Détection moléculaire des métastases des ganglions lymphatique dans le cancer du col de l'utérus

Le Cancer du Col Utérin (CCU) chez la femme est provoqué par le virus oncogénique VPH. La métastase lymphatique ganglionnaire est un facteur pronostique majeur pour l’évolution de ce cancer et sa présence influence la décision thérapeutique. En général, l’envahissement ganglionnaire est diagnostiqué par histologie, mais cette méthode est laborieuse et parfois prise en défaut pour détecter les micrométastases et les cellules cancéreuses isolées et pour donner des résultats rapides en per opératoire. L’outil moléculaire que nous désirons développer pour combler cette lacune est basé sur une analyse d’ARN des gènes du VPH exprimés par les cellules du CCU. Ceci sera fait par transcription réverse de l’ARN cellulaire couplé à une réaction quantitative en chaine par polymérase en temps réel (RT-qPCR). Cette technique devrait nous permettre une détection et une évaluation rapide des micrométastases pour aider à déterminer immédiatement un pronostic fiable et la thérapie associée. C’est un test précis, sensible et rapide pour détecter un envahissement ganglionnaire dans le CCU visant à améliorer la gestion thérapeutique. Le projet est basé sur trois objectifs. En premier lieu, valider les marqueurs moléculaires E6 et E7 de VPH16 et 18 à partir des échantillons frais et des échantillons fixés dans des blocs de paraffine. En deuxième lieu, déterminer la fiabilité et la sensibilité des marqueurs pour la détection des macrométastases, des micrométastases et les cellules tumorales isolées en utilisant la technique de RT-qPCR. En troisième lieu et parallèlement au travail présenté dans ce mémoire, il est nécessaire de constituer une base de données des patientes qui ont le virus VPH16 et 18 intégré dans leur génome, qui ont été traitées et dont nous connaissons déjà le diagnostic final afin de valider la méthode (biobanque). Nous avons réussi à extraire de l’ARNm de haute qualité à partir d’échantillons complexes, à détecter les gènes E6 et E7 de VPH16 et 18 en RT-qPCR, et à déterminer précisément la limite de détection de E6 et E7 dans les échantillons frais qui est une proportion de 0,008% de cellules cancéreuses. Dans les échantillons fixés dans la paraffine, cette limite est de 0,02% et 0,05% pour E6-E7-VPH16 et E6-E7-VPH18 respectivement. Ceci comparativement à une limite de détection histologique de 1% qui est déterminée par immunohistochimie de CK19. Enfin, notre protocole est validé pour VPH18 dans les ganglions lymphatiques du CCU.

Factores asociados a que usuarias de un hospital público, no soliciten los resultados de citologia cervical

El cáncer de cuello uterino y su mortalidad en Colombia ha permanecido constantes pese a los esfuerzos institucionales, distritales y nacionales que han buscado fortalecer los programas de prevención; sin embargo las estrategias actuales hacen énfasis en la toma de citología y no en la solicitud oportuna del resultado y el tratamiento de la usuaria en caso de anormalidad. METODOLOGIA: Se realizó un estudio en dos fases, un análisis descriptivo se analizaron 12875 y una segunda que involucro 257 pacientes en un análisis de casos y controles de una muestra aleatoria. RESULTADOS: Se utiliza para análisis bivariado la prueba de Chi cuadrado y regresión logística que muestran diferencias significativas en los siguientes variables: la explicación sobre la importancia del examen (p= 0.0060), importancia de la solicitud de resultado (p= 0.003), explicación sobre cuando reclamarlo (p=0.030), distancia entre residencia y centro de salud (p=0.065) DISCUSIÓN: En nuestro estudio se identificó que los factores como el acceso de la paciente al centro de salud, el tiempo del cual dispone para solicitar el resultado, si el dinero con el que cuenta la paciente para desplazarse al hospital, si es la primera vez que se realiza la citología, si le explicaron la importancia de reclamar el resultado y en que lapso de tiempo debía hacerlo, la información que tiene acerca de la importancia de realizarse la citología contribuyen en el hecho de que una paciente de esta población de un hospital público reclame o no su resultado de su citología

Human papillomavirus detection from human immunodeficiency virus-infected colombian women's paired urine and cervical samples

Infection, coinfection and type-specific human papillomavirus (HPV) distribution was evaluated in human immunodeficiency virus (HIV)-positive women from paired cervical and urine samples. Paired cervical and urine samples (n = 204) were taken from HIV-positive women for identifying HPV-DNA presence by using polymerase chain reaction (PCR) with three generic primer sets (GP5+/6+, MY09/11 and pU1M/2R). HPV-positive samples were typed for six high-risk HPV (HR-HPV) (HPV-16, -18, -31, -33, -45 and -58) and two low-risk (LR-HPV) (HPV-6/11) types. Agreement between paired sample results and diagnostic performance was evaluated. HPV infection prevalence was 70.6% in cervical and 63.2% in urine samples. HPV-16 was the most prevalent HPV type in both types of sample (66.7% in cervical samples and 62.0% in urine) followed by HPV-31(47.2%) in cervical samples and HPV-58 (35.7%) in urine samples. There was 55.4% coinfection (infection by more than one type of HPV) in cervical samples and 40.2% in urine samples. Abnormal Papanicolau smears were observed in 25.3% of the women, presenting significant association with HPV-DNA being identified in urine samples. There was poor agreement of cervical and urine sample results in generic and type-specific detection of HPV. Urine samples provided the best diagnosis when taking cytological findings as reference. In conclusion including urine samples could be a good strategy for ensuring adherence to screening programs aimed at reducing the impact of cervical cancer, since this sample is easy to obtain and showed good diagnostic performance.

Carga viral de seis tipos de Virus del Papiloma Humano de alto riesgo y su asociacion con lesiones cervicales

Introducción: La infección por un tipo de Virus del Papiloma Humano de alto riesgo (VPH-AR), es el factor principal en el desarrollo de Cáncer de Cérvix (CC). La carga viral puede modular esta asociación, por lo que resulta importante su cuantificación y el establecimiento de su relación con lesiones precursoras de CC. Metodología: 60 mujeres con lesiones escamosas intraepiteliales (LEI) y 120 mujeres sin LEI, confirmadas por colposcopia, fueron incluidas en el estudio. Se determinó la carga viral de 6 tipos de VPH-AR, mediante PCR en tiempo real. Se estimaron OR crudos y ajustados para evaluar la asociación entre la carga viral de cada tipo y las lesiones cervicales. Resultados: 93.22% de mujeres con LEI y 91.23% de mujeres negativas, fueron positivas para al menos un tipo de VPH. VPH-18 y VPH-16 fueron los tipos más prevalentes, junto con VPH-31 en mujeres sin LEI. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas de las cargas virales entre éstos dos grupos, aunque se observó un mayor carga viral en lesiones para algunos tipos virales. Una mayor frecuencia de lesiones se asoció a infecciones con carga baja de VPH-16 (ORa: 3.53; IC95%: 1.16 – 10.74), en comparación a mujeres con carga alta de VPH-16, (ORa: 2.63; IC95%: 1.09 – 6.36). En infecciones por VPH-31, la presencia de carga viral alta, se asoció con una menor frecuencia de lesiones (ORa: 0.34; IC95%: 0.15 – 0.78). Conclusiones: La prevalencia tipo-específica de VPH se corresponde con las reportadas a nivel mundial. La asociación entre la carga viral del VPH y la frecuencia de LEI es tipo específica y podría depender de la duración de la infección, altas cargas relacionadas con infecciones transitorias, y bajas cargas con persistentes. Este trabajo contribuye al entendimiento del efecto de la carga viral en la historia natural del CC; sin embargo, estudios prospectivos son necesarios para confirmar estos resultados.

Highly accurate detection of ovarian cancer using CA125 but limited improvement with serum matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry profiling

Objectives: Our objective was to test the performance of CA125 in classifying serum samples from a cohort of malignant and benign ovarian cancers and age-matched healthy controls and to assess whether combining information from matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) time-of-flight profiling could improve diagnostic performance. Materials and Methods: Serum samples from women with ovarian neoplasms and healthy volunteers were subjected to CA125 assay and MALDI time-of-flight mass spectrometry (MS) profiling. Models were built from training data sets using discriminatory MALDI MS peaks in combination with CA125 values and tested their ability to classify blinded test samples. These were compared with models using CA125 threshold levels from 193 patients with ovarian cancer, 290 with benign neoplasm, and 2236 postmenopausal healthy controls. Results: Using a CA125 cutoff of 30 U/mL, an overall sensitivity of 94.8% (96.6% specificity) was obtained when comparing malignancies versus healthy postmenopausal controls, whereas a cutoff of 65 U/mL provided a sensitivity of 83.9% (99.6% specificity). High classification accuracies were obtained for early-stage cancers (93.5% sensitivity). Reasons for high accuracies include recruitment bias, restriction to postmenopausal women, and inclusion of only primary invasive epithelial ovarian cancer cases. The combination of MS profiling information with CA125 did not significantly improve the specificity/accuracy compared with classifications on the basis of CA125 alone. Conclusions: We report unexpectedly good performance of serum CA125 using threshold classification in discriminating healthy controls and women with benign masses from those with invasive ovarian cancer. This highlights the dependence of diagnostic tests on the characteristics of the study population and the crucial need for authors to provide sufficient relevant details to allow comparison. Our study also shows that MS profiling information adds little to diagnostic accuracy. This finding is in contrast with other reports and shows the limitations of serum MS profiling for biomarker discovery and as a diagnostic tool

Associations of dietary dark-green and deep-yellow vegetables and fruits with cervical intraepithelial neoplasia: modification by smoking

Smoking has been positively and fruit and vegetable intake has been negatively associated with cervical cancer, the second most common cancer among women worldwide. However, a lower consumption of fruits and reduced serum carotenoids have been observed among smokers. It is not known whether the smoking effect on the risk of cervical neoplasia is modified by a low intake of fruits and vegetables. The present study examined the combined effects of tobacco smoking and diet using a validated FFQ and serum carotenoid and tocopherol levels on cervical intraepithelial neoplasia grade 3 (CIN3) risk in a hospital-based case-control study conducted in Sao Paulo, Brazil, between 2003 and 2005. The sample comprised 231 incident, histologically confirmed cases of CIN3 and 453 controls. A low intake (<= 39 g) of dark-green and deep-yellow vegetables and fruits without tobacco smoking had a lesser effect on CIN3 (OR 1.14; 95% CI 0.49, 2.65) than among smokers with higher intake (>= 40 g; OR 1.83; 95% CI 0.73, 4.62) after adjusting for confounders. The OR for the joint exposure of tobacco smoking and low intake of vegetables and fruits was greater (3.86; 95% CI 1.74, 8.57; P for trend < 0.001) compared with non-smokers with higher intake after adjusting for confounding variables and human papillomavirus status. Similar results were observed for total fruit, serum total carotene (including beta-, alpha-and gamma-carotene) and tocopherols. These findings suggest that the effect of nutritional factors on CIN3 is modified by smoking.

Bayesian Estimation for Performance Measures of Two Diagnostic Tests in the Presence of Verification Bias

Sensitivity and specificity are measures that allow us to evaluate the performance of a diagnostic test. In practice, it is common to have situations where a proportion of selected individuals cannot have the real state of the disease verified, since the verification could be an invasive procedure, as occurs with biopsy. This happens, as a special case, in the diagnosis of prostate cancer, or in any other situation related to risks, that is, not practicable, nor ethical, or in situations with high cost. For this case, it is common to use diagnostic tests based only on the information of verified individuals. This procedure can lead to biased results or workup bias. In this paper, we introduce a Bayesian approach to estimate the sensitivity and the specificity for two diagnostic tests considering verified and unverified individuals, a result that generalizes the usual situation based on only one diagnostic test.

Recovery of DNA for the detection and genotyping of human papillomavirus from clinical cervical specimens stored for up to 2 years in a universal collection medium with denaturing reagent

The recovery and stability of DNA for the detection and genotyping of HPV in UCM-containing specimens, after exposure to denaturing reagents and stored for up to 2 years were evaluated. Samples were collected from 60 women who had cervical cytology specimens harboring cervical intraepithelial neoplasia (CIN) 2 or 3. All samples were stored in UCM and had been frozen at -20 degrees C following the addition of the denaturing reagent (sodium hydroxide) and the removal of the aliquot required for Hybrid Capture 2 testing for the identification of HPV DNA. The samples had been stored for 6, 12 and 24 months (20 samples for each storage time). HPV DNA extraction was performed according to a protocol designed specifically and the presence and quality of DNA was confirmed by human P-globin detection using the consensus primers G73 and G74. HPV DNA was amplified using the consensus primers PGMY09 and PGMY11, and reverse line-blot hybridization was used to detect type-specific amplicons for 37 HPV types. The DNA extracted from the denatured specimen was recovered in 57/60 (95%) of the samples. HPV DNA was detected in 56/57 (98%) of the recovered samples. Twenty-six of the 56 samples recovered (48%) were genotyped successfully. (c) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

Correlação entre achados colposcópicos e diagnóstico histológico segundo a Classificação Colposcópica da Federação Internacional de Patologia Cervical e Colposcopia de 2002

Objetivo: Avaliar a acurácia da colposcopia utilizando a Classificação Colposcópica Internacional de 2002. Métodos: 3040 pacientes de população geral foram rastreadas para patologia cervical através de exame citopatológico, captura híbrida para HPV de alto risco e inspeção cervical. As colposcopias que resultaram em biópsia (n=468) executadas no rastreamento e acompanhamento destas pacientes foram gravadas, revistas por dois colposcopistas cegados e incluídas para análise. Resultados: Os observadores apresentaram excelente concordância (Kappa=0.843) no relato dos achados pela nova nomenclatura. A colposcopia apresentou sensibilidade de 86% e especificidade de 30.3% em diferenciar colo normal de colo anormal (LSIL, HSIL ou carcinoma); quando a colposcopia objetivava diferenciar colo normal ou LSIL de HSIL ou carcinoma, apresentou sensibilidade de 61.1% e especificidade de 94.4%. Os achados colposcópicos classificados como “maiores” pela nova classificação apresentaram valores preditivos positivos elevados para HSIL. Presença do achado colposcópico na zona de transformação e tamanho da lesão estavam associados a HSIL. Bordas externas definidas, associação de múltiplos achados distintos e presença de zona iodo negativa não estavam relacionados à gravidade das lesões. Conclusão: A colposcopia utilizando a Classificação Internacional de 2002 mostra-se um bom método de rastreamento, mas como método diagnóstico apresenta falhas, não podendo substituir a avaliação histológica. A categorização em achados colposcópicos “maiores” e “menores” apresentada pela nova classificação é adequada. Na realização da colposcopia, é importante também que a lesão seja situada em relação à zona de transformação e que seu tamanho seja indicado, já que estes foram fatores associados a lesões de alto grau.

Evolução no diagnóstico citológico do câncer de colo uterino - Novas tecnologias para o rastreamento citológico cervical

The cancer of the uterine cervix remains a serious public health problem in developing countries with low social-economic conditions. Papanicolaou smear has been used to screen women for cervical cancer since 1940, and it is widely recognized as an effective method for preventing cervical cancer. In Brazil, conventional Papanicolaou is the most common method used in diagnosis cytopathological routine, involving the morphological cell analysis by microscopic examination of cervical samples smeared on glass slides. On the other hand, the liquid cytology is an advantageous method whose specimen collected is put into a fluid alcohol based to guarantee the potential use of residual cellular material in cytobrush. Moreover, this method permits additional diagnostic studies, preserving the morphological cell features as the conventional one does. The aim of the present study was report the historical evolution of different cervical cytologic tests, emphasizing the advantages and disadvantages between conventional Papanicolaou method and new technologies in liquid based cytology.

A correlação da expressão do gene p53 no carcinoma invasor de colo uterino com fatores clínicos e prognóstico

Pós-graduação em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia - FMB

Neoplasia intra-epitelial cervical em mulheres soro-positivas para o vírus da imunodeficiência humana

Pós-graduação em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia - FMB

Papilomavírus humano associado a lesões de cérvix uterina

Com a finalidade de contribuir para um melhor conhecimento do eventual papel do Papilomavirus humano (HPV) na etiopatogênese do câncer cervical na região norte do Brasil, estudou-se a prevalência do vírus em 228 mulheres portadoras de lesões de cérvix uterina, atendidas no Instituto Ofir Loiola (IOL), em Belém, Pará, no período de março de 1992 a maio de 1996. As pacientes foram submetidas à biópsia de colo uterino, sendo o material coletado encaminhado para histopatologia e pesquisa de HPV por diferentes técnicas laboratoriais. Para fins de análise, as participantes foram distribuídas em 3 grupos, de acordo com o diagnóstico histopatológico. O grupo A foi constituído de 155 mulheres com carcinoma epidermóide invasor ou adenocarcinoma, o grupo B de 54 portadoras de neoplasia intraepitelial cervical grau II ou III (NIC II e NIC 111) e o C, de 19 pacientes com cervicite crônica. Pelas técnicas de PCR e hibridização por dot-blot, registraram-se prevalência de HPV em 70,3%, 63,0% e 36,8% das mulheres reunidas nos grupamentos A, B e C, respectivamente. O tipo de HPV predominante foi o 16, que representou 60,4% das amostras positivas do grupo A e 54,5% daquelas do grupo B. Os HPV tipo 16, 18 e 33 representaram 71,4% dos detectados no grupo C. Em 155 das 228 amostras testadas por PCR, realizou-se também a técnica de hibridização in situ (HIS) com sondas para detectar HPV 6/11, 16/18 e 31/33/35. A prevalência de HPV registrada por essa técnica foi de 17,4%, enquanto que por PCR observou-se, nas mesmas amostras, percentual Positivo de 65,2%. No que diz respeito a outros fatores, também tidos como implicados no desenvolvimento de carcinomas e lesões precursoras em cérvix uterina, verificou-se que cerca de 40% das mulheres dos grupos A e B admitiram iniciação sexual precoce (com 15 anos ou menos). Entretanto, a grande maioria referiu de 1 a 3 parceiros, não caracterizando comportamento sexual promíscuo. Os dados aqui apresentados, a exemplo do que se registrou em outros estudos conduzidos em diversas áreas geográficas, sustentam a hipótese de que o HPV desempenha um importante papel na etiologia dos carcinomas de colo uterino e neoplasias intraepiteliais cervicais. Contudo, investigações adicionais e mais amplas devem ser realizadas, com vistas a uma melhor compreensão das características epidemiológicas da infecção por HPV na Região Amazônica.

Prevalência da infecção pelo Papilomavírus humano (HPV) em mulheres investigadas para o câncer cervical, na cidade de Belém, Para

O Papilomavírus humano infecta as células basais do epitélio estratificado, induzindo o desenvolvimento de lesões proliferativas benignas na pele ou mucosas. As infecções apresentam distribuição universal. Muitos estudos têm demonstrado a forte associação da infecção por espécies de alto risco com casos de câncer cervical. Sendo assim, o presente estudo visou determinar a prevalência da infecção pelo HPV em um grupo de mulheres investigadas para o câncer cervical. No período de janeiro de 2008 a dezembro de 2009 foram coletadas amostras cervicais de 180 mulheres atendidas no Laboratório de Citopatologia da UFPA, sendo 162 elegíveis para o estudo. De cada participante foi coletada duas amostras, uma destinada à confecção do esfregaço para posterior análise citológica, através do Método de Papanicolaou e a outra destinada à análise por biologia molecular a fim de se investigar a presença do HPV, na qual utilizou-se os iniciadores MY09 e MY11. As espécies de HPV foram identificadas através da técnica de seqüenciamento de bases nucelotídicas da ORF L1 do HPV. A análise do perfil epidemiológico do grupo estudado demonstrou que a média de idade correspondia a 37,5 anos. A maioria (49,38%) era casada, 37,65% havia iniciado a atividade sexual entre 13 e 17 anos de idade e 58,64% não usava preservativos durante as relações sexuais. A prevalência global do HPV encontrada foi de 18,52%. Treze espécies diferentes foram identificadas, sendo que a maioria (66,67%) pertencia ao grupo de baixo risco, no qual o HPV-11 foi mais freqüente. Dentre o grupo de alto risco (30%) o HPV-31 foi encontrado em quatro casos. A distribuição das espécies de HPV de acordo com o resultado citológico demonstrou que a ocorrência da infecção foi maior no grupo de mulheres cujo esfregaço era livre de alterações citológicas (43,33%). No grupo de mulheres com alterações pré-malignas só observou-se infecções por espécies de baixo risco (10%). A infecção pelo HPV mostrou associação estatisticamente significativa com a atividade sexual e com a freqüência na realização do exame preventivo. A prevalência encontrada no estudo corrobora com outros achados descritos na literatura. A predominância da infecção em mulheres com citologia normal reforça a idéia de que a infecção é, em sua maioria, assintomática e que o método de Papanicolaou é menos eficiente na detecção da infecção em relação às técnicas de biologia molecular. Entretanto, ao se tratar de detecção de doença pré-maligna ou maligna, a biologia molecular não se aplica e, portanto não deve substituir o PCCU.

Prevalence of the germline TP53 p.R337H mutation in families with multiple cases of cancer

Germline mutations in TP53 gene are associated with Li-Fraumeni syndrome (LFS) and its variants Li-Fraumeni-like (LFL). They predispose carriers to a wide variety of early onset tumors. In Brazil, there is a high frequency of a germline mutation in this gene (NC_000017.9: c.1010G>A; p.R337H) in Southern and Southeastern regions, due to a founder effect. It is estimated to be present in 0,3% ofthe local population, but only few families have been detected. Due to this significant divergence, the purpose of this study was to verify the effectiveness of wider criteria for detection of these individuals. Herein, clinical criteria were established, DNA samples were collected, analyzed by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) and sequenced. Thus, assessing the prevalence of this mutation in families with multiple cases of cancer. Based on our proposed criteria, one out of 31 patients (3,22%) was found to carry p.R337H mutation. The patient developed ductal invasive breast cancer at age 47, invasive adenocarcinoma of the lung at age 48 and soft-tissue sarcoma at age 49. In addition, an extensive cancer family history was referred, atypical for LFS, including a case of Ewing’s sarcoma. These outcomes indicate that the proposed criteria may detect probable carriers who did not fit previous LFS criteria. Nevertheless, additional studies, which might include a larger number of families and more stringent parameters, will be useful to improve screening sensibility