Rôle de l'autophagie dans la dissémination du VIH-1 par les cellules dendritiques dérivées des monocytes circulants

Les cellules myéloïdes incluant les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (DCs, dendritic cells) contribuent à la pathogénèse de l’infection à VIH-1 en participant à la dissémination du virus, mais également en représentant des réservoirs viraux potentiels. Leurs fonctions sont exploitées par le VIH-1 afin d’assurer sa propagation à travers l’organisme. Notamment, une infection à VIH-1 est associée à une altération de la présentation antigénique et la perte de lymphocytes T CD4+ spécifiques à des antigènes. L’autophagie est un processus catabolique universel impliqué dans la régulation de la présentation antigénique subséquente à la neutralisation/destruction du pathogène. Des études récentes suggèrent que le VIH-1 altère le mécanisme d’autophagie afin d’assurer sa survie. Le premier volet de ce projet de maîtrise a visé la caractérisation des effets du VIH-1 sur l’autophagie dans les DCs dérivées de monocytes circulants (MDDC, monocyte-derived dendritic cells) et l’identification des stratégies thérapeutiques pour contrecarrer ces effets. Les objectifs spécifiques ont été de : (i) caractériser l’expression de marqueurs de maturation sur des MDDC exposées au VIH-1 in vitro, (ii) quantifier l’expression des protéines liées à la régulation positive (i.e., ATG5, LC3, p62) et négative (i.e., mTOR) de l’autophagie dans les MDDC exposées au VIH, (iii) déterminer le rôle de l’autophagie dans la trans infection du VIH-1 aux lymphocytes T CD4+ et (iv) explorer l’impact de l’autophagie sur la présentation antigénique par les MDDC infectées à VIH-1 in vitro. Nos résultats démontrent qu’une exposition des MDDC au VIH-1 in vitro altère dramatiquement leur maturation et leur habileté à induire la prolifération des cellules T autologues en réponse à Staphylococcus aureus et Cytomegalovirus (CMV) mais pas la réponse induite par Staphylococcal enterotoxin B (SEB). Nous démontrons que l’exposition des MDDC au VIH s’associe à une augmentation de l’expression de la protéine mTOR totale et de sa forme phosphorylée (phospho-mTOR) et de la protéine p62. Le traitement des MDDC à la rapamycine diminue l’expression de mTOR et réduit la capacité de trans infection du VIH-1 par les MDDC, sans toutefois restaurer leur potentiel immunogène. En effet, nous observons que la rapamycine réduit l’expression de CD83 par les MDDC et augmente l’expression de CCR7, indiquant ainsi que l’effet immunosuppresseur documenté de la rapamycine est associé à une défaillance de maturation des MDDC. Le second volet de ce projet de recherche s’est intéressé à la contribution des cellules myéloïdes à la persistance virale chez les sujets infectés par le VIH-1 sous thérapie antirétrovirale. Les objectifs spécifiques ont été : (i) d’évaluer la présence de différentes formes d’ADN viral dans les monocytes circulants de patients infectés par le VIH-1 et (ii) de mesurer l’intégration et la réplication virale dans des macrophages dérivés de monocytes (MDM) de patients infectés sous ART. Nos résultats indiquent que les monocytes portent des formes précoces de transcription virale inverse (ADN du VIH RU5) et que, malgré une charge virale plasmatique indétectable sous ART, les MDM supportent la réplication virale. Ces données très préliminaires apportent des évidences en faveur de la contribution des cellules myéloïdes à la persistance virale sous ART et représentent une ouverture pour un projet de recherche plus complexe dans le futur. En somme, nos résultats démontrent que le VIH-1 altère le potentiel immunogène des MDDC et que la rapamycine peut être employée pour limiter la trans infection des lymphocytes T CD4+ par les MDDC. Néanmoins, l’incapacité de la rapamycine à rétablir le potentiel immunogène des MDDC incite à identifier de nouvelles stratégies manipulant l’autophagie pour une restauration optimale de la compétence immunitaire chez les sujets infectés à VIH-1. Les cellules myéloïdes jouent un rôle primordial dans la dissémination et la persistance virale et doivent donc être ciblées par les stratégies actuelles d’éradication des réservoirs du VIH sous ART.

Distribution, Extracellular Virulence Factors and Drug Resistance of Motile Aeromonads in Fresh Water Ornamental Fishes and Associated Carriage Water

During last decades there has been a continuous growth of aquaculture industries all over the world and taking into consideration the spurt in freshwater ornamental fish aquaculture and trade in Kerala, the present study was aimed to assess the prevalence of various motile Aeromonas spp. in fresh water ornamental fishes and associated carriage water. The extracellular virulence factors and the antibiogram of the isolates were also elucidated. Various species of motile aeromonads such as Aeromonas caviae, A. hydrophila, A. jandaei, A. schubertii, A. sobria, A. trota and A. veronii were detected. Aeromonas sobria predominated both fish and water samples. Extracellular enzymes and toxins produced by motile aeromonds are important elements of bacterial virulence. The production of extracellular virulence factors - proteases, lipase, DNase and haemolysin by the isolates were studied. All the isolates from both fish and water samples produced gelatinase and nuclease but the ability to produce lipase, caseinase and haemolysins was found to vary among isolates from different sources. Among the 15 antibiotics to which the isolates were tested, all the isolates were found to be sensitive to chloramphenicol, ciprofloxacin and gentamicin and resistant to amoxycillin. Local aquarists maintain the fish in crowded stressful conditions, which could trigger infections by the obligate/ opportunistic pathogenic members among motile aeromonads

Vergleichende Untersuchungen Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus des Klinikums Kassel der Jahre 1999 bis 2004

Die vorliegende Arbeit liefert erstmals einen umfassenden Überblick über die molekulare Epidemiologie von Methicillin resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) eines nordhessischen Krankenhauses inklusive seines Umfeldes und deren Entwicklung in einem Zeitraum von fünf Jahren. Von besonderer Bedeutung ist, dass die MRSA-Stämme hierfür nicht nur anhand ihrer SCCmec-Region (staphylococcal cassette chromosome) typisiert wurden, sondern eine weitergehende Charakterisierung auf Grund der Bestimmung des Vorkommens von Antibiotikaresistenz- und Toxingenen, sowie Plasmiden erfolgte. Dabei wurde ein neuer SCCmec-Typ entdeckt und charakterisiert und weitere noch unbekannte SCCmec-Elemente beschrieben. Bei der Charakterisierung der MRSA-Kollektive konnten bzgl. aller untersuchten Eigenschaften im Laufe der Zeit signifikante Veränderungen beobachtet werden. Am deutlichsten waren diese Unterschiede zwischen dem ältesten Kollektiv aus 1999 und allen nachfolgenden Kollektiven. Die Kollektive aus 2001, 2002, 2003 und 2004 zeigten untereinander größere Ähnlichkeiten, aber dennoch gleichzeitig eine tendenziell divergente Entwicklung einzelner Eigenschaften. Besonders auffallend war das dominante Auftreten von SCCmecIV mit 63-87% der Isolate eines Kollektivs ab 2001, gegenüber 16% in 1999. Weiterhin erfolgte eine markante Veränderung im Vorkommen einzelner Antibiotikaresistenzgene von 1999 bis 2004. So waren aacA-aphD und ermA bei MRSA aus 1999 mit 84% bzw. 90% deutlich häufiger als in allen Kollektiven der folgenden Jahre (aacA-aphD: max. 32%, ermA: max. 40%). Wohingegen ermC ein stets zunehmendes Vorkommen von 3% auf 67% über den Untersuchungszeitraum zeigte. Unkontinuierliches aber statistisch relevant vermehrtes Auftreten von tetM konnte bei Isolaten aus 1999 (40%) und 2004 (74%) nachgewiesen werden. Auch bei Toxingenen zeigten sich deutliche Unterschiede in der zeitlichen Verteilung. Ab 2001 zeigten alle Isolate wesentlich höhere Anteile an sec, seg und sei verglichen mit den MRSA aus 1999. So konnte sec im Kollektiv aus 1999 gar nicht nachgewiesen werden, in denen der Folgejahre mit 54-77%. Die Werte für seg und sei stiegen von 48% bzw. 41% in 1999 kontinuierlich auf über 90% in 2004. Die Häufigkeit von MRSA sowohl mit mehreren Resistenzgenen als auch die mit mehreren Toxingenen nahm im Laufe der Zeit zu und korrelierte mit dem Vorkommen von Plasmiden. Bezüglich seiner Korrelation mit den vorkommenden Plasmiden zeigte SCCmecIV im Erhebungszeitraum besonders deutlich eine Veränderung. So nahm über den Zeitraum der Beobachtung die Anzahl der Stämme die zusätzlich zu einem großen Plasmid ein weiteres kleines Plasmid besaßen signifikant zu. Auch beim Vergleich der SCCmec-Typen der MRSA-Isolate konnten Unterschiede bzgl. aller weiteren untersuchten Eigenschaften dargestellt werden. So zeigten z.B. alle SCCmecIIIA das sea-Gen, während dies bei allen anderen in der vorliegenden Arbeit untersuchten SCCmec-Typen nur vereinzelt vorkam. SCCmecII-Stämme wiesen sowohl die meisten Antibiotikaresistenz- als auch Toxingene auf. Es wurde ferner gezeigt, dass Stämme mit vielen Resistenzgenen auch eine hohe Anzahl Toxingene besaßen und dies im Zusammenhang mit einem erhöhten Plasmidgehalt stehen könnte. Aus den MRSA-Kollektiven isolierte Plasmide konnten aufgrund von Restriktionsanalysen als verwandt zu β-Laktamase-Plasmiden des Grundtyps pI524 und pI258 beschrieben werden. Der in vorliegender Arbeit gezeigte Zusammenhang zwischen der Anzahl von direct repeat units (dru) in der Hypervariablen Region (HVR) und dem SCCmec-Typ half den Unterschied zwischen SCCmecIV und SCCmecIVA, sowie die Sonderstellung des in vorliegender Arbeit erstmalig beschriebenen SCCmecIA/II darzustellen. Nicht alle Isolate konnten einem bekannten SCCmec-Typ zugeordnet werden, es handelt sich bei diesen Ausnahmen um weitere noch unbekannte und hier erstmalig beschriebene SCCmec-Typen. Aufgrund der vorliegenden Arbeit konnte ein neuer SCCmec-Typ definiert werden, namentlich der Typ SCCmecIA/II, der seit 1999 in der Region gehäuft vorkommt Die vorliegenden Untersuchungen zeigten somit, dass die Epidemiologie von MRSA der Region Nordhessen trotz bestehender Gemeinsamkeiten zur MRSA-Situation in ganz Deutschland auch Besonderheiten aufweist. Diese nun zu kennen kann einen Beitrag zur gezielten Verbesserung bisheriger Maßnahmen zur Ausbreitungskontrolle von MRSA in der nordhessischen Region leisten.

Bacteriemia asociada a catéter epicutáneo en la unidad de cuidado intensivo neonatal de la Fundación Cardioinfantil

La bacteriemia asociada a catéter afecta a pacientes en las unidades de cuidado intensivo con una alta morbilidad, mortalidad y aumento de los costos al sistema de salud. Los recién nacidos son la población de más alto riesgo por el mayor uso de catéteres centrales. Objetivo: Caracterizar factores de riesgo para bacteriemia asociada a catéter en la Unidad de Cuidado Intensivo Neonatal de la Fundación Cardioinfantil entre 2005 - 2010 Materiales y método: Estudio descriptivo de corte transversal, incluyó todos los recién nacidos con diagnostico de bacteriemia asociada a catéter. Se analizó la información utilizando frecuencias y medidas de tendencia central. Resultados: Se encontraron 50 pacientes con diagnostico de bacteriemia asociada a catéter. 50% de género masculino, 52% con edad gestacional al nacimiento menor a 36 semanas y 24% con peso menor a 1500 gramos al momento de la inserción del catéter. La edad fue de 24.2 días al momento de la inserción del catéter. En el 66% de los pacientes el sitio de inserción fue el miembro superior, siendo el Sthaphylococcus Epidermidis el germen con el 50% de las bacteriemias. Conclusión: La bacteriemia asociada a catéter afecta paciente prematuros, de bajo peso sin diferencias en genero. La manipulación de dichos dispositivos, el sitio de inserción, el uso previo de antibióticos, la duración del catéter y el uso de nutrición parenteral son factores que están asociados al mayor riesgo de infección. Siendo el Staphylococcus Epidermidis el germen mas frecuente.

Factores asociados con infección por catéter central en UCI Clínica San Pedro Claver de junio a diciembre de 2004.

La infección asociada a inserción de catéter vascular, es un problema cotidiano en las UCI a nivel mundial, a pesar del manejo de protocolos que se han implementado de manera independiente en las distintas instituciones para frenar este fenómeno. El estudio, de tipo observacional, analítico y cohorte concurrente, con 151 pacientes, a los cuales se insertó catéter en la UCI de la Clínica San Pedro Claver.Para el análisis se realizó estadística descriptiva, análisis de sobrevida, pruebas de asociación y regresión de Cox.

Mediastinitis post revascularización miocárdica: impacto del cambio de profilaxis antibiótica en la fundación Cardioinfantil 2012 - 2013

INTRODUCCIÓN. La mediastinitis posterior a cirugía de revascularización miocárdica es una infección infrecuente, pero potencialmente fatal. En la Fundación Cardioinfantil se ha observado una tendencia al incremento de la misma en los últimos años, obligando a un cambio en las medidas de profilaxis antimicrobiana, pasando de cefalosporinas a vancomicina – gentamicina, sin embargo no se conoce aún el impacto de estas medidas. OBJETIVO: Determinar si el cambio de la profilaxis antibiótica en pacientes sometidos a revascularización miocárdica influye en una disminución de la incidencia de mediastinitis durante los años 2012 – 2013. METODOLOGÍA: Estudio de cohortes retrospectivo, evaluando la incidencia de mediastinitis post revascularización miocárdica, en pacientes expuestos a 2 diferentes tipos de profilaxis antimicrobiana (cefalosporinas vs vancomicina-gentamicina). Se describieron los patrones de susceptibilidad y resistencia de los patógenos encontrados en mediastinitis y la mortalidad de esta patología. RESULTADOS: Los patógenos más frecuentemente aislados en la mediastinitis fueron Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae, en la mayoría monomicrobiano. Se encontraron patógenos con perfiles de resistencia como betalactamasas de espectro extendido en Gram negativos y resistencia a la meticilina en cocos Gram positivos. El RR de mediastinitis del grupo expuesto a vancomicina-gentamicina respecto al grupo de cefalosporinas fue de 0,9 con IC 95% 0,28 – 3,28. CONCLUSIÓN: la epidemiologia microbiana de la mediastinitis no difiere de la reportada en otras series. La profilaxis antimicrobiana con vancomicina - gentamicina en pacientes sometidos a revascularización miocárdica, no redujo la incidencia de mediastinitis. Se propone regresar a la terapia de profilaxis con cefalosporinas.

Caracterització i revaloració de la fracció plasmàtica de la sang de porc procedent d'escorxadors industrials

La tesi s'ha estructurat en tres apartats que, en conjunt, han de permetre determinar les possibilitats d'aprofitament dins la mateixa indústria alimentària de la fracció plasmàtica de la sang de porc generada per escorxadors que utilitzen sistemes oberts de recollida higiènica. 1. En la primera part s'analitza la composició de la sang higiènica que s'està recollint actualment i s'estudien les característiques tant físico-químiques com microbiològiques que determinen la seva qualitat. La caracterització s'ha realitzat amb sang recollida en diferents escorxadors industrials de les comarques de Girona i s'ha centrat principalment en l'estudi de la contaminació microbiològica i el nivell d'hemòlisi de la sang. S'ha fet un disseny experimental que ha permès alhora valorar l'efecte d'alguns factors sobre la qualitat de la sang: possibles diferències relacionades amb (1) la climatologia del període de l'any en el qual es fa la recollida, (2) particularitats dels escorxadors (grandària, sistemes de dessagnat, tipus, dosi i sistema de dosificació de l'anticoagulant, condicions de processament, maneig i emmagatzematge després de la recollida, etc.). Els resultats obtinguts ens permeten constatar que, en les condicions actuals, la sang que s'està recollint en els escorxadors estudiats no es pot considerar adequada per a una matèria primera de productes destinats a alimentació humana. La major part de la microbiota contaminant s'adquireix en el propi sagnador. S'ha constatat que el sistema de dessagnat en posició horitzontal podria ser una mesura útil per minimitzar la contaminació d'origen fecal o provinent de la pell de l'animal sacrificat i que la separació immediata de les fraccions en el propi escorxador també pot contribuir a reduir la contaminació. Així doncs, en el benentès que l'efectivitat pot obtenir-se del conjunt de mesures preses, més que de l'aplicació d'una sola d'elles, es suggereix la introducció d'una sèrie d'actuacions que potser permetrien reduir els nivells de contaminació que s'obtenen actualment. El tractament mecànic de la sang, el sistema d'addició d'anticoagulant, el volum i concentració de la solució anticoagulant afegida i el període d'emmagatzematge són els factors responsables de l'hemòlisi; mentre que nivells elevats de contaminació microbiològica i el tipus d'anticoagulant utilitzat deterrminen la velocitat d'increment de l'hemòlisi de sang refrigerada. S'ha constatat que quan la sang no pot ser processada immediatament i s'ha d'emmagatzemar en refrigeració és millor utilitzar citrat sòdic enlloc de polifosfat com a anticoagulant ja que l'increment d'hemòlisi es dóna més lentament. 2. El segon apartat s'ha centrat en la fracció plasmàtica de la sang. S'ha utilitzat la deshidratació per atomització com a tecnologia de conservació del plasma i s'ha fet una caracterització del producte en pols resultant des del punt de vista de composició i qualitat. A més de la contaminació microbiològica, que determina la qualitat higiènico-sanitària del producte, s'ha realitzat un estudi de les propietats funcionals que podrien fer del plasma un producte útil en la formulació d'aliments (capacitat escumant, emulsionant, gelificant). S'ha fet especial incidència en (1) determinar l'efecte del procés tecnològic de deshidratació sobre la funcionalitat del producte i (2) estudiar l'estabilitat del plasma deshidratat durant el període d'emmagatzematge. En les condicions de deshidratació per atomització aplicades no es provoca desnaturalització de la fracció proteica i s'obté un producte suficientment deshidratat, amb una aw<0,4 per permetre suposar una bona estabilitat. Algunes mostres de plasma deshidratat analitzades presenten nivells detectables de determinats residus (sulfonamides i corticosteroides). La qualitat microbiològica del producte en pols reflecteix l'elevada contaminació que contenia la matèria primera utilitzada, tot i que la deshidratació per atomització ha comportat la reducció en una unitat logarítmica de la càrrega contaminant. Els recomptes generals de microorganismes són encara preocupants i més tenint en compte que s'ha evidenciat la presència de toxines estafilocòciques en algunes mostres. L'avaluació de les propietats funcionals del producte deshidratat en relació a les que presentava el plasma líquid ens ha permès comprovar que: (1) El procés de deshidratació no ha afectat la solubilitat de les proteïnes. Això, junt amb el fet que no s'obtinguin diferències significatives en l'anàlisi calorimètrica de mostres líquides o deshidratades, permet concloure que el procés no provoca desnaturalització proteica. (2) No s'observen efectes negatius del procés tecnològic sobre la capacitat escumant ni en l'activitat emulsionant de les proteïnes plasmàtiques, dues propietats funcionals que possibiliten l'aplicació del plasma amb aquestes finalitats en l'elaboració d'alguns aliments. (3) La deshidratació tampoc perjudica de manera important les característiques dels gels que s'obtenen per escalfament, ja que els gels obtinguts a partir del plasma líquid i del plasma deshidratat presenten la mateixa capacitat de retenció d'aigua i no s'observen diferències en la microestructura de la xarxa proteica d'ambdós tipus de gel. Tanmateix, els que s'obtenen a partir del producte en pols mostren una menor resistència a la penetració. L'estudi d'estabilitat ens ha permès comprovar que la mostra de plasma deshidratat per atomització perd algunes de les seves propietats funcionals (facilitat de rehidratació, capacitat de retenció d'aigua i fermesa dels gels) si s'emmagatzema a temperatura ambient, mentre que aquestes característiques es mantenen un mínim de sis mesos quan el producte en pols es conserva a temperatura de refrigeració. 3. En l'última part, tenint en compte les conclusions derivades dels resultats dels apartats anteriors, s'han assajat tres possibles sistemes de reducció de la contaminació aplicables a la fracció plasmàtica com a pas previ a la deshidratació, per tal de millorar les característiques de qualitat microbiològica i les perspectives d'estabilitat del producte durant l'emmagatzematge. S'ha determinat l'eficàcia, i l'efecte sobre les propietats del plasma deshidratat, que poden tenir tractaments d'higienització basats en la centrifugació, la microfiltració tangencial i l'aplicació d'altes pressions. Els tractaments de bactofugació aplicats permeten reduir entre el 96 i el 98% la contaminació microbiana del plasma. Aquesta reducció s'aconsegueix tant amb un sistema discontinu com amb un sistema continu treballant a una velocitat de 12 L/h, fet que permetria adaptar el tractament de bactofugació a un procés de producció industrial. Un sistema combinat de bactofugació en continu i microfiltració tangencial permet incrementar l'eficàcia fins a un 99,9 % de reducció. Cal tenir present, però, que aquest tractament provoca també una disminució de l'extracte sec que afecta negativament les propietats funcionals del plasma líquid. Malgrat suposar una pèrdua pel que fa al rendiment, aquest efecte negatiu sobre la funcionalitat no suposaria cap inconvenient si s'utilitzés la deshidratació com a tecnologia de conservació del plasma, ja que es podria corregir l'extracte sec durant la reconstitució del producte. Caldria avaluar si la millora en la qualitat higiènico-sanitària del producte compensa o no les pèrdues que suposa aquest sistema d'higienització combinat. Amb relació als tractaments d'alta pressió, de totes les condicions de tractament assajades, les pressions de fins 450 MPa permeten obtenir plasma sense modificacions importants que impedeixin la seva deshidratació per atomització. Així doncs, les condicions de procés que s'han aplicat són pressuritzacions a 450 MPa de 15 minuts de durada. La temperatura de tractament que s'ha mostrat més eficaç en la reducció dels recomptes de microorganismes ha estat de 40ºC. Els tractaments a aquesta temperatura permeten assolir reduccions del 99,97% i disminuir en un 80% la capacitat de creixement dels microorganismes supervivents a la pressurització en relació a la que presentava la població contaminant del plasma abans del tractament. L'estudi de l'efecte d'aquest tractament (450 MPa, 15 min i 40ºC) sobre les propietats funcionals del plasma ha permès observar que la pressurització comporta una disminució en la solubilitat del producte però una millora en les propietats de superfície -estabilitat de l'escuma i activitat emulsionant- i un increment de la capacitat de retenció d'aigua i de la duresa dels gels obtinguts per escalfament. Calen més estudis per confirmar i caracteritzar aquesta millora en la funcionalitat, així com per establir si el tractament de pressurització afecta també l'estabilitat del producte durant l'emmagatzematge. De totes les tecnologies d'higienització assajades, l'alta pressió és la que permet obtenir millors resultats en el sentit de poder garantir un producte de bona qualitat microbiològica i segur, des del punt de vista sanitari i tecnològic, per a la seva utilització com a ingredient alimentari.

Estudio de las comunidades microbianas de embutidos fermentados ligeramente acidificados mediante técnicas moleculares. Estandarización, seguridad y mejora tecnológica.

Los embutidos fermentados ligeramente acidificados son un grupo de productos tradicionales mediterráneos, caracterizados por un pH superior a 5,3. Para un control eficiente de la seguridad microbiológica de los embutidos se necesitan técnicas rápidas para la identificación y recuento de los microorganismos patógenos a estudiar. En el presente trabajo, se desarrolló una técnica para la enumeración de L. monocytogenes que combinó el método del número más probable y la identificación mediante PCR específica. Para la detección de Salmonella spp. y L. monocytogenes se desarrolló un sistema de PCR-multiplex que permitió la identificación de ambos patógenos de forma simultánea en una sola reacción. El estudio de la calidad microbiológica de los embutidos fermentados ligeramente acidificados se completó con la caracterización de las comunidades microbianas más importantes en estos productos. Se identificaron a nivel de especie los aislados de bacterias del ácido láctico (BAL), de enterococos y de cocos gram-positivos catalasa-positivos (CGC+). Posteriormente se realizó una tipificación molecular de los mismos mediante RAPD y análisis del perfil plasmídico y se estudiaron las principales características de interés higiénico-sanitario y tecnológico de las cepas. Mediante PCR se identificó Lactobacillus sakei como la especie predominante (74%), seguida por Lactobacillus curvatus (21,2%). La actividad aminoácido-descarboxilasa se asoció a la especie L. curvatus (el 66% de los aislados presentaron esta actividad). La identificación de los enterococos se realizó mediante PCR-multiplex y por secuenciación del gen sodA. Enterococcus faecium fue la especie de enterococos predominante (51,9%) seguida por Enterococcus faecalis (14,2%). Todas las cepas de E. faecalis presentaron genes asociados a factores de virulencia. E. faecalis presentó mayor resistencia a antibióticos que el resto de las especies de enterococos estudiadas. Tan sólo una cepa de E. faecium presentó el genotipo vanA (que confiere resistencia de alto nivel a la vancomicina). La identificación de los aislados de CGC+ (mediante PCR específica y amplificación de la región intergénica 16S-23S ARNr) demostró que Staphylococcus xylosus es la especie predominante en los embutidos fermentados ligeramente acidificados (80,8%). La amina biógena más común en los CGC+ fue la feniletilamina, producida por un 10,8% de aislados. Un pequeño porcentaje de aislados fueron mecA+ (4,6%), presentando además resistencia a múltiples antibióticos. El potencial enterotoxigénico de las cepas de CGC+ fue muy reducido (3,3% de los aislados), detectándose únicamente el gen entC. El estudio pormenorizado de las comunidades bacterianas de interés permitió la selección de 2 cepas de L. sakei y 2 cepas de S. xylosus con características tecnológicas e higiénico-sanitarias óptimas. Para evaluar su efectividad como cultivos iniciadores se elaboraron dos tipos de embutidos ligeramente ácidos, chorizo y fuet, inoculados con microorganismos patógenos (Salmonella spp., L. monocytogenes y S. aureus). El uso de cultivos iniciadores permitió el control de L. monocytogenes, Enterobacteriaceae y Enterococcus así como del contenido en aminas biógenas. Los recuentos de Salmonella spp. disminuyeron de forma significante durante la maduración de los embutidos, independientemente del uso de cultivos iniciadores. El uso del tratamiento de alta presión (400 MPa) en los embutidos madurados consiguió la ausencia de Salmonella spp. en los lotes tratados.

Differential recognition of Staphylococcus aureus quorum-sensing signals depends on both extracellular loops 1 and 2 of the transmembrane sensor AgrC.

Virulence in Staphylococcus aureus is regulated via agr-dependent quorum sensing in which an autoinducing peptide (AIP) activates AgrC, a histidine protein kinase. AIPs are usually thiolactones containing seven to nine amino acid residues in which the thiol of the central cysteine is linked to the alpha-carboxyl of the C-terminal amino acid residue. The staphylococcal agr locus has diverged such that the AIPs of the four different S. aureus agr groups self-activate but cross-inhibit. Consequently, although the agr system is conserved among the staphylococci, it has undergone significant evolutionary divergence whereby to retain functionality, any changes in the AIP-encoding gene (agrD) that modifies AIP structure must be accompanied by corresponding changes in the AgrC receptor. Since AIP-1 and AIP-4 only differ by a single amino acid, we compared the transmembrane topology of AgrC1 and AgrC4 to identify amino acid residues involved in AIP recognition. As only two of the three predicted extracellular loops exhibited amino acid differences, site-specific mutagenesis was used to exchange the key AgrC1 and AgrC4 amino acid residues in each loop either singly or in combination. A novel lux-based agrP3 reporter gene fusion was constructed to evaluate the response of the mutated AgrC receptors. The data obtained revealed that while differential recognition of AIP-1 and AIP-4 depends primarily on three amino acid residues in loop 2, loop 1 is essential for receptor activation by the cognate AIP. Furthermore, a single mutation in the AgrC1 loop 2 resulted in conversion of (Ala5)AIP-1 from a potent antagonist to an activator, essentially resulting in the forced evolution of a new AIP group. Taken together, our data indicate that loop 2 constitutes the predicted hydrophobic pocket that binds the AIP thiolactone ring while the exocyclic amino acid tail interacts with loop 1 to facilitate receptor activation.

Synthesis, structural characterization and catalytic activity of a multifunctional enzyme mimetic oxoperoxovanadium(v) complex

The synthesis and structural characterization of a novel oxoperoxovanadium(v) complex [VO(O-2)(PAH)-(phen)] containing the ligands 2-phenylacetohydroxamic acid (PAHH) and 1,10-phenanthroline (phen) has been accomplished. The oxoperoxovanadium(v) complex was found to mimic both vanadate-dependent haloperoxidase (VHPO) activity as well as nuclease activity through effective interaction with DNA. The complex is the first example of a structurally characterized stable oxoperoxovanadium(v) complex with a coordinated bi-dentate hydroximate moiety (-CONHO-) from 2-phenylacetohydroximate (PAH). The oxoperoxovanadium(v) complex has been used as catalyst for the peroxidative bromination reaction of some unsaturated alcohols (e.g. 4-pentene-1-ol, 1-octene-3-ol and 9-decene-1-ol) in the presence of H2O2 and KBr. The catalytic products have been characterized by GC-MS analysis and spectrophotometric methods. The DNA binding of this complex has been established with CT DNA whereas the DNA cleavage was demonstrated with plasmid DNA. The interactions of the complex with DNA have been monitored by electronic absorption and fluorescence emission spectroscopy. Viscometric measurements suggest that the compound is a DNA intercalator. The nuclease activity of this complex was confirmed by gel electrophoresis studies.

Oligonucleotide compound and method for treating nidovirus infections

A method and oligonucleotide compound for inhibiting replication of a nidovirus in virus-infected animal cells are disclosed. The compound (i) has a nuclease-resistant backbone, (ii) is capable of uptake by the infected cells, (iii) contains between 8-25 nucleotide bases, and (iv) has a sequence capable of disrupting base pairing between the transcriptional regulatory sequences in the 5′ leader region of the positive-strand viral genome and negative-strand 3′ subgenomic region. In practicing the method, infected cells are exposed to the compound in an amount effective to inhibit viral replication.

Mobile elements drive recombination hotspots in the core genome of Staphylococcus aureus

Horizontal gene transfer is an important driver of bacterial evolution, but genetic exchange in the core genome of clonal species, including the major pathogen Staphylococcus aureus, is incompletely understood. Here we reveal widespread homologous recombination in S. aureus at the species level, in contrast to its near-complete absence between closely related strains. We discover a patchwork of hotspots and coldspots at fine scales falling against a backdrop of broad-scale trends in rate variation. Over megabases, homoplasy rates fluctuate 1.9-fold, peaking towards the origin-of-replication. Over kilobases, we find core recombination hotspots of up to 2.5-fold enrichment situated near fault lines in the genome associated with mobile elements. The strongest hotspots include regions flanking conjugative transposon ICE6013, the staphylococcal cassette chromosome (SCC) and genomic island νSaα. Mobile element-driven core genome transfer represents an opportunity for adaptation and challenges our understanding of the recombination landscape in predominantly clonal pathogens, with important implications for genotype–phenotype mapping.

Mass spectrometric investigation of the DNA-binding properties of an anthracycline with two trisaccharide chains

Cosmomycin D (CosD) is an anthracycline that has two trisaccharide chains linked to its ring system. Gel electrophoresis showed that CosD formed stable complexes with plasmid DNA under conditions where daunorubicin (Dn) and doxorubicin (Dx) dissociated to some extent during the experiments. The footprint and stability of CosD complexed with 10- and 16 trier DNA was investigated using several applications of electrospray ionisation mass spectrometry (ESI-MS). ESI-MS binding profiles showed that fewer CosD molecules bound to the sequences than Dn or Dx. In agreement with this, ESI-MS analysis of nuclease digestion products of the complexes showed that CosD protected the DNA to a greater extent than Dn or Dx. In tandem MS experiments, all CosD-DNA complexes were more stable than Dn- and Dx-DNA complexes. These results Support that CosD binds more tightly to DNA and exerts a larger footprint than ESI-MS investigations of the binding properties of CosD Could be carried out rapidly and using only small amounts of sample. (C) 2008 Elsevier Inc. All rights reserved.

Electronic Structure and Spectro-Structural Correlations of Fe(III)Zn(II) Biomimetics for Purple Acid Phosphatases: Relevance to DNA Cleavage and Cytotoxic Activity

Purple acid phosphatases (PAPs) are a group of metallohydrolases that contain a dinuclear Fe(II)M(II) center (M(II) = Fe, Mn, Zn) in the active site and are able to catalyze the hydrolysis of a variety of phosphoric acid esters. The dinuclear complex [(H(2)O)Fe(III)(mu-OH)Zn(II)(L-H)](CIO(4))(2) (2) with the ligand 2-[N-bis(2-pyridylmethyl)aminomethyl]-4-methyl-6-[N-(2-pyridylmethyl)(2-hydroxybenzyl) aminomethyl]phenol (H(2)L-H) has recently been prepared and is found to closely mimic the coordination environment of the Fe(III)Zn(II) active site found in red kidney bean PAP (Neves et al. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 7486). The biomimetic shows significant catalytic activity in hydrolytic reactions. By using a variety of structural, spectroscopic, and computational techniques the electronic structure of the Fe(III) center of this biomimetic complex was determined. In the solid state the electronic ground state reflects the rhombically distorted Fe(III)N(2)O(4) octahedron with a dominant tetragonal compression align ad along the mu-OH-Fe-O(phenolate) direction. To probe the role of the Fe-O(phenolate) bond, the phenolate moiety was modified to contain electron-donating or -withdrawing groups (-CH(3), -H, -Br, -NO(2)) in the 5-position. Tie effects of the substituents on the electronic properties of the biomimetic complexes were studied with a range of experimental and computational techniques. This study establishes benchmarks against accurate crystallographic struck ral information using spectroscopic techniques that are not restricted to single crystals. Kinetic studies on the hydrolysis reaction revealed that the phosphodiesterase activity increases in the order -NO(2)<- Br <- H <- CH(3) when 2,4-bis(dinitrophenyl)phosphate (2,4-bdnpp) was used as substrate, and a linear free energy relationship is found when log(k(cat)/k(0)) is plotted against the Hammett parameter a. However, nuclease activity measurements in the cleavage of double stranded DNA showed that the complexes containing the electron-withdrawing -NO(2) and electron-donating CH3 groups are the most active while the cytotoxic activity of the biomimetics on leukemia and lung tumoral cells is highest for complexes with electron-donating groups.

Double-strand DNA cleavage induced by oxindole-Schiff base copper(II) complexes with potential antitumor activity

Some oxindole-Schiff base copper(II) complexes have already shown potential antitumor activity towards different cells, inducing apoptosis in a process modulated by the ligand, and having nuclei and mitochondria as main targets. Here, three novel copper(II) complexes with analogous ligands were isolated and characterized by spectroscopic techniques, having their reactivity compared to the so far most active complex in this class. Cytotoxicity experiments carried out toward human neuroblastoma SH-SY5Y cells confirmed its proapoptosis property. DNA cleavage studies were then performed in the presence of these complexes, in order to verify the influence of ligand structural features in its nuclease activity. All of them were able to cause double-strand DNA scissions, giving rise to nicked circular Form II and linear Form III species, in the presence of hydrogen peroxide. Additionally, DNA Form II was also detected in the absence of peroxide when the most active complex, [Cu(isaepy)(2)](2+) 1, was used. In an effort to better elucidate their interactions with DNA, solutions of the different complexes titrated with DNA had their absorption spectra monitored. An absorbance hyperchromism observed at 260 nm pointed to the intercalation of these complexes into the DNA structure. Further, investigations of 2-deoxy-D-ribose (DR) oxidation catalyzed by each of those complexes, using 2-thiobarbituric acid reactive species (TBARS) method, and detection of reactive oxygen species (ROS) formation by spin-trapping EPR, suggested that their mechanism of action in performing efficiently DNA cleavage occurs preferentially, but not only by oxidative pathways. (C) 2007 Elsevier Inc. All rights reserved.