidin-3,5-di-O-glucoside ， Pn3G5G ）; 矢车菊素-3 ， 5- 二葡糖苷（ cyanidin-3,5-di-O-glucoside ， Cy3G5G ）; 天竺葵素-3 ， 5- 二葡糖苷（ pelargonidin-3,5-di-O-glucoside ， Pg3G5G ）; 芍药花素-3- 葡糖苷（peonidin-3-O-glucoside，Pn3G）和矢车菊素-3-葡糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，Cy3G）。此外，3 种微量的花青素首次在芍药中发现：它们分别为芍药花素-3-葡萄糖-5-阿拉伯糖苷（peonidin-3-O-glucoside-5-O-arabinoside，Pn3G5Ara）、矢车菊素-3- 葡萄糖-5- 半乳糖苷（ cyanidin-3-O-glucoside-5-O-galactoside ，Cy3G5Gal）和天竺葵素-3-葡萄糖-5-半乳糖苷（pelargonidin-3-O-glucoside-5-Ogalactoside，Pg3G5Gal）。特征花青素Cy3G5Gal 和Pg3G5Gal 仅在新疆芍药（Paeonia anomala L.）及其亚种川赤芍（P. anomala subsp. veitchii(Lynch) D. Y.Hong & K. Y. Pan）中被检测出来，表明它们属于同一个种。Pn3G5Ara 仅存在于欧洲的野生芍药花瓣中，表明中国野生芍药和欧洲芍药的花青素代谢途径不同。 芍药花瓣中主要含有11 种花黄素，均为黄酮醇类物质。包括栎精-3，7 二葡糖苷（ quercetin-3,7-di-O-glucoside ）、山奈酚-3 ， 7 二葡糖苷（kaempferol-3,7-di-O-glucoside）、异鼠李素-3，7 二葡糖苷（isorhamnetin-3,7-di-Oglucoside）、栎精-3-O-(6”-没食子酰基)-葡糖苷 [quercetin-3-O-（6”-O-galloyl）-glucoside] 、栎精-3- 葡糖苷（ quercetin-3-O-glucoside ）、山奈酚-7- 葡糖苷（ kaempferol-7-O-glucoside ）、山奈酚-3-O- （ 6”- 没食子酰基） - 葡糖苷[kaempferol-3-O-（6”-O-galloyl)-glucoside]、异鼠李素-3-O-（6”-没食子酰基）-葡糖苷 [isorhamnetin-3-O- （ 6”-O-galloyl ） -glucoside] 、山奈酚-3- 葡糖苷（kaempferol-3-O-glucoside）、异鼠李素-3-葡糖苷（isorhamnetin-3-O-glucoside）和山奈酚-丙二酰葡糖苷（kaempferol-malonyl-glucoside）。此外，查耳酮在黄色的栽培品种‘黄金轮’和牡丹芍药组间杂交种‘伊藤杂种’中首次被检测到。其化学结构为查耳酮-2’-葡糖苷（chalcononaringenin 2’-O-glucoside），它是花瓣表现出黄色的主要色素，它与黄色牡丹野生种‘滇牡丹’（P. delavayi Franchet）花瓣中主要黄色色素成分一致。 通过对所有芍药野生种和栽培品种的色素分析，研究发现花青素是芍药花瓣中主要的色素，其中Pn3G5G 是花瓣中含量最高的花青素苷，其次为Cy3G5G。3G 型糖苷仅在少数品种中检测出来。此外，黄酮醇是芍药花瓣中重要的辅助色素。山奈酚苷是花瓣中含量最高的黄酮醇类，其次是栎精。 多元线性回归分析的结果表明，芍药花色的形成主要与花瓣中Pn3G5G、Cy3G5G 和Pg3G5G 的含量及总花青素量（TA）有关。根据8 种花青素结构与花色组成，将国内的野生种和大部分品种进行了化学分类：所有样本聚成3 大类，聚类后的树状图与其花色、花色素组成数据相一致，直观反映了野生种和栽培品种花色形成的化学背景和表型相似性程度。 芍药成色机理和化学分类的初步研究，对芍药新花色育种具有重要意义：芍药鲜红色花的育种中，育种亲本应具有高的Cy3G 含量、低的辅助色素效应指数。选育深紫色花或紫黑色花的品种，亲本应具有高的Pn3G5G 含量和低的Pg3G5G 含量。

西南地区社鼠的亚种分化兼二新亚种描记

系统整理了我国西南及其邻近地区的社鼠标本,主成分分析(PC)和判别分析(DA)的结果也表明上述两地的标本都各自形成一个有别于指名亚种的类群,故分别将上述两地的标本订为2新亚种:雅江亚种(N. c. yajianensis subsp.nov.)和德钦亚种(N.c.deqinensis subsp.nov.)。由此确立了西南地区原社鼠指名亚种至少应分为3个亚种。

藏酋猴的分类与分布

该文基于外部形态、毛色、头骨特征和地理分布对藏酋猴(Macaca thibetana)进行了分类整理, 认为藏酋猴在不同地理区域之间的差异已达到了亚种水平, 可分为４个亚种(包括两新亚种); M. thibetana thibetana, M. thibetana pullus, M.thibetana huangshanensis subsp.nov.和M. thibetana guizhouensis subsp. nov。