Biologia do gene pheA de Mycobacterium tuberculosis : clonagem, seqüenciamento e superexpressão do seu produto - a proteína prefenato desidratase

A Tuberculose (TB) é a principal causa de óbitos entre as doenças infecciosas causadas por um único agente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) o agente etiológico da TB no homem, o complexo Mycobacterium (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) é responsável por cerca de 8 milhões de novas infecções e 3 milhões de mortes a cada ano no mundo. No começo da década de 80, a reemergência da TB em países em desenvolvimento deve-se à crescente incidência do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), à falta de recursos para o tratamento desta doença e à proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB). Esta situação criou a necessidade da busca por novos agentes antimicobacterianos capazes de reduzir o tempo de tratamento, melhorar a adesão dos pacientes ao mesmo e ser efetiva contra cepas MDR-TB. A via do chiquimato leva à biossíntese do corismato, o precursor de aminoácidos aromáticos, tirosina, triptofano e fenilalanina. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina envolve a conversão de corismato a prefenato, catalisada pela corismato mutase. A segunda reação na biossíntese de fenilalanina é a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato, catalisada pela prefenato desidratase. Embora ausente em mamíferos, esta via está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitos do Phyllum Apicomplexa. Esta rota é essencial em M. tuberculosis e, portanto, suas enzimas representam alvos potenciais para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O objetivo deste trabalho foi estudar o gene pheA da linhagem de M. tuberculosis H37Rv e seu produto, a enzima prefenato desidratase Para isso, DNA genômico de M. tuberculosis H37RV foi extraído e o gene pheA foi amplificado pela técnica de PCR, clonado no vetor de expressão pET-23a(+), seqüenciado e superexpresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados obtidos confirmaram a região predita para o gene pheA, que foi amplificado com sucesso, mostrando 963 pb, sendo que a presença de 10% dimetil sulfoxido (DMSO) mostrou ser essencial para permitir a desnaturação do DNA rico em bases G-C. Análise da seqüência nucleotídica pelo método de Sanger confirmou a identidade do gene clonado e demonstrou que nenhuma mutação foi introduzida pelos passos de PCR e clonagem. A enzima prefenato desidratase foi superexpressa em células de E. coli BL21(DE3) eletroporadas com pET-23a(+)::pheA. Análise por SDS-PAGE mostrou expressão significativa de uma proteína com aproximadamente 33kDa, estando de acordo com a massa molecular esperada para a prefenato desidratase. A proteína recombinante foi superexpressa sem a adição de IPTG, e a presença da proteína pôde ser detectada em todos os intervalos de tempo testados (6, 9 e 24 horas depois da OD600nm alcançar o valor de 0,5). Foi realizado ensaio enzimático com a prefenato desidratase de acordo com Gething et al. (1976) utilizando prefenato de bário como substrato e coeficiente de extinção molar de 17.500 a 320 nm para calcular a concentração de fenilpiruvato. Houve um aumento de 1766 vezes na atividade específica da prefenato desidratase no extrato bruto da proteína recombinante em relação ao controle, no qual o vetor pET23a(+) sem o gene pheA foi introduzido em células de E. coli BL21(DE3).

Investigation of flat spectrum radio sources by the interplanetary scintillation method at 111 MHz

Abstract. Interplanetary scintillation observations of 48 of the 55 Augusto et al. (1998) flat spectrum radio sources were carried out at 111 MHz using the interplanetary scintillation method on the Large Phased Array (LPA) in Russia. Due to the large size of the LPA beam (1◦ × 0.5◦) a careful inspection of all possible confusion sources was made using extant large radio surveys: 37 of the 48 sources are not confused. We were able to estimate the scintillating flux densities of 13 sources, getting upper limits for the remaining 35. Gathering more or improving extant VLBI data on these sources might significantly improve our results. This proof-of-concept project tells us that compact (<1 ) flat spectrum radio sources show strong enough scintillations at 111 MHz to establish/constrain their spectra (low-frequency end). Key words. galaxies: general – galaxies: active – galaxies: quasars: general

Relatório de estágio de educação física realizado na Escola Secundária de Francisco Franco

O Estágio Pedagógico (EP) pretende capacitar-nos para uma melhor compreensão dos fenómenos que ocorrem, sob as mais diversas formas e em tempos e modos muitas vezes incontroláveis, no universo da Escola. Procurar intervir nesse mundo exige a busca permanente de sínteses entre as competências de diferentes matrizes, adquiridas ao longo da Licenciatura, Mestrado e demais processo formativo, e a realidade objetiva resultante de componentes tão distintas como são, em primeiro lugar, os alunos e as suas características, a escola e as suas dinâmicas, o grupo profissional e os seus posicionamentos, etc. Nesse sentido, as sínteses alcançadas em cada momento constituem a base de operacionalização das aprendizagens obtidas em ciclos anteriores, as quais agora estão em confronto imediato com uma escola real e com a necessidade de intervir adequada e criticamente junto dos destinatários da nossa ação, procurando pôr ordem numa série de recursos humanos, temporais, materiais e espaciais, sendo suposto que, no final, a nossa intervenção pessoal e profissional se tenha desenvolvido e consolidado. Por todas estas razões, o presente relatório apresenta o trabalho desenvolvido no âmbito do EP e uma reflexão sobre as experiências percorridas ao longo do ano letivo. Ficam assim registadas algumas potencialidades e constrangimentos experimentados num processo de grande complexidade mas de extrema importância nesta fase determinante de desenvolvimento de competências que se pretendem úteis e duradouras. O EP englobou um conjunto de atividades de caráter curricular, de complemento curricular e de natureza científico-pedagógica plasmadas neste relatório com o intuito de clarificar a intencionalidade de cada uma delas, revelar estratégias de intervenção adotadas e apresentar as conclusões possíveis (que não definitivas).

Caracterização biométrica e acúmulo de nutrientes em porta-enxertos de caramboleira cultivada em solução nutritiva

O conhecimento sobre o crescimento e o acúmulo de nutrientes em hipobiotos de caramboleira permite melhor eficiência da adubação na produção de hipobiotos (porta-enxertos). Objetivou-se determinar o crescimento e o acúmulo de nutrientes em hipobiotos de caramboleira cultivada em solução nutritiva. O experimento constituiu de cinco tratamentos, referentes aos tempos de coleta 25; 50; 75; 100 e 125 dias após o transplantio, dispostos em delineamento inteiramente casualizado em seis repetições. As plantas utilizadas foram obtidas de sementes de frutos de caramboleira 'Malásia', cultivadas em vasos com solução nutritiva. Nos diferentes órgãos dos hipobiotos (folhas, caule e raízes), avaliou-se o crescimento e o acúmulo de nutrientes e os índices nutricionais, a cada 25 dias. O ponto de enxertia (6 mm) foi atingido aos 110 dias após o transplantio. A ordem decrescente dos nutrientes acumulados em cada hipobioto produzido é de (em mg por planta): N = 634; K = 368; Ca = 152; Mg = 106; S = 98; P = 88 (em µg por planta) de: Fe = 2.963; Mn = 2.165; B = 722; Zn =780, e Cu = 96. O acúmulo médio de nutrientes é maior nas folhas > caule = raízes. O período de maior exigência de nutrientes pelos hipobiotos é compreendido entre 25-75 dias após o transplantio. As diferentes taxas de acumulação líquida dos nutrientes, nas diferentes partes da caramboleira, nem sempre acompanham a taxa de acumulação de nutrientes do respectivo órgão.

Artificial fertilization of oocytes and sperm activation in pacu: effects of the spermatozoa:oocyte ratio, water volume, and in natura semen preservation

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Product functions: interfaces with ergonomic design

In addition to technical quality, increasing emphasis is being placed on the importance of elements such as the appearance and meaning of products. To be successful, therefore, attention must be paid to the aesthetic and symbolic functions of objects as well as to reliability and physical quality. Study of the interfaces of these functions may provide a theoretical basis for the ergonomic design of products. The objective of this review is to attempt to establish the nature of these interfaces.

Equação de regressão linear múltipla para estimativa do erro experimental

Este trabalho teve por objetivo estimar equações de regressão linear múltipla tendo, como variáveis explicativas, as demais características avaliadas em experimento de milho e, como variáveis principais, a diferença mínima significativa em percentagem da média (DMS%) e quadrado médio do erro (QMe), para peso de grãos. Com 610 experimentos conduzidos na Rede de Ensaios Nacionais de Competição de Cultivares de Milho, realizados entre 1986 e 1996 (522 experimentos) e em 1997 (88 experimentos), estimaram-se duas equações de regressão, com os 522 experimentos, validando estas pela análise de regressão simples entre os valores reais e os estimados pelas equações, com os 88 restantes, observando que, para a DMS% a equação não estimava o mesmo valor que a fórmula original e, para o QMe, a equação poderia ser utilizada na estimação. Com o teste de Lilliefors, verificou-se que os valores do QMe aderiam à distribuição normal padrão e foi construída uma tabela de classificação dos valores do QMe, baseada nos valores observados na análise da variância dos experimentos e nos estimados pela equação de regressão.

Caracterização morfológica e química de frutos de rambutan

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Soil, water and nutrient losses by interrill erosion from green cane cultivation

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Plantas de cobertura em pré-safra e adubação nitrogenada na fertilidade do solo em diferentes camadas, cultivado com milho em sistema de plantio direto e convencional

The species of cover crops in pre-harvest of maize crop may influence the soil chemical properties. The objective was to evaluate soil fertility due to the use of plant species cover, previously cultivated with maize crop in no-tillage and conventional and subjected to nitrogen. The experiment was conducted at UNESP in Jaboticabal-SP, in an Oxisol clay during the crop years 2000/01, 2001/02 and 2002/03. The experimental design was randomized blocks in split plots with four replications. The treatments consisted of nitrogen (0, 60 and 120 kg N ha(-1)) and planting systems, and three under no-tillage system with the use of cover crops: Brachiaria, millet, Crotalaria and lablab, and under a conventional tillage. We evaluated at the flowering stage of corn, covering the crop year 2002-2003, the chemical soil layers (0-0.05, 0.05-0.10, 0.10-0.20; 0.20-0.30 m deep). Tillage systems and nitrogen levels influenced differently to the chemical properties of soil layers studied. Regardless of the nitrogen used in the conventional treatment showed lower organic matter content, calcium and value of sum of bases in the topsoil.

A novel system for large-scale gene expression analysis: bacterial colonies array

In the present work, we report the use of bacterial colonies to optimize macroarray technique. The devised system is significantly cheaper than other methods available to detect large-scale differential gene expression. Recombinant Escherichia coli clones containing plasmid-encoded copies of 4,608 individual expressed sequence tag (ESTs) were robotically spotted onto nylon membranes that were incubated for 6 and 12 h to allow the bacteria to grow and, consequently, amplify the cloned ESTs. The membranes were then hybridized with a beta-lactamase gene specific probe from the recombinant plasmid and, subsequently, phosphorimaged to quantify the microbial cells. Variance analysis demonstrated that the spot hybridization signal intensity was similar for 3,954 ESTs (85.8%) after 6 h of bacterial growth. Membranes spotted with bacteria colonies grown for 12 h had 4,017 ESTs (87.2%) with comparable signal intensity but the signal to noise ratio was fivefold higher. Taken together, the results of this study indicate that it is possible to investigate large-scale gene expression using macroarrays based on bacterial colonies grown for 6 h onto membranes.

Períodos de interferência de uma comunidade de plantas daninhas na cultura da batata

Objetivou-se neste trabalho avaliar diferentes períodos de controle e de convivência de uma comunidade de plantas daninhas na cultura da batata 'Atlantic'. O experimento foi realizado no município de Botucatu-SP, e o delineamento experimental utilizado foi de blocos ao acaso com quatro repetições. Os tratamentos constituíram-se de seis períodos de controle, nos quais a cultura foi mantida livre da comunidade de plantas daninhas e após cada período, as plantas daninhas foram deixadas crescer livremente; e de seis períodos de convivência, nos quais a cultura foi mantida na presença da comunidade de plantas daninhas e após cada período, as plantas daninhas foram eliminadas até a colheita. Os períodos foram de 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias após o plantio dos tubérculos, além de uma testemunha mantida sempre livre de plantas daninhas e outra mantida sempre na presença dessas plantas. Foram identificadas 9 famílias e 15 espécies de plantas daninhas, com destaque para Bidens pilosa, Galinsoga parviflora,Brachiaria plantaginea,Commelina benghalensis e Digitaria horizontalis. Os resultados de produção de tubérculos ajustaram-se ao modelo de regressão não-linear: y = 8,907+(17,722/[1+(x/16,865)-8,412]), (R² = 0,963*) - equação para os períodos de controle e y = 5,728+(24,789/[1+(x/39,292)2,247 ]), (R² = 0,947*) - equação para os períodos de convivência. Assim, considerando perda de 5% na produtividade como aceitável, foram determinados o período anterior à interferência (PAI), que foi de 20 dias; o período total de prevenção à interferência (PTPI), de 21 dias; e o período crítico de prevenção da interferência (PCPI), de apenas de um dia, dos 20 aos 21 dias após o plantio dos tubérculos.

Tratamento de água de produção de petróleo visando o aproveitamento na obtenção de barrilha

The petroleum production is associated to the produced water, which has dispersed and dissolved materials that damage not only the environment, but also the petroleum processing units. This study aims at the treatment of produced water focusing mainly on the removal of metals and oil and using this treated water as raw material for the production of sodium carbonate. Initially, it was addressed the removal of the following divalent metals: calcium, magnesium, barium, zinc, copper, iron, and cadmium. For this purpose, surfactants derived from vegetable oils, such as coconut oil, soybean oil, and sunflower oil, were used. The investigation showed that there is a stoichiometric relationship between the metals removed from the produced water and the surfactants used in the process of metals removal. It was also developed a model that correlates the hydrolysis constant of saponified coconut oil with the metal distribution between the resulting stages of the proposed process, flocs and aqueous phases, and relating the results with the pH of the medium. The correlation coefficient obtained was 0.963. Next, the process of producing washing soda (prefiro soda ahs ou sodium carbonate) started. The resulting water from the various treatment approaches from petroleum production water was used. During this stage of the research, it was observed that the surfactant assisted in the produced water treatment, by removing some metals and the dispersed oil entirety. The yield of sodium carbonate production was approximately 80%, and its purity was around 95%. It was also assessed, in the production of sodium carbonate, the influence of the type of reactor, using a continuous reactor and a batch reactor. These tests showed that the process with continuous reactor was not as efficient as the batch process. In general, it can be concluded that the production of sodium carbonate from water of oil production is a feasible process, rendering an effluent that causes a great environmental impact a raw material with large scale industrial use

Antitumoral, mutagenic and (anti)estrogenic activities of tingenone and pristimerin

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Modelo de Ashkin-Teller anisotrópico: uma abordagem por grupo de renormalização

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior