998 resultados para Célula TCD4
Resumo:
RESUMO: A Malria causada por parasitas do gnero Plasmodium, sendo a doena parasitria mais fatal para o ser humano. Apesar de, durante o sculo passado, o desenvolvimento econmico e a implementao de diversas medidas de controlo, tenham permitido erradicar a doena em muitos pases, a Malria continua a ser um problema de sade grave, em particular nos pases em desenvolvimento. A Malria transmitida atravs da picada de uma fmea de mosquito do gnero Anopheles. Durante a picada, os esporozotos so injetados na pele do hospedeiro, seguindo-se a fase heptica e obrigatria do ciclo de vida. No fgado, os esporozotos infetam os hepatcitos onde se replicam, dentro de um vacolo parasitrio (VP) e de uma forma imunitria silenciosa, em centenas de merozoitos. Estas novas formas do parasita so as responsveis por infetar os eritrcitos, iniciando a fase sangunea da doena, onde se os primeiros sintomas se manifestam, tais como a caracterstica febre cclica. A fase heptica da doena a menos estudada e compreendida. Mais ainda, as interaes entre o VP e os organelos da células hospedeira esto ainda pouco caracterizados. Assim, neste estudo, as interaes entre os organelos endocticos e autofgicos da célula hospedeira e o VP foram dissecados, observando-se que os anfisomas, que so organelos resultantes da interseco do dois processos de trfego intracelular, interagem com o parasita. Descobrimos que a autofagia tem tambm uma importante funo imunitria durante a fase heptica inicial, ao passo, que durante o desenvolvimento do parasita, j numa fase mais tardia, o parasita depende da interao com os endossomas tardios e anfisomas para crescer. Vesiculas de BSA, EGF e LC3, foram, tambm, observadas dentro do VP, sugerindo que os parasitas so capazes de internalizar material endoctico e autofgico do hospedeiro. Mais ainda, mostramos que esta interao depende da cinase PIKfyve, responsvel pela converso do fosfoinositidio-3-fosfato no fosfoinositidio-3,5-bifosfato, uma vez que inibindo esta cinase o parasita no capaz de crescer normalmente. Finalmente, mostramos que a protena TRPML1, uma protena efetora do fosfoinositidio-3,5-bifosfato, e envolvida no processo de fuso das membranas dos organelos endocticos e autofgicos, tambm necessria para o crescimento do parasita. Desta forma, o nosso estudo sugere que a membrana do VP funde com vesiculas endocticas e autofgicas tardias, de uma forma dependente do fositidio-3,5-bifosfato e do seu effetor TRPML1, permitindo a troca de material com a célula hospedeira. Concluindo, os nossos resultados evidenciam que o processo autofgico que ocorre na célula hospedeira tem um papel duplo durante a fase heptica da malaria. Enquanto numa fase inicial os hepatcitos usam o processo autofgico como forma de defesa contra o parasita, j durante a fase de replicao o VP funde com vesiculas autofgicas e endocticas de forma a obter os nutrientes necessrios ao seu desenvolvimento.--------- ABSTRACT: Malaria, which is caused by parasites of the genus Plasmodium, is the most deadly parasitic infection in humans. Although economic development and the implementation of control measures during the last century have erradicated the disease from many areas of the world, it remains a serious human health issue, particularly in developing countries. Malaria is transmitted by female mosquitoes of the genus Anopheles. During the mosquito blood meal, Plasmodium spp. sporozoites are injected into the skin dermis of the vertebrate host, followed by an obligatory liver stage. Upon entering the liver, Plasmodium parasites infect hepatocytes and silently replicate inside a host cell-derived parasitophorous vacuole (PV) into thousands of merozoites. These new parasite forms can infect red blood cells initiating the the blood stage of the disease which shows the characteristic febrile malaria episodes. The liver stage is the least characterized step of the malaria infection. Moreover, the interactions between the Plasmodium spp. PV and the host cell trafficking pathways are poorly understood. We dissected the interaction between Plasmodium parasites and the host cell endocytic and autophagic pathways and we found that both pathways intersect and interconnect in the close vicinity of the parasite PV, where amphisomes are formed and accumulate. Interestingly, we observed a clearance function for autophagy in hepatocytes infected with Plasmodium berghei parasites at early infection times, whereas during late liver stage development late endosomes and amphisomes are required for parasite growth. Moreover, we found the presence of internalized BSA, EGF and LC3 inside parasite vacuoles, suggesting that the parasites uptake endocytic and autophagic cargo. Furthermore, we showed that the interaction between the PV and host traffic pathways is dependent on the kinase PIKfyve, which converts the phosphoinositide PI(3)P into PI(3,5)P2, since PIKfyve inhibition caused a reduction in parasite growth. Finally, we showed that the PI(3,5)P2 effector protein TRPML1, which is involved in late endocytic and autophagic membrane fusion, is also required for parasite development. Thus, our studies suggest that the parasite parasitophorous vacuole membrane (PVM) is able to fuse with late endocytic and autophagic vesicles in a PI(3,5)P2- and TRPML1-dependent manner, allowing the exchange of material between the host cell and the parasites, necessary for the rapid development of the latter that is seen during the liver stage of infection. In conclusion, we present evidence supporting a specific and essential dual role of host autophagy during the course of Plasmodium liver infection. Whereas in the initial hours of infection the host cell uses autophagy as a cell survival mechanism to fight the infection, during the replicative phase the PV fuses with host autophagic and endocytic vesicles to obtain nutrients required for parasite growth.
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Neste trabalho, investigamos concentrao da vitamina B12 e folato, considerando-se a influncia dos gentipos da metilenotetrahidrofolato redutase, o perfil imunolgico e a terapia antiretroviral utilizada na populao brasileira portadora do HIV. Um grupo de 86 indivduos portadores do HIV-1 e 29 doadores de sangue foram recrutados para compor a casustica. Entre os infectados pelo HIV-1, observou-se menor concentrao de B12 no grupo com maior nmero de linfcitos TCD4+. No encontramos diferena na distribuio genotpica para as mutaes MTHFR C677T e A1298C entre infectados e no infectados pelo HIV-1. Indivduos portadores do HIV, gentipo C677C, apresentaram concentraes menores de B12 em relao ao grupo controle de mesmo gentipo. A terapia antiretroviral no mostrou qualquer influncia nos valores de folato e vitamina B12. Estudos adicionais so necessrios para reavaliar a prevalncia de menores concentraes de B12 e folato e de hiperhomocisteinemia na populao portadora do HIV sob a tica do uso de HAART e da melhoria na sobrevida dos pacientes.
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Os vrus linfotrpicos de células T humanas, quando integrados ao genoma da célula hospedeira, provrus, tm como marcador de replicao seu DNA proviral. A carga proviral parece ser um importante fator no desenvolvimento de patologias associadas a estes retrovrus. Neste estudo foi desenvolvida uma metodologia para quantificao absoluta da carga proviral dos HTLV-1 e HTLV-2 atravs da PCR em tempo real. Cinqenta e trs amostras de doadores de sangue com teste de ELISA reagente foram submetidas metodologia, que utilizou o sistema TaqMan para trs seqncias alvo: HTLV-1, HTLV-2 e albumina. A quantificao proviral absoluta foi determinada atravs da proporo relativa entre o genoma do HTLV e o genoma da célula hospedeira, levando em considerao o nmero de leuccitos. O mtodo apresentado sensvel (215 cpias/mL), prtico e simples para quantificao proviral, alm de eficiente e adequado para confirmao e discriminao da infeco pelos tipos virais.
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O HTLV-1 o vrus causador da leucemia/linfoma de célula T no adulto e de uma desordem neurolgica conhecida por mielopatia associada ao HTLV ou paraparesia espstica tropical. Um dos modos de transmisso pelo sangue contaminado e seus subprodutos e, devido ao risco de infeces associadas ao HTLV sua pesquisa na triagem de doadores de sangue foi introduzida no Brasil a partir de 1993. Os kits diagnsticos utilizados nos bancos de sangue nacionais so na sua maioria comprados de empresas estrangeiras. O Brasil no detm a tecnologia para produo deste material e h a necessidade de produo de sistemas de diagnstico com tecnologia nacional. Neste trabalho, mostramos a expresso da gp21/HTLV-1 em Escherichia coli e sua reatividade frente a anticorpos monoclonais e de pacientes infectados. Expressar tais protenas o primeiro passo para obteno de conjuntos diagnsticos com tecnologia brasileira.
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O desenvolvimento de novos materiais e a sua caracterizao de extrema importncia no dimensionamento e construo de equipamentos criognicos. A empresa Versarien desenvolveu uma tcnica capaz de produzir cobre poroso, conseguindo controlar a porosidade e o tamanho de poros. Os materiais porosos so de especial interesse para dispositivos criognicos em aplicaes espaciais. Um exemplo desta aplicao so as unidades de armazenamento de energia (Energy Storage Units-ESU), onde um material poroso usado em ausncia de gravidade para reter um lquido criognico por capilaridade, de modo a manter dispositivos a uma temperatura baixa e constante. Neste caso, um material poroso de elevada condutividade trmica, como o cobre, seria de grande interesse uma vez que permite obter uma boa homogeneidade de temperatura na célula. Neste trabalho foi desenvolvido um sistema para medir a condutividade trmica deste material, entre 15 e 260 K, para porosidades entre 50% e 80%, utilizando um criorrefrigerador 2 W @ 20 K. Estas medies permitiram determinar que a pureza do cobre poroso se encontra entre RRR20 (RRR: Residual-resistivity ratio) e RRR10, apresentando uma tortuosidade que se encontra de acordo com um modelo simples descrito nesta dissertao. Foi ainda desenhado, construdo e testado um criostato porttil, que apenas necessita de azoto lquido e de bombeamento primrio para que se possam realizar medies de condutividade trmica entre 77 e 300 K.
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O objetivo deste estudo o desenvolvimento e validao de mtodos espectroscpicos (espectroscopia NIR) que possam vir a substituir os mtodos qumicos convencionais, para quantificao de grupos hidrxilo em resinas alqudicas. As resinas alqudicas estudadas neste trabalho so normalmente utilizadas em sistemas de revestimento de dois componentes, em que os seus grupos hidrxilo reagem com pr-polmeros de isocianato para formar revestimentos de alta dureza. Por este motivo e por questes processuais ligadas estequiometria da reao existente na aplicao referida, extremamente importante a quantificao destes grupos. O mtodo mais comum de quantificao de grupos hidrxilo conhecido como mtodo de titulao. Este um mtodo demorado, pois cada medio implica um procedimento experimental de cerca de duas horas, para alm de ser muito dispendioso, a nvel econmico. Foram estudadas as influncias da temperatura, heterogeneidade e nvel de enchimento da célula na recolha do espectro. As concluses dos estudos mencionados levaram fixao de um tempo ideal de permanncia da célula dentro da cmara do espectrofotmetro antes da medio do espectro. Para alm disto, conclui-se que para lotes standard, a heterogeneidade no uma varivel significativa. O nvel da célula deve ser mantido constante. Os mtodos desenvolvidos, baseados na norma de qualidade ISO 15063:2011, foram construdos a partir de algoritmos de Partial Least Squares Regression (PLS), utilizando um equipamento NIRVIS, Bchi. Foram obtidos bons coeficientes de regresso linear para a Resina A (R2>0,9). Quanto aos restantes resultados, estes indicam a possibilidade de aplicao em resinas do mesmo tipo. Este mtodo proporciona resultados 8 vezes mais rpidos e com custos em material que representam 1% do mtodo standard.
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O objetivo deste estudo o desenvolvimento e validao de mtodos espectroscpicos (espectroscopia NIR) que possam vir a substituir os mtodos qumicos convencionais, para quantificao de grupos hidrxilo em resinas alqudicas. As resinas alqudicas estudadas neste trabalho so normalmente utilizadas em sistemas de revestimento de dois componentes, em que os seus grupos hidrxilo reagem com pr-polmeros de isocianato para formar revestimentos de alta dureza. Por este motivo e por questes processuais ligadas estequiometria da reao existente na aplicao referida, extremamente importante a quantificao destes grupos. O mtodo mais comum de quantificao de grupos hidrxilo conhecido como mtodo de titulao. Este um mtodo demorado, pois cada medio implica um procedimento experimental de cerca de duas horas, para alm de ser muito dispendioso, a nvel econmico. Foram estudadas as influncias da temperatura, heterogeneidade e nvel de enchimento da célula na recolha do espectro. As concluses dos estudos mencionados levaram fixao de um tempo ideal de permanncia da célula dentro da cmara do espectrofotmetro antes da medio do espectro. Para alm disto, conclui-se que para lotes standard, a heterogeneidade no uma varivel significativa. O nvel da célula deve ser mantido constante. Os mtodos desenvolvidos, baseados na norma de qualidade ISO 15063:2011, foram construdos a partir de algoritmos de Partial Least Squares Regression (PLS), utilizando um equipamento NIRVIS, Bchi. Foram obtidos bons coeficientes de regresso linear para a Resina A (R2>0,9). Quanto aos restantes resultados, estes indicam a possibilidade de aplicao em resinas do mesmo tipo. Este mtodo proporciona resultados 8 vezes mais rpidos e com custos em material que representam 1% do mtodo standard.
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Parte do trabalho efetuado durante este projeto de dissertao foi publicado na revista Chemico-Biological Interactions. E apresentado no 50th Congress of the European Societies of Toxicology 7th - 10th September 2014 Edinburgh International Conference Centre, Edinburgh, Scotland em forma de poster.
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Este trabalho objetiva a anlise prospectiva das caractersticas clnicas e epidemiolgicas que levam os pacientes adultos com HIV/AIDS a procurarem atendimento clnico de urgncia em Pronto Atendimento do Hospital das Clnicas da Universidade Federal de Minas Gerais. Noventa e nove pacientes perfizeram 118 internaes. A idade foi em mdia 39,4 anos. A relao homem e mulher foi de 1,35:1. O tempo desde o diagnstico at a admisso situou-se de forma mais freqente entre 0-5 anos em 40,4% dos casos. A teraputica anti-retroviral era usada regularmente em 56,8% das admisses. A contagem de linfcitos T CD4+ foi inferior a 200 células/mm em 45,7% dos pacientes. As queixas mais freqentes foram aumento da temperatura corprea, diarria, tosse e dispnia. O aparelho respiratrio foi o mais acometido. As doenas oportunistas mais freqentes foram pneumocistose, pneumonia comunitria, sndrome diarrica, e candidiase oral. A demanda de internaes de pacientes com HIV representou 2,8% das admisses, com tempo mdio de permanncia hospitalar de 4,6 dias. Os pacientes possuam, em sua maioria, contagem de linfcitos TCD4+ baixa, quase metade no usava a terapia anti-retroviral altamente eficaz. Houve tendncia feminizao. As doenas relacionadas AIDS continuam sendo as mais freqentes no nosso meio.
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RESUMO: A pele o maior rgo do corpo humano e a sua pigmentao essencial para a sua colorao e proteo contra os efeitos nocivos da radiao ultravioleta (UV). A pigmentao da pele resulta essencialmente de trs processos: a sntese e o armazenamento de melanina pelos melancitos, em organelos especializados denominados melanossomas; o transporte dos melanossomas dentro dos melancitos; e finalmente, a transferncia dos melanossomas para os queratincitos adjacentes. Nos queratincitos, a melanina migra para a regio perinuclear apical da célula para formar um escudo protetor,responsvel pela proteo do DNA dos danos causados pela radiao UV. Os melancitos esto localizados na camada basal da epiderme e contactam com 30-40 queratincitos. Em conjunto, estas células formam a unidade melano-epidrmica. Apesar dos processos de sntese e transporte de melanina nos melancitos estarem bastante bem caracterizados, os mecanismos moleculares subjacentes transferncia inter-celular de melanina so menos conhecidos e ainda controversos. Dados preliminares obtidos pelo nosso grupo, que se basearam na observao de amostras de pele humana por microscopia electrnica, indicam que a forma predominante de transferncia de melanina na epiderme consiste na exocitose dos melanossomas pelos melancitos e subsequente endocitose da melanina por queratincitos. Para alm disso sabe-se que as protenas Rab, que controlam o trfego membranar, esto envolvidas em vrias etapas de pigmentao da pele, nomeadamente na biognese e no transporte de melanina. Assim, dado o seu papel fundamental nestes processos, questionmo-nos sobre o seu envolvimento na transferncia de melanina. Com este trabalho, propomo-nos a expandir o conhecimento atual sobre a transferncia de melanina na pele, atravs do estudo detalhado dos seus mecanismos moleculares, identificando as protenas Rab que regulam o processo. Pretendemos tambm confirmar o modelo de exo/endocitose como sendo o mecanismo principal de transferncia de melanina. Primeiro, explormos a regulao da secreo de melanina pelos melancitos e analismos o papel de protenas Rab neste processo. Os resultados foram obtidos recorrendo a um mtodo in vitro, desenvolvido previamente no laboratrio, que avalia a quantidade de melanina segregada para o meio de cultura por espectrofotometria, e ainda por microscopia, contando o nmero de melanossomas transferidos para os queratincitos. Atravs de co-culturas de melancitos e queratincitos, verificou-se que os queratincitos estimulam a libertao de melanina dos melancitos para o meio extra-celular, bem como a sua transferncia para os queratincitos. Alm disso, a protena Rab11b foi identificada como um regulador da exocitose de melanina e da sua transferncia para os queratincitos. De facto, a diminuio da expresso de Rab11b em melancitos provocou a reduo da secreo de melanina estimulada por queratincitos, bem como da transferncia desta. Em segundo lugar, para complementar o nosso estudo, centrmos a nossa investigao na internalizao de melanina por queratincitos. Especificamente, usando uma biblioteca de siRNA, explormos o envolvimento de protenas Rab na captao de melanina por queratincitos. Como primeira abordagem, usmos esferas fluorescentes como substituto de melanina, avaliando os resultados por citometria de fluxo. No entanto, este mtodo revelou-se ineficaz uma vez que a internalizao destas esferas independente do recetor PAR-2 (recetor 2 ativado por protease), que foi previamente descrito como essencial na captao de melanina por queratincitos Posteriormente, foi desenvolvido um novo protocolo de endocitose baseado em microscopia, usando melanossomas sem a membrana envolvente (melanocores) purificados do meio de cultura de melancitos, incluindo um programa informtico especialmente desenhado para realizar uma anlise semi-automatizada. Aps internalizao, os melanocores acumulam-se na regio perinuclear dos queratincitos, em estruturas que se assemelham ao escudo supranuclear observado na pele humana. Seguidamente, o envolvimento do recetor PAR-2 na captao de melanocores por queratincitos foi confirmado, utilizando o novo protocolo de endocitose desenvolvido. Para alm disso, a necessidade de quatro protenas Rab foi identificada na internalizao de melanocores por queratincitos. A reduo da expresso de Rab1a ou Rab5b em queratincitos diminuiu significativamente o nvel de internalizao de melanocores, enquanto o silenciamento da expresso de Rab2a ou Rab14 aumentou a quantidade de melanocores internalizados por estas células. Em concluso, os resultados apresentados corroboram as observaes anteriores, obtidas em amostras de pele humana, e sugerem que o mecanismo de transferncia predominante a exocitose de melanina pelos melancitos, induzida por queratincitos, seguida por endocitose pelos queratincitos. A pigmentao da pele tem implicaes tanto ao nvel da cosmtica, como ao nvel mdico, relacionadas com foto-envelhecimento e com doenas pigmentares. Assim sendo, ao esclarecer quais os mecanismos moleculares que regulam a transferncia de melanina na pele, este trabalho pode conduzir ao desenvolvimento de novas estratgias para modular a pigmentao da pele.----------------ABSTRACT: Skin pigmentation is achieved through the highly regulated production of the pigment melanin in specialized organelles, termed melanosomes within melanocytes. These are transported from their site of synthesis to the melanocyte periphery before being transferred to keratinocytes where melanin forms a supra-nuclear cap to protect the DNA from UVinduced damage. Together, melanocytes and keratinocytes form a functional complex, termed epidermal-melanin unit, that confers color and photoprotective properties to the skin. Skin pigmentation requires three processes: the biogenesis of melanin; its intracelular transport within the melanocyte to the cell periphery; and the melanin transfer to keratinocytes. The first two processes have been extensively characterized. However, despite significant advances that have been made over the past few years, the mechanisms underlying inter-cellular transfer of pigment from melanocytes to keratinocytes remain controversial.Preliminary studies from our group using electron microscopy and human skin samples found evidence for a mechanism of coupled exocytosis-endocytosis. Rab GTPases are master regulators of intracellular trafficking and have already been implicated in several steps of skin pigmentation. Thus, we proposed to explore and characterize the molecular mechanisms of melanin transfer and the role of Rab GTPases in this process. Moreover, we investigated whether the exo/endocytosis model is the main mechanism of melanin transfer. We first focused on melanin exocytosis by melanocytes. Then, we started to investigate the key regulatory Rab proteins involved in this step by establishing an in vitro tissue culture model of melanin secretion. Using co-cultures of melanocytes and keratinocytes, we found that keratinocytes stimulate melanin release and transfer. Moreover, depletion of Rab11b decreases keratinocyte-induced melanin exocytosis by melanocytes. In order to determine whether melanin exocytosis is a predominant mechanism of melanin transfer, the amount of melanin transferred to keratinocytes was then assayed in conditions where melanin exocytosis was inhibited. Indeed, Rab11b depletion resulted in a significant decrease in melanin uptake by keratinocytes. Taken together, these observations suggest that Rab11b mediates melanosome exocytosis from melanocytes and transfer to keratinocytes. To complement and extend our study, we of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptakecentred our attention in the internalization of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptake.Therefore, we concluded that microspheres were uptaken by keratinocytes through a different pathway than melanin. Subsequently, we developed a microscopy-based endocytosis assay using purified melanocores (melanosomes lacking the limiting membrane) from melanocytes, including a program to perform a semi-automated analysis. Melanocores are taken up by keratinocytes and accumulate in structures in the perinuclear area that resemble the physiological supranuclear cap observed in human skin. We then confirmed the involvement of PAR-2 receptor in the uptake of melanocores by keratinocytes, using the newly developed assay. Furthermore, we identified the role of four Rab GTPases on the uptake of melanocores by keratinocytes. Depletion of Rab1a and Rab5b from keratinocytes significantly reduced the uptake of melanocores, whereas Rab2a, and Rab14 silencing increased the amount the melanocores internalized by XB2 keratinocytes. In conclusion, we present evidence supporting keratinocyte-inducedmelanosome exocytosis from melanocytes, followed by endocytosis of the melanin core by keratinocytes as the predominant mechanism of melanin transfer in skin. Although advances have been made, there is a need for more effective and safer therapies directed at pigmentation disorders and also treatments for cosmetic applications. Hence, the understanding of the above mechanisms of skin pigmentation will lead to a greater appreciation of the molecular machinery underlying human skin pigmentation and could interest the pharmaceutical and cosmetic industries.
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RESUMO:O glicosilfosfatidilinositol (GPI) um complexo glicolipdico utlizado por dezenas de protenas, o qual medeia a sua ancoragem superfcie da célula. Protenas de superfcie celular ancoradas a GPI apresentam vrias funes essenciais para a manuteno celular. A deficincia na sntese de GPI o que caracteriza principalmente a deficincia hereditria em GPI, um grupo de doenas autossmicas raras que resultam de mutaes nos genes PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO e PIGT, os quais sao indispensveis para a biossntese do GPI. Uma mutao pontual no motivo rico em GC -270 no promotor de PIGM impede a ligao do factor de transcrio (FT) Sp1 sua sequncia de reconhecimento, impondo a compactao da cromatina, associada hipoacetilao de histonas, e consequentemente, impedindo a transcrio de PIGM. Desta forma, a adio da primeira manose ao GPI comprometida, a sntese de GPI diminui assim como as protenas ligadas a GPI superficie das células. Pacientes com Deficincia Hereditria em GPI-associada a PIGM apresentam trombose e epilesia, e ausncia de hemlise intravascular e anemia, sendo que estas duas ltimas caractersticas definem a Hemoglobinria Paroxstica Nocturna (HPN), uma doena rara causada por mutaes no gene PIGA. Embora a mutao que causa IGD seja constitutiva e esteja presente em todos os tecidos, o grau de deficincia em GPI varia entre células do mesmo tecido e entre células de tecidos diferentes. Por exemplo nos granulcitos e linfcitos B a deficincia em GPI muito acentuada mas nos linfcitos T, fibroblastos, plaquetas e eritrcitos aproximadamente normal, da a ausncia de hemlise intravascular. Os eventos transcricionais que esto na base da expresso diferencial da ncora GPI nas células hematopoiticas so desconhecidos e constituem o objectivo geral desta tese. Em primeiro lugar, os resultados demonstraram que os nveis de PIGM mRNA variam entre células primrias hematopoiticas normais. Adicionalmente, a configurao dos nucleossomas no promotor de PIGM mais compacta em células B do que em células eritrides e tal est correlacionado com os nveis de expresso de PIGM, isto , inferior nas células B. A presena de vrios motivos de ligao para o FT especfico da linhagem megacarioctica-eritride GATA-1 no promotor de PIGM sugeriu que GATA-1 desempenha um papel regulador na sua transcrio. Os resultados mostraram que muito possivelmente GATA-1 desempenha um papel repressor em vez de activador da expresso de PIGM. Resultados preliminares sugerem que KLF1, um factor de transcrio restritamente eritride, regula a transcrio de PIGM independentemente do motivo -270GC. Em segundo lugar, a investigao do papel dos FTs Sp demonstrou que Sp1 medeia directamente a transcrio de PIGM em ambas as células B e eritride. Curiosamente, ao contrrio do que acontece nas células B, em que a transcrio de PIGM requer a ligao do FT geral Sp1 ao motivo -270GC, nas células eritrides Sp1 regula a transcrio de PIGM ao ligar-se a montante e no ao motivo -270GC. Para alm disso, demonstrou-se que Sp2 no um regulador directo da transcrio de PIGM quer nas células B quer nas células eritrides. Estes resultados explicam a ausncia de hemlise intravascular nos doentes com IGD associada a PIGM, uma das principais caractersticas que define a HPN. Por ltimo, resultados preliminares mostraram que a represso da transcrio de PIGM devida mutao patognica -270C>G est associada com a diminuio da frequncia de interaces genmicas em cis entre PIGM e os seus genes vizinhos, sugerindo adicionalmente que a regulao de PIGM e desses genes partilhada. No seu conjunto, os resultados apresentados nesta tese contribuem para o conhecimento do controlo transcricional de um gene housekeeping, especfico-detecido, por meio de FTs genricos e especficos de linhagem.-------------ABSTRACTC: Glycosylphosphatidylinositol (GPI) is a complex glycolipid used by dozens of proteins for cell surface anchoring. GPI-anchored proteins have various functions that are essential for the cellular maintenance. Defective GPI biosynthesis is the hallmark of inherited GPI deficiency (IGD), a group of rare autosomal diseases caused by mutations in PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO and PIGT, all genes indispensable for GPI biosynthesis. A point mutation in the -270GC-rich box in the core promoter of PIGM disrupts binding of the transcription factor (TF) Sp1 to it, imposing nucleosome compaction associated with histone hypoacetylation, thus abrogating transcription of PIGM. As a consequence of PIGM transcriptional repression, addition of the first mannose residue onto the GPI core and thus GPI production are impaired; and expression of GPI-anchored proteins on the surface of cells is severely impaired. Patients with PIGM-associated IGD suffer from life-threatening thrombosis and epilepsy but not intravascular haemolysis and anaemia, two defining features of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH), a rare disease caused by somatic mutations in PIGA. Although the disease-causing mutation in IGD is constitutional and present in all tissues, the degree of GPI deficiency is variable and differs between cells of the same and of different tissues. Accordingly, GPI deficiency is severe in granulocytes and B cells but mild in T cells, fibroblasts, platelets and erythrocytes, hence the lack of intravascular haemolysis.The transcriptional events underlying differential expression of GPI in the haematopoietic cells of PIG-M-associated IGD are not known and constitute the general aim of this thesis. Firstly, I found that PIGM mRNA levels are variable amongst normal primary haematopoietic cells. In addition, the nucleosome configuration in the promoter of PIGM is more compacted in B cells than in erythroid cells and this correlated with the levels of PIGM mRNA expression, i.e., lower in B cells. The presence of several binding sites for GATA-1, a mega-erythroid lineage-specific transcription factor (TF), at the PIGM promoter suggested that GATA-1 has a role on PIGM transcription. My results showed that GATA-1 in erythroid cells is most likely a repressor rather than an activator of PIGM expression. Preliminary data suggested that KLF1, an erythroid-specific TF, regulates PIGM transcription but independently of the -270GC motif. Secondly, investigation of the role of the Sp TFs showed that Sp1 directly mediates PIGM transcriptional regulation in both B and erythroid cells. However, unlike in B cells in which active PIGM transcription requires binding of the generic TF Sp1 to the -270GC-rich box, in erythroid cells, Sp1 regulates PIGM transcription by binding upstream of but not to the -270GC-rich motif. Additionally, I showed that Sp2 is not a direct regulator of PIGM transcription in B and erythroid cells. These findings explain lack of intravascular haemolysis in PIGM-associated IGD, a defining feature of PNH. Lastly, preliminary work shows that transcriptional repression of PIG-M by the pathogenic -270C>G mutation is associated with reduced frequency of in cis genomic interactions between PIGM and its neighbouring genes, suggesting a shared regulatory link between these genes and PIGM. Altogether, the results presented in this thesis provide novel insights into tissuespecific transcriptional control of a housekeeping gene by lineage-specific and generic TFs.
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RESUMO: As células endoteliais definem e delineiam todo o sistema vascular...Nesta tese procurmos explorar o papel que o ambiente tumoral exerce sobre as células endoteliais. ... Avaliamos tambm a capacidade anti-angiognica de alguns derivados do estrognio... Em suma os nossos resultados mostram a importncia de um controlo rigoroso da regulao transcricional...
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RESUMO: A reprogramao celular permite que uma célula somtica seja reprogramada para outra célula diferente atravs da expresso forada de factores de transcrio (FTs) especficos de determinada linhagem celular, e constitui uma rea de investigao emergente nos ltimos anos. As células somticas podem ser experimentalmente manipuladas de modo a obter células estaminais pluripotentes induzidas (CEPi), ou convertidas directamente noutro tipo de célula somtica. Estas descobertas inovadoras oferecem oportunidades promissoras para o desenvolvimento de novas terapias de substituio celular e modelos de doena, funcionando tambm como ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares que estabelecem a identidade celular e regulam os processos de desenvolvimento. Existem vrias doenas degenerativas hereditrias e adquiridas da retina que causam deficincia visual devido a uma disfuno no tecido de suporte da retina, o epitlio pigmentar da retina (EPR). Uma destas doenas a Coroideremia (CHM), uma doena hereditria monognica ligada ao cromossoma X causada por mutaes que implicam a perda de funo duma protena com funes importantes na regulao do trfico intracelular. A CHM caracterizada pela degenerescncia progressiva do EPR, assim como dos foto-receptores e da coride. Resultados experimentais sugerem que o EPR desempenha um papel importante na patognese da CHM, o que parece indicar uma possvel vantagem teraputica na substituio do EPR nos doentes com CHM. Por outro lado, existe uma lacuna em termos de modelos in vitro de EPR para estudar a CHM, o que pode explicar o ainda desconhecimento dos mecanismos moleculares que explicam a patognese desta doena. Assim, este trabalho focou-se principalmente na explorao das potencialidades das tcnicas de reprogramao celular no contexto das doenas de degenerescncia da retina, em particular no caso da CHM. Células de murganho de estirpe selvagem, bem como células derivadas de um ratinho modelo de knockout condicional de Chm, foram convertidos com sucesso em CEPi recorrendo a um sistema lentiviral induzido que permite a expresso forada dos 4 factores clssicos de reprogramao, a saber Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Estas células mostraram ter equivalncia morfolgica, molecular e funcional a células estaminais embrionrias (CES). As CEPi obtidas foram seguidamente submetidas a protocolos de diferenciao com o objectivo final de obter células do EPR. Os resultados promissores obtidos revelam a possibilidade de gerar um valioso modelo de EPR-CHM para estudos in vitro. Em alternativa, a converso directa de linhagens partindo de fibroblastos para obter células do EPR foi tambm abordada. Uma vasta gama de ferramentas moleculares foi gerada de modo a implementar uma estratgia mediada por FTs-chave, seleccionados devido ao seu papel fundamental no desenvolvimento embrionrio e especificao do EPR. Conjuntos de 10 ou menos FTs foram usados para transduzir fibroblastos, que adquiriram morfologia pigmentada e expresso de alguns marcadores especficos do EPR. Adicionalmente, observou-se a activao de regies promotoras de genes especficos de EPR, indicando que a identidade transcricional das células foi alterada no sentido pretendido. Em concluso, avanos significativos foram atingidos no sentido da implementao de tecnologias de reprogramao celular j estabelecidas, bem como na concepo de novas estratgias inovadoras. Metodologias de reprogramao, quer para pluripotncia, quer via converso directa, foram aplicadas com o objectivo final de gerar células do EPR. O trabalho aqui descrito abre novos caminhos para o estabelecimento de terapias de substituio celular e, de uma maneira mais directa, levanta a possibilidade de modelar doenas degenerativas da retina com disfuno do EPR numa placa de petri, em particular no caso da CHM.---------------ABSTRACT: Cellular reprogramming is an emerging research field in which a somatic cell is reprogrammed into a different cell type by forcing the expression of lineage-specific transcription factors (TFs). Cellular identities can be manipulated using experimental techniques with the attainment of pluripotency properties and the generation of induced Pluripotent Stem (iPS) cells, or the direct conversion of one somatic cell into another somatic cell type. These pioneering discoveries offer new unprecedented opportunities for the establishment of novel cell-based therapies and disease models, as well as serving as valuable tools for the study of molecular mechanisms governing cell fate establishment and developmental processes. Several retinal degenerative disorders, inherited and acquired, lead to visual impairment due to an underlying dysfunction of the support cells of the retina, the retinal pigment epithelium (RPE). Choroideremia (CHM), an X-linked monogenic disease caused by a loss of function mutation in a key regulator of intracellular trafficking, is characterized by a progressive degeneration of the RPE and other components of the retina, such as the photoreceptors and the choroid. Evidence suggest that RPE plays an important role in CHM pathogenesis, thus implying that regenerative approaches aiming at rescuing RPE function may be of great benefit for CHM patients. Additionally, lack of appropriate in vitro models has contributed to the still poorly-characterized molecular events in the base of CHM degenerative process. Therefore, the main focus of this work was to explore the potential applications of cellular reprogramming technology in the context of RPE-related retinal degenerations. The generation of mouse iPS cells was established and optimized using an inducible lentiviral system to force the expression of the classic set of TFs, namely Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Wild-type cells, as well as cells derived from a conditional knockout (KO) mouse model of Chm, were successfully converted into a pluripotent state, that displayed morphology, molecular and functional equivalence to Embryonic Stem (ES) cells. Generated iPS cells were then subjected to differentiation protocols towards the attainment of a RPE cell fate, with promising results highlighting the possibility of generating a valuable Chm-RPE in vitro model. In alternative, direct lineage conversion of fibroblasts into RPE-like cells was also tackled. A TF-mediated approach was implemented after the generation of a panoply of molecular tools needed for such studies. After transduction with pools of 10 or less TFs, selected for their key role on RPE developmental process and specification, fibroblasts acquired a pigmented morphology and expression of some RPE-specific markers. Additionally, promoter regions of RPE-specific genes were activated indicating that the transcriptional identity of the cells was being altered into the pursued cell fate. In conclusion, highly significant progress was made towards the implementation of already established cellular reprogramming technologies, as well as the designing of new innovative ones. Reprogramming into pluripotency and lineage conversion methodologies were applied to ultimately generate RPE cells. These studies open new avenues for the establishment of cell replacement therapies and, more straightforwardly,raise the possibility of modelling retinal degenerations with underlying RPE defects in apetri dish, particularly CHM.
Resumo:
RESUMO: O cancro colo-rectal (CCR) um dos cancros que possui maior taxa de mortalidade a nvel mundial. Em Portugal esta patologia responsvel pela morte de cerca de 3700 pessoas por ano, sendo que estes nmeros aumentam de ano para ano. Ao longo das ltimas dcadas o papel das alteraes genticas na etiologia das patologias oncolgicas tem vindo a ter cada vez mais um maior destaque. O nmero de estudos que avaliam a importncia de polimorfismos, mutaes, alteraes na regulao gnica e interaces entre genes no desenvolvimento destas patologias tem aumentado exponencialmente. Com o aumento do conhecimento da forma como estas alteraes influenciam o desenvolvimento do cancro surgiram os primeiros meios de diagnstico gentico, levando assim a uma alterao da forma como so encarados o diagnstico e a preveno destas doenas. No CCR as formas hereditrias com alteraes genticas inequivocamente identificadas representam apenas 5% dos casos. Existem cerca de 25% que representam formas hereditrias para as quais ainda no foram estabelecidos os padres de alteraes genticas subjacentes. Desta forma, estudos que venham contribuir para um maior conhecimento dos mecanismos moleculares responsveis pelo aumento da susceptibilidade dos indivduos para o desenvolvimento de CCR so extremamente importantes. O CCR uma patologia multifactorial, onde factores genticos interagem com factores ambientais no surgimento e desenvolvimento da doena. Assim, torna-se essencial integrar o estudo das alteraes genticas no contexto ambiental onde os indivduos em estudo se encontram. No caso desta patologia um dos principais factores ambientais estudado a nutrio. Vrios estudos tm sido realizados ao longo dos ltimos anos de forma a compreender como pode a ingesto dos nutrientes influenciar o desenvolvimento de CCR e de que forma interage com as alteraes genticas individuais. O ciclo do folato um dos processos metablicos onde o papel da nutrio em interaco com alteraes genticas mais tem sido estudado nos ltimos anos. Deste cruzamento entre o estudo das alteraes genticas e ambientais surge a Nutrigentica. O conjunto de estudos da presente tese tem como objectivo aumentar o conhecimento do papel das alteraes em genes do ciclo do folato, em interaco com factores nutricionais e de estilo de vida, no s no desenvolvimento de CCR, mas tambm de outra patologia do tracto gastrointestinal, a Doena de Crohn (DC), uma doena inflamatria muitas vezes associada como factor de risco para o desenvolvimento de CCR. Este estudo debruou-se essencialmente no estudo dos genes timidilato sintetase (TYMS) e metionina sintetase (MTR) em populaes com CCR e DC, bem como no padro nutricional destas populaes com particular incidncia nos nutrientes envolvidos no ciclo do folato (folato, metionina, vitamina B6, vitamina B12). Analisando o conjunto de resultados obtidos para os estudos do CCR podemos concluir que quer a TYMS quer a MTR possuem um papel relevante na susceptibilidade para desenvolver esta patologia, assim como tm destaque no funcionamento do ciclo celular durante o processo oncognico. Os resultados demonstram que os factores que levam a uma menor disponibilidade de grupos metil no ciclo de folato (baixos nveis de folato, alterao da actividade de MTR, elevada expresso de TYMS) constituem factores de risco, muito provavelmente por contriburem para uma desregulao dos nveis de metionina disponvel para a metilao do DNA da célula. Demonstram ainda que em células tumorais ocorrem alteraes na regulao do ciclo do folato de forma a favorecer a sntese de DNA em detrimento da metilao do mesmo, alterando para isso a expresso dos genes de forma a que o fluxo de grupos metil provenientes do folato sejam encaminhados para a enzima TYMS. O polimorfismo de deleo 6pb da TYMS surge como um factor de diagnstico e de prognstico de CCR para a populao portuguesa. Dos factores nutricionais analisados apenas o folato aparenta ter um papel relevante na modelao do risco de desenvolver CCR. Na doena de Crohn (DC) podemos verificar que a homocistena e o seu metabolismo podero contribuir para o aparecimento e desenvolvimento da patologia. O aumento da homocistena poder ser o responsvel por um aumento da resposta auto-imune do organismo, promovendo o aparecimento da DC. O polimorfismo A2756G MTR desempenha um papel preponderante como factor de diagnstico da DC, tendo sido associado pela primeira vez a esta patologia. Tem tambm um papel importante no desenvolvimento da doena, uma vez que est associado a uma idade de diagnstico mais baixa, sugerindo assim que o desenvolvimento da doena ocorre de forma mais precoce. Concluindo, com este estudo pensamos ter contribudo para um melhor entendimento do papel do ciclo do folato no desenvolvimento de CCR e DC, sendo um ponto de partida para futuras investigaes que possam revelar cada vez melhor as complexas interaces metablicas desta via e a sua influncia nas patologias estudadas. Do nosso estudo destacamos a importncia de uma anlise global das vrias etapas do ciclo do folato para que se possa compreender a dinmica que se estabelece no desenvolvimento destas patologias, podendo diversas alteraes, quer a nvel gentico quer a nvel nutricional, exercerem efeitos diferentes consoante o estado dos restantes intervenientes do ciclo do folato. Acreditamos que no futuro este estudo permitir que o conhecimento do ciclo do folato tenha cada vez mais uma relevncia fundamental a nvel de diagnstico e teraputica destas patologias.------------ ABSTRACT: Colorectal Cancer (CRC) is one of the cancers that have a higher rate of mortality worldwide. In Portugal this pathology is responsible for the deaths of about 3700 people per year, and these numbers increase each year. Over the past few decades the role of genetic changes in the etiology of oncological pathologies has had an increasingly greater emphasis. The number of studies that evaluate the importance of polymorphisms, mutations, changes in gene regulation and gene interactions in the development of these diseases has increased exponentially. With the increased knowledge of how these changes influence the development of cancer, appeared the first means for genetic diagnostic, leading to a change in the way diagnosis is seen and in the prevention of these diseases. In CRC the hereditary forms with clearly identified genetic changes represent only 5% of cases. There are about 25% representing hereditary forms for which the patterns of genetic changes havent been established. In this way, studies that will contribute to a greater understanding of the molecular mechanisms responsible for increased susceptibility of individuals to the CRC development are extremely important. CRC is a multifactorial pathology, where genetic factors interact with environmental factors in the emergence and development of the disease.Thus, it is essential to integrate the study of genetic changes in the environmental context of the individuals under study. In the case of this pathology one of the main environmental factors studied is nutrition. Several studies have been conducted over the past few years in order to understand how the intake of nutrients can influence the development of CRC and how nutrients interact with the individual genetic changes. The folate cycle is one of the metabolic processes where the role of nutrition in interaction with genetic alterations has been studied in recent years. This cross between the study of genetic and environmental changes developed Nutrigenetics. The set of studies of this thesis aims to increase awareness of the role of changes in genes of the folate cycle, in interaction with nutritional factors and lifestyle, not only in the development of CRC, but also of another pathology of the gastrointestinal tract, Crohn's disease (CD), an inflammatory disease often associated as a risk factor for the development of CRC. This study dealt mainly in the study of genes thymidylate synthase (TYMS) and methionine synthase (MTR) in populations with CRC and CD, as well as in the nutritional pattern of these populations with particular focus on nutrients involved in the folate cycle (folate, methionine, vitamin B6, vitamin B12). Analyzing the results obtained for the CRC studies we conclude that either the MTR TYMS have a relevant role in susceptibility to develop this pathology, and have an important role in the functioning of the cell cycle during oncogenesis. The results show that the factors that lead to a lower availability of methyl groups in folate cycle (low levels of folate, change the activity of MTR, high expression of TYMS) constitute risk factors, most likely by contribute to a dysregulation of methionine levels available for DNA methylation of the cell. Our results also demonstrate that in tumor cells occur changes in the regulation of the folate cycle in order to promote the synthesis of DNA, to the detriment of methylation of the same by changing the expression of genes so that the methyl groups from folate are forwarded to the TYMS enzyme reaction. The deletion polymorphism 6bp of TYMS emerges as a diagnostic and prognostic factor of CCR for the Portuguese population. Nutritional factors analyzed only folate appears to have a major role in modulating the risk of developing CCR.In Crohns disease (CD) we can check that homocysteine and its metabolism may contribute to the emergence and development of this pathology. Increased homocysteine may be responsible for an increase in the body's autoimmune response, promoting the emergence of CD. The polymorphism A2756G MTR plays a leading role as a factor of diagnosis of DC, having been associated with this pathology for the first time. It also has an important role in the development of the disease, since it is associated with a lower diagnostic age, suggesting that the development of the disease occurs earlier. In conclusion, our study has contributed to a better understanding of the role of folate cycle in the development of CRC and CD, being a starting point for future research that may prove increasingly complex metabolic interactions in this via and its influence on the pathologies studied. In our study we highlight the importance of a comprehensive analysis of the various steps of the folate cycle in order to understand the dynamics that settles in the development of these pathologies, and a number of amendments, whether at the genetic level or at the nutritional level, exercise different effects depending on the stage of the remaining participants in the folate cycle. We believe that in the future this study will allow the knowledge of folate cycle to have increasingly a fundamental relevance at the level of diagnosis and treatment of these diseases.
Resumo:
Segundo a Organizao Mundial da Sade (OMS), as doenas cardiovasculares (DCV) so a principal causa de morte nos pases desenvolvidos. H uma necessidade urgente de mtodos eficazes para a deteco precoce de doenas cardiovasculares, devido falta de factores de risco convencionais. Os nveis elevados de homocistena (Hcy) no sangue, homocisteinemia, so um factor de risco independente bem estabelecido para DCV. De acordo com alguns autores, a converso metablica de Hcy no metabolito txico Hcy-Tl e subsequente N-homocisteinilao de protenas induz a agregao e a formao de amiloide, contribuindo assim para a alteraes praterognicas no sistema cardiovascular. A enzima associada lipoprotena de alta densidade (HDL), paraoxonase 1 (PON1), capaz de hidrolisar o metabolito txico Hcy-Tl de volta a Hcy no soro humano, como observado em estudos recentes que indicam o papel de patognese em DCV da hPON1. As paraoxonases de soro (PON1, PON2 e PON3) so hidrolases dependentes de clcio, que pertencem a uma famlia de enzimas que exibem propriedades antioxidantes e anti-inflamatrias. Foram identificadas trs actividades catalticas principais para PON1: (i) actividade paraoxonase, que corresponde converso hidroltica de paraoxon em p-nitrofenol e a dietil fosfato, (ii) a actividade arilesterase que promove a hidrlise de steres aromticos, e a (iii) actividade de lactonase, que catalisa a hidrlise de Hcy a Hcy-Tl, sendo considerada a actividade principal da PON1. Vrios estudos tm relacionado estas actividades enzimticas a diversas patologias, o que sugere a sua potencial utilidade no diagnstico clnico. Neste trabalho pretende-se desenvolver um novo mtodo electroqumico para a deteco fcil do substrato e produto resultantes da hidrlise enzimtica de paraoxon pela hPON1. Utilizando uma célula electroqumica constituda por um elctrodo de referncia Ag /AgCl., um contra-elctrodo de Pt e um electrodo de trabalho de carbono vtreo, o paraoxon e p-nitrofenol foram detectados simultaneamente por voltametria de onda quadrada, numa janela de potencial de [-0,3;-1,2] V. Os resultados dos ensaios com a enzima testada a pH 7,6 e 37C, na presena de paraoxon e utilizando plasma humano como uma fonte de PON1 sero discutidos. Usando a mesma composio de célula electroqumica, Hcy e Hcy-Tl foram estudados utilizando diferentes interfaces e tipos de tratamento para testar a melhor maneira possvel de deteco das duas espcies na mesma experincia electroqumica.
