羽叶铁线莲杂交起源的初步研究

通过野外观察，发现羽叶铁线莲Clematis pinnata Maxim.在形态上相似于短尾铁线莲C. brevicaudata DC.及大叶铁线莲C. heracleifolia DC.，推测羽叶铁线莲为后二者杂交产生。本文从形态学、解剖学、孢粉学、分子生物学等方面寻找证据，为这一推测寻找证据： 1． 形态学 通过野外观察结合标本馆工作，对这三个种的外部形态性状及其变异进行全面的分析，以探讨羽叶铁线莲C. pinnata在形态上与二假定亲本的异同及其产生原因。发现花、叶、习性等性状，在二假定亲本种种内稳定，但种间差异很大，在羽叶铁线莲中，性状变异的幅度正是处于二假定亲本差异之间。 2．解剖学 在光学显微镜及扫描电镜下，观察了这三种铁线莲的叶表皮特征，结果表明：叶片上表皮均不具有气孔器，下表皮气孔器类型均为无规则型;表皮细胞多为不规则形，仅在短尾铁线莲C. brevicaudata的上表皮中为近多边形;上表皮角质膜均具细条纹，下表皮角质膜均具环状或放射状波状嵴。 在扫描电镜下对瘦果形态及宿存花柱进行观察，结果表明：瘦果均密被长柔毛，并有蜡质颗粒状附属物。 在三个种植物之间叶表皮和瘦果的特征均无明显差别，对解释所讨论的问题意义不大。 3．孢粉学 在扫描电镜下对这三种铁线莲的花粉粒进行观察，结果表明：短尾铁线莲的花粉粒具三沟;大叶铁线莲的杂性株中花粉高度败育，说明其杂性株其实即为雌株;羽叶铁线莲的花粉也高度败育，但本种均为两性株，支持本种为杂交种的推测。 4．等位酶研究 利用莽草酸脱氢酶SKD和苹果酸脱氢酶MDH对采自3个居群的羽叶铁线莲大叶铁线莲和短尾铁线莲进行等位酶试验，结果显示在短尾铁线莲与大叶铁线莲中分别出现种内一致的谱带，而羽叶铁线莲则显示出二者杂合的带型。这一结果有力的支持了羽叶铁线莲是由短尾铁线莲和大叶铁线莲杂交产生的推测。 5．居群遗传结构分析 利用随机扩增多态性DNA标记（RAPD）分别检测三个种的遗传多样性和居群遗传结构。15个随机引物对这三个种共160个个体 （短尾铁线莲C. brevicaudata 五个居群73个个体;大叶铁线莲Clematis heracleifolia五个居群75个个体;羽叶铁线莲Clematis pinnata三个居群12个个体。）进行分析，总共得到123个用于分析的条带。我们对这三个种扩增出的条带按照居群进行了聚类分析，结果表明这三个种在聚类树上能够很好的区分开，但是种内居群间没有表现出地理分布式样方面的信息;个体水平上聚类结果表明，百花山采到的7株无法确定的铁线莲幼苗有6株是短尾铁线莲C. brevicaudata另外一株是羽叶铁线莲Clematis pinnata，这说明在幼苗形态上二者差别不大;我们对这三个种分别进行了居群遗传结构的分析，结果表明：短尾铁线莲C. brevicaudata的多态条带比率为90.65％，遗传变异主要分布在居群内，居群间分化较小，而大叶铁线莲Clematis heracleifolia的多态条带比率为90.76％，居群间遗传变异占30.52％，居群间有明显分化。羽叶铁线莲Clematis pinnata的遗传多样性很低，有可能是由于营养繁殖造成的。 6．DNA序列分析 选取叶绿体基因组的trn L－F序列和核基因组的ITS序列进行了测序分析。发现从三个种十个个体得到的trn L－F序列之间几乎没有差异，在640 bp中只得到了3个信息位点。对ITS测序过程中发现短尾铁线莲可直接用PCR产物测序，而对大叶铁线莲和羽叶铁线莲必须进行克隆测序，由于时间关系，我们得到的序列不足以进行进一步分析。 基于以上研究结果，我们初步认为羽叶铁线莲是通过短尾铁线莲和大叶铁线莲的杂交而起源，并根据我们观察到的变异式样对羽叶铁线莲系的一些种类进行了分类学处理。

两类豆科植物：锦鸡儿和野大豆的分子生态学研究

野大豆和锦鸡儿，同属豆科植物。前者是一年生自交植物，后者是多年生异交植物;一个是大豆的种质资源，另一个是固沙植物;一个具有耐盐适应，另一个能够抗旱。本文首先结合同工酶分析结果，通过随机扩增多态性DNA（RAPD]标记研究了锦鸡儿和野大豆群体的分子生态学特征。然后用限制性内切酶消化了单态的野大豆群体扩增产物以提高RAPD标记检测野大豆DNA多态性的能力。并且根据锦鸡儿群体的RAPD谱估算了每位点上的等位基因频率，分别用Shannon信息指数和Nei指数估测了各群体的遗传变异。最后，在以上研究的基础上结合我们实验室有关锦鸡儿和野大豆的形态，种子蛋白或同工酶方面的分析得到以下结论： 1]在本文的实验条件下，RAPD标记的重复性很好，使有关锦鸡儿和野大豆群体分子生态学的研究结果有了可靠的基础。 2]RAPD标记的显性特征使实验中确定显、隐性等位基因频率困难较大。用估测的显、隐性等位基因频率通过Shannon信息指数估算群体遗传多样性可能更适合于异交植物。 3）用限制性内切酶消化随机扩增产物后，能够提高RAPD标记检测野大豆群体DNA多态性的能力。4]按RAPD多态位点比率排列毛乌素沙地锦鸡儿各群体为：硬粱群体<沙丘群体<硬粱覆沙群体<毛条群体<滩地覆沙群体<软梁覆沙群体。按遗传多样性排列各群体为：硬粱群体<硬梁覆沙群体<沙丘群体<软梁覆沙群体<毛条群体<滩地覆沙群体。反映了RAPD多态位点比率与遗传多样性在检测群体DNA多态性能力上的异同。 5]毛乌素沙地锦鸡儿群体间 存在着强大的基因流，其高度异交性与生态过渡带可能是一致的。 6]根据同工酶、种子蛋白的分析结果，硬粱覆沙群体的基因多样性在毛鸟素沙地锦鸡儿各群体中是最高的。然而，根据DNA多态性的研究结果，硬粱覆沙群体的基因多样性在各个群体中仅大于硬梁群体。反映了锦鸡尔表型分化与基因型分化的差异。7]就本文的研究结果来看，野大豆群体以其高水平的遗传多样性和发育变通性适应着多变的盐环境。8]无论从DNA多态位点比率还是群体的基因多样性来看，异交植物锦鸡儿群体都具有比自交植物野大豆群体较高的水平。除了盐适应的野大豆群体外，一般来讲，锦鸡儿群体间的基因流要明显地大干野大豆的群体间的基因流。

野大豆和栽培大豆抗盐分子标记的研究

野大豆群体3和群体4属盐渍群体，其个体有的是抗盐的，有的是敏感的，有的是中等抗盐的，本文通过随机扩增多态性DNA (RAPD)和DNA扩增指纹(DAF)分析野大豆群体抗盐性与分子标记之间的关系，从而更好地研究野大豆群体的盐适应机理。通过12个RAPD引物和3个DAF引物扩增发现：引物OPF05，OPF19和OPH02的扩增产物中有与抗盐性可能相关的特异标记，分别是OPF05_(213);OPF19_(4361);OPF19_(1727);OPF19_(1400);OPF19_(700);OPH02_(1350)。这些特异标记在所研究的抗盐植株中都存在;在敏感型植株中都不存在;在中等抗盐植株中有的存在，有的不存在。以上表明野大豆群体的抗盐性与RAPD分子标记有一定的相关性。为进一步研究抗盐性的特异标记，本文对栽培大豆抗盐品种Morgan和文丰七号的特异DAF标记片断8-27_(240) (Zhong et al., 1997)进行了克隆测序，测序结果通过BLASTn程序与基因库中的基因序列进行同源比较，发现上的DNA序列中的19组（每组大约二十到三十个碱基）序列与基因库中的其它基因相应序列有很高的同源性，几乎全部100%同源。尤其目的序列第15个碱基到第33个碱基（共19个碱基）之间的序列与基因库中的25个基因的相应序列的同源性全部是100%，并且与之相比的基因大多来自动物和人。因而推测其有可能是保守区，而不是编码区。进一步用DNASIS软件分析其碱基组成(A/T含量是64.9%，G/C含量是35.1%)并进行翻译，结果同样表明此序列可能是一调控序列并非编码区。至于这段序列是否与抗盐紧密相关，这有待于以后把此序列转到敏感型植株中然后检测其抗性来验证。 本文还通过RAPD分析野大豆群体3和群体4的多态性，发现群体3的多态性明显高于群体4。野大豆群体3的抗盐性大于群体4早已通过生理指标的鉴定，至于多态性与抗盐性之间是否有必然联系，还需进一步研究讨论。利用RAPD数据，通过MEGA软件中的NJ计算遗传距离的方法对群体3和4进行聚类分析，研究野大豆群体间及群体内个体间的亲缘及进化关系，探讨野大豆群体盐适应机理的分子起源。

体细胞无性系变异与烟草抗黑胫病细胞突变体的筛选

体细胞无性系变异是植物组织培养过程中发生的一种较为普遍的现象，这种现象在遗传学理论和育种实践上都很值得研究。应用这种变异进行筛选人们已经获得了一大批生产上有广泛意义的细胞突变体。但对于无性系变异发生的机理，人们虽然也进行了详细研究，提出了不少假说，但一直未能给出一个较为全面的解释。有些解释仍然建立在推测的基础上，有待进一步的研究。在这些解释中，利用转座子活化进行解释是最使人感兴趣的一种，也是较有说服力的一种。我们的实验分为两个部分，一是对无性系变异发生与转座子的关系进行了初步的探索,一是利用体细胞无性系变异筛选烟草黑胫病细胞突变体的应用进行了研究。 对转座因子的转活性进行分析，通常采用标记基因的表型检测。本实验用农杆菌双元载体pSLJ721（Ac∷GUS）转化烟草（品种：红花大金元）， 然后对转基因烟草的愈伤组织进行GUS酶活性的组织化学分析。通过GUS活性变化来分析转座活性。结果表明组织培养可以增强转座子的活性。间接证明转座子活化是体细胞无性系变异的原因之. 本论文实验方面的另一部分是体细胞无性系变异在烟草抗黑茎病研究上的应用。烟草黑茎病是由烟草致病疫霉引起的一种烟草主要病害。首先从云南地区黑胫病病区分离、纯化黑胫病（Phytophythora parasitica via. Nicotina）病原菌，同时利用红花大金元为实验对象，以组织培养中自然发生的元性系变异为基础，以50％以及80％的黑胫病病菌粗毒素为选择压力，筛选出抗黑胫病毒素的烟草株系，用离体叶片法和茎部接种法进一步鉴定其对黑胫病病菌的抗性。最后进行田间检测以期获得综合性状优良的抗黑胫病细胞突变体。另外我们还利用随机引物扩增多态DNA（RAPD）分析技术，对选择到的九个抗病株系和六株对照的DNA进行分析。在使用的70种随机引物中，共有57个引物产生可检测扩增产物，产生306条搁增带，其中有多态性的条带数为51条，突变体的平均RAPD条带变异率为1.85％，其中有两个RAPD条带（CYA－17－100和Sangon03-350）为突变体所特有，可初步判断为抗黑胫病的RAPD标记。对突变体和对照植株叶片水溶性蛋白SDS电泳观察到一些条带的变异，但没有找到突变体特异的共同条带。

水稻颖花开裂突变体的鉴定及颖花开裂基因srs-1的定位

　　水稻(Oryza sativa L.) 颖花开裂 (split rice spikelet，SRS) 突变体是从水稻品系 8902s 花药培养得到的双单倍体群体中筛选出的同源异型突变体。以窄叶青8号为母本，SRS突变体为父本配制杂交组合，其F2群体中正常植株和突变植株的分离比例符合3:1，说明颖花突变性状是由单隐性基因决定的。 利用扫描电镜观察 SRS突变体花器官形态发生过程。其性状表现为内外稃变软变长，不抱合，在外稃基部又着生一朵花，两浆片基部融合，质地呈稃片状，雄蕊和雌蕊形态正常，且可育。该突变体的突变性状与拟南芥APETALA1的突变表现相似，说明两者在形态建成方面具有相似之处。由于 SRS 突变体第一轮和第二轮花器官发生了变化，根据 ABC 模型，srs-l基因应属于同源异型 A 组基因。 采用BSA法在F2群体中建立DNA正常池和突变池，利用RAPD技术筛选与突变基因srs-l连锁的分子标记。从520条随机引物中筛选出了引物S465能在两池间扩增出分子量为900 bp的差异片段，并证明其在F2群体中表现共分离。将此DNA片段克隆后作为RFLP探针pS465A，该探针与srs-l基因紧密连锁，在DH群体的RFLP分子连锁图谱上成功地将它们定位于第三染色体上。 本研究是利用水稻同源异型突变体为材料，研究水稻花器官发育基因的首例报道。

滇西北地区冬虫夏草和阔孢虫草的遗传分化研究

应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对来自云南西北部高黎贡山和丽江玉龙雪山的6个冬虫夏草Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.,来自德钦地区三个地方的8个阔孢虫草C. crassispora Zang,Yang et Li以及来自云南昆明的一个蛹虫草C. militaris (Vuill) Fr.进行分析。18个随机引物获得的RAPD谱带清晰并呈现多态。遗传距离分析表明,冬虫夏草/阔孢虫草与蛹虫草之间存在显著的遗传差异。

Identification of Sarcocystis hominis-like (Protozoa : Sarcocystidae) cyst in water buffalo (Bubalus bubalis) based on 18S rRNA gene sequences

DNA templates were extracted from isolates of Sarcocystis hominis-like cysts collected from cattle and water buffalo, as well as from Sarcocystis fusiformis cysts and Sarcocystis suihominis cysts. The 18S rRNA genes were amplified using DNA from a single

东湖天蓝喇叭虫(Stentor coeruleus)种群的离散分化

利用筛选的12条10 bp的随机引物对采自武汉市东湖(3个样点)、南湖(3个样点)、月湖(1个样点)和关桥(1个样点)四个水体的天蓝喇叭虫(Stentor coeruleus)种群进行了随机扩增多态DNA(RAPD)研究,所得清晰条带显示不同样点样本之间存在着一定的变异,其遗传距离在0．076-0．416之间．用Rapdistance 1．04构建聚类图并探讨不同样点之间的遗传距离远近．结果显示南湖的3样点的遗传距离较近,在聚类图上聚成一枝,应该为同一个种群;而东湖的3个样点可能是由于地理隔离原因,在聚类

快速建立鲢、鳙纯系的初步研究

运用随机扩增多态性DNA(RAPD)方法对雌核发育和人工转性鲢、鳙进行了遗传多样性的研究,并用长江天然鲢、鳙群体作为对照分析.在雌核发育鲢中,共得到187条带,其中19条为多态带,占10.16％,而对照组鲢共扩增205条带,有32个多态座位,占总带数的15.61％.在雌核发育鳙中共产生232条带,其中11条为多态带,比例为4.74％,而在对照组中共产生241条带,25条为多态带,比例为10.37％.遗传距离分析表明,雌核发育鲢和鳙的平均值分别为0.102和0.023.而对照组鲢和鳙遗传距离平均值分别为0.

First description of a novel Weissella species as an opportunistic pathogen for rainbow trout Oncorhynchus mykiss (Walbaum) in China

Six strains of Gram-positive, catalase-negative, non-motile, irregular short rod-shaped Weissella bacteria, with width and length of 0.5-0.6 and 1.2-2.7 mu m were isolated from diseased rainbow trout Oncorhynchus mykiss (Walbaum) in winter of 2007 at a commercial fishery in Jingmen, Hubei province, China. The diseased rainbow trout exhibited hemorrhage in eyes, anal region, intestine and abdomen wall, petechia of liver, some fish with hydrocele in stomach. Six isolates had identical biochemical reactions, phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences, amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA), enzymatic profile analysis and antimicrobial susceptibility results, indicating as a single clonal outbreak. But all were different from any other validated twelve Weissella species in the term of physiological and biochemical characters. It is indicated that isolates are phylogenetically closer to Weissella halotolerans, Weissella viridescens and Weissella minor on 16S rDNA phylogenetic analysis result, than to W halotolerans and W viridescens on the result of ARDRA study and enzymatic profile analysis. Antimicrobial susceptibility testing was used to scan effective drugs for the therapy of this disease. Experimental infection assays with one isolate were conducted and pathogenicity (by intraperitoneal injection) was demonstrated in rainbow trout O. mykiss (Walbaum) and crucian carp (Carassius auratus gibelio) fingerlings. Because no Weissella was detected in fish feedstuffs and pond water, the source of this pathogen remains unknown, and Weissella isolates were regarded as an opportunistic pathogen for rainbow trout. This is the first report of Weissella strains which can cause disease of cultured fish in the world. (C) 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.

Aspergillusterricola角蛋白酶高产菌株选育及酶学性质研究

根据非对称原生质体融合原理，建立了非营养缺陷型原生质体融合模型，丰富了原生质体育种方法.利用此模型进行栖土曲霉（Aspergillusterricola）不同菌株的种内融合，选育出高活性角蛋白酶生产菌.通过生长速度、分生孢子体积、孢子DNA含量的测定，并利用RAPD-PCRDNA指纹分析技术，确定其为杂合二倍体.连续传接12代后，菌株产酶性能稳定.发酵试验表明，其产角蛋白酶活性达到2840Ug<'-1>，分别比双亲的产酶能力提高了42%和30%.构建了栖土曲霉染色体基因组文库，并从文库中筛选出角蛋白酶生物合成基因的阳性克隆，为进一步在分子水平上深入研究角蛋白酶奠定了基础.

重离子辐照普通小麦间接效应的研究

应用不同能量、不同剂量的碳离子和氧离子加照普通小麦，研究其M1代和M2代的生物学（形态）性状、染色体畸变率及微核率、生理生化和DNA分子等方面的变化。并对这些变化的生物学机理进行了探讨，结果如下：1.75MeV/u~(16)O~(8+)离子经过适当降能后注入小麦种子的不同部位和贯穿整个种子，对其M1代幼苗的可溶性蛋白质组分以及电脉中不同区段蛋白质组分相对含量加以分析，结果表明：1）同对照相比，随着辐照剂量的增加，所有辐照材料（包括贯穿和注入）第二区段（分子量较高区段）蛋白质组分的相对含量下降；而第五区段（分子量最小区段）蛋白质组分的相对含量升高。2）种子的贯穿处理，同时也引起第一区段（分子量最高区段）和第三区段蛋白质组分相对含量的下降以及第四区段的升高；其中第三、四区段的变化明显区别于注入效应。3）注入胚和胚乳的区别在于后者第一区段蛋白质组分相对含量的较大下降和第五区段的较大提高。4）小剂量辐照的材料，可溶性蛋白质组分的变化异常，可能与低剂量辐射兴奋效应有关。2.碳离子注入胚乳引起胚的后代发生变异，是典型的重离子诱变产生间接效应的结果。主要表现为：1）M1代的生物学性状、幼苗的抗氧化酶活性、MDA含量、蛋白质含量和染色体畸变率及微核率等发生了较大的变化。2）对其矮杆变异株和紫色茎杆突变体（M2）和RAPD和AFLP分子鉴定等研究，结果显示了矮杆变异体和紫色茎杆突变体的DNA序列发生了改变，而非仅仅产生生理损伤；同一种变异体或突变体，在M2代单株间也存在着明显的差异，表明它们可能还处于分离状态。于是，将M2代以上高代再种，以观察遗传能否稳定。3.重离子辐照普通小麦种子的M1代正常（它们可以完成生长发育的过程）植株同对照材料做正、反交，获得染色体组等来源不同的材料。接着对对照、M2代和正、反交材料DNA进行RAPD和AFLP多态性研究，并将实验结果作统计分析，结果表明：在细胞结构层次上，染色体组作为靶物质，产生的直接效应主要引起随机突变；而非染色体组的细胞组成的间接效应主要引起非随机突变。

非营养缺陷型原生质体融合选育角蛋白酶生产菌

以两性霉素B抗性作为标记 ,通过单株灭活 ,进行栖土曲霉种内非营养缺陷型原生质体融合 .在 40 %的PEG(Mr=6 0 0 0 )促融下 ,融合频率为 1.6 2× 10 -5.连续传接 10代后 ,获得稳定的融合子 .对孢子体积、核DNA含量、生长速度进行了测定 ,并利用RAPD技术分析比较了亲本及融合子的基因组DNA指纹多态性 ,证明融合子为杂合二倍体 ,产角蛋白酶活力较亲本显著提高 .图 3表 4参 17

云南尼泊尔桤木遗传多样性研究

分别在云南省来凤山、高黎贡山、鸡足山、苍山和无量山,采集58个尼泊尔桤木Alnus nepalensis叶样品,提取总DNA,对它们进行RAPD-PCR分析。3个随机引物共扫描到DNA位点85个,其中多态性位点64个,样品内的多态性为75.30%;用非加权组法(UPGMA)聚类分析,建立尼泊尔桤木分子聚类树状图,以相似系数0.68为标准分为6类;用POPGENE软件分析Nei’s遗传多样性指数和Shannon遗传多样性指数。结果表明:云南尼泊尔桤木遗传多样性丰富,其中,鸡足山尼泊尔桤木居群多样性指数最高,无量山居群中,分布在南坡的尼泊尔桤木多样性指数高于分布于北坡的样品。尼泊尔桤木的分布及遗传结构与环境区域有密切的关系,区域特点是决定尼泊尔桤木遗传多样性水平的重要因子之一。该结果对于研究尼泊尔桤木遗传多样性以及它与共生固氮弗兰克氏菌Frankia的协同进化有一定的利用价值。