O desenvolvimento de culturas tolerantes ao herbicida diclorofenoxiacetato: revisão de literatura

O composto diclorofenoxiacetato (2,4-D) foi o primeiro herbicida orgânico, sistêmico, seletivo e de aplicação em pós-emergência desenvolvido no mundo. Juntamente com a revolução verde, ele contribuiu para elevar a produção dos cereais nas décadas posteriores a 1950. Esse produto é uma auxina sintética que pode ser utilizada como regulador do crescimento vegetal ou, ainda, como herbicida para o controle de espécies daninhas dicotiledôneas. Várias espécies infestantes dicotiledôneas que apresentam dificuldade de controle com outros herbicidas são suscetíveis ao 2,4-D. Contudo, a utilização desse herbicida fica restrita pela falta de seletividade em algumas culturas agrícolas. Nas últimas décadas, a descoberta de genes relacionados à tolerância ao 2,4-D em bactérias encontradas no solo e a sua transferência para culturas possibilitaram o desenvolvimento de linhagens tolerantes ao produto. Os objetivos desta revisão de literatura foram apresentar os genes e a atividade das enzimas responsáveis pela tolerância ao herbicida 2,4-D; ilustrar os mecanismos envolvidos na seletividade ao 2,4-D e a outros herbicidas; e equacionar algumas implicações para o manejo de plantas daninhas. O primeiro gene de tolerância ao 2,4-D descoberto foi o tfdA, encontrado no plasmídeo pJP4 da bactéria Cupriavidus necator. Este gene codifica a enzima 2,4-D/oxoglutarato dioxigenase, a qual realiza a conversão do 2,4-D em 2,4-diclorofenol e glioxilato. No final da década de 1980, foi realizada a primeira inserção do gene tfdA em plantas de Nicotiana tabacum, mediada por Agrobacterium tumefaciens. Isso conferiu tolerância de plantas de fumo ao 2,4-D. Resultados similares foram obtidos com inserções posteriores deste gene em plantas de Gossypium hirsutum, Brassica juncea e Vitis vinifera. Com a continuidade dos estudos de bactérias de solo, identificaram-se outros dois genes: o gene rdpA de Sphingobium herbicidivorans MH, que codifica a enzima ariloxialcanoato dioxigenase-1 (AAD-1); e o sdpA de Delftia acidovorans MC1, que codifica a enzima ariloxialcanoato dioxigenase-1(AAD-12). Essas duas enzimas são similares, mas têm cinética enzimática diferenciada e são capazes de degradar o 2,4-D e outros herbicidas. A enzima AAD-1 degrada o 2,4-D e, surpreendentemente, alguns herbicidas inibidores da acetil-CoA carboxilase (ACCase) do grupo dos ariloxifenoxipropionatos (FOPs). A enzima AAD-12 apresenta alta afinidade de ligação com os auxínicos 2,4-D, MCPA, triclopyr e fluroxypyr. Atualmente os genes que codificam estas enzimas estão sendo utilizados para o desenvolvimento de cultivares de soja, algodão e milho tolerantes ao 2,4-D e FOPs. Plantas de soja com o transgene sdpA se mostraram tolerantes ao 2,4-D. Plantas de milho contendo o gene rdpA também são tolerantes aos herbicidas FOPs. Trabalhos realizados com as espécies daninhas Conyza bonariensis, Conyza canadensis e Amaranthus palmeri resistentes ao herbicida glyphosate têm mostrado controle adequado com o 2,4-D. Portanto, os genes sdpA e rdpA são bons candidatos no desenvolvimento de culturas tolerantes ao 2,4-D e deverão ampliar as opções de controle de espécies daninhas de difícil manejo com outros herbicidas.

Ensaio in vitro da enzima nitrato redutase e efeito da disponibilidade de nitrato e fosfato em variantes pigmentares de Hypnea musciformis (Wulfen) J. V. Lamour. (Gigartinales, Rhodophyta)

A enzima nitrato redutase (NR) catalisa a redução do nitrato a nitrito e controla a taxa de assimilação do nitrato. O ensaio in vitro da nitrato redutase foi otimizado para a linhagem selvagem (marrom, MA) e para a linhagem deficiente em ficoeritrina (verde-clara, VC) de Hypnea musciformis. As duas linhagens foram cultivadas em temperatura de 23 ± 2°C, fotoperíodo de 14 horas, irradiância de 60-90µmol fótons m-2s-1, e meio composto por água do mar esterilizada (30ups) enriquecida com a solução de von Stosch na concentração de 50% (VSES/2). As condições ótimas de ensaio para ambas as linhagens foram: 40µM de NADH; 10min de incubação do extrato bruto (EB) e 100µL de EB. A atividade ótima da NR ocorreu em 4 e 2mM de nitrato para a linhagem VC e MA, respectivamente. As linhagens VC e MA apresentaram, respectivamente, constante aparente de Michaelis-Menten (K M) para NADH de 0,2068 e 0,0837 µM, e K M para nitrato de 0,0492 e 0,0294mM. Os resultados indicam que a NR da linhagem MA tem maior afinidade pelo substrato do que a NR da linhagem VC de H. musciformis. Os experimentos para avaliar os efeitos da disponibilidade de nitrato (5 a 105µM) e nitrato e fosfato (0,5 a 25,5µM, com a relação N:P de 4:1) mostraram que a atividade da NR das linhagens VC e MA não aumentou com a adição de nitrato no meio, o que pode estar relacionado com o estado nutricional dessas algas. A atividade da NR foi maior nos tratamentos com adição de fosfato do que naqueles com adição de apenas nitrato, indicando que esse nutriente é importante para os processos metabólicos relacionados a atividade da NR.

Purificação da enzima polifenoloxidase (PFO) de polpa de pinha (Annona squamosa L.) madura

A PFO (EC 1.10.3.2) extraída de polpa de pinha madura (Annona squamosa L.), foi parcialmente purificada por fracionamento em sulfato de amônio a 80% e purificada 411 (Fração I) e 118 (Fração II) vezes após cromatografia em coluna de troca iônica em DEAE-Toyopearl 650M, e 566 vezes em coluna de Toyopearl HW55F. A enzima da fração mais ativa foi caracterizada bioquimicamente. Quanto aos parâmetros cinéticos, a enzima apresentou valores de Km e Vmax de 7,14mM e 302,0 unidades/min/ml para catecol e 25,0mM e 180,2 unidades/min/ml para L-dopa respectivamente, substratos que demonstraram maior especificidade. O peso molecular foi estimado em 90.700 daltons através de filtração em gel Sephadex G-200. O teor de cobre da enzima purificada encontrado foi de 11ppm/peso da amostra liofilizada. Quanto à composição de aminoácidos, a PFO apresentou maiores teores de ácido aspártico, ácido glutâmico e lisina e menores teores de metionina, arginina e tirosina, com ausência de cisteína.

Otimização das condições de cultivo para a produção de amilases pelo termofílico Bacillus sp. e hidrólise de amidos pela ação da enzima

A otimização das condições de cultivo para a produção de α-amilase por um termofílico Bacillus sp. cepa SMIA-2 foi realizada. Além disso, a hidrólise enzimática do amido, proveniente de várias fontes tais como batata, mandioca e milho, foi também investigada. A produção de α-amilase por Bacillus sp. SMIA-2, cultivado em meio líquido contendo amido (5 g.L-1) como fonte de carbono e suplementado com 0,5 g.L-1 de proteínas do soro de leite e 2 g.L-1 de peptona, alcançou o máximo em 32 horas com níveis de 37 U.mL-1. O microrganismo foi capaz de utilizar diversas fontes de carbono, porém a atividade da amilase variou com cada fonte. O amido foi a melhor fonte de carbono para a secreção da amilase, enquanto a sacarose, lactose, maltose, galactose e glicose não foram muito efetivas. Uma redução na concentração de amido de até 2,5 g.L-1 no meio de cultura melhorou o crescimento do organismo e a atividade enzimática. Em altas concentrações de amido, a produção da enzima foi comparativamente menor. Em relação às fontes de nitrogênio orgânico e inorgânico, a peptona (2 g.L-1) foi considerada a melhor. Considerando a quantidade de proteínas do soro de leite no meio de cultivo, a concentração de 0,25 g.L-1 foi considerada a mais efetiva para a secreção da α-amilase pelo microrganismo. A produção máxima da atividade enzimática foi observada a 50 °C e pH 8,5. A enzima foi capaz de degradar todos os amidos testados. A hidrólise do amido de batata resultou num alto rendimento de açúcares redutores em comparação às outras fontes de amido. Amido solúvel e amido de mandioca ocuparam, respectivamente, a segunda e terceira posição em relação à liberação dos açúcares redutores, enquanto que a amilase estudada mostrou apenas uma ligeira afinidade pelo amido de milho. Com o aumento da temperatura da reação para 70 °C, a hidrólise dos substratos, com exceção do amido solúvel, resultou em maiores quantidades de açúcares redutores.

Estudo cinético da obtenção de ésteres utilizando enzima lipozyme TL IM como catalisador

Nesse trabalho foi estudada a produção do éster alifático octanoato de n-pentila por esterificação direta usando a enzima Lipozyme TL IM como catalisador, sendo esse éster usado como aroma na indústria de alimentos. Foi verificada a influência da concentração inicial de substratos na velocidade inicial da reação, sendo esta determinada através do consumo de ácido octanoico ao longo do tempo. Modelos cinéticos clássicos descritos na literatura não se ajustaram bem aos dados experimentais. A máxima velocidade da reação foi alcançada a 40 ºC. A enzima Lipozyme TL IM sofre inibição por substrato

Citocinas e quimiocinas no transplante renal

O transplante renal é a melhor modalidade de terapia renal substutiva até o momento. Infelizmente, a sobrevida do enxerto é interrompida pelos episódios de rejeição aguda ou mesmo de fibrose intersticial/atrofia tubular. A dosagem de quimiocinas e citocinas urinárias como ferramenta alternativa para o diagnóstico dessas complicações tem sido relatada nos últimos anos. Estas substâncias estão sabidamente relacionadas com os mecanismos imunoinflamatórios do transplante renal, podendo ser detectadas no tecido renal, no plasma e na urina de pacientes transplantados. Drogas anti-inflamatórias, inibidores do sistema renina angiotensina e alguns antagonistas de receptores de citocinas, ainda utilizados em nível experimental, podem interferir com a expressão desses mediadores do sistema imune e, por conseguinte, alterar a evolução do transplante renal. Neste sentido, pretende-se neste artigo fazer uma revisão dos estudos sobre a mensuração de citocinas/quimiocinas e dos seus receptores na urina, no plasma e no tecido renal de pacientes transplantados, no intuito de avaliar uma possível associação entre os níveis desses mediadores e as complicações do transplante renal e sobrevida do enxerto.

Determinação de inibidores da germinação no espermoderma de sementes de café (Coffea arabica L.)

Sementes de café apresentam germinação lenta, aumentando consequentemente o período de formação das mudas. A causa dessa germinação lenta, ainda não está elucidada. Aparentemente, a difusão de gases e da água tem papel secundário comparadas ao efeito de inibidores presentes. A presente pesquisa foi desenvolvida no Setor de Sementes do Departamento de Agricultura e no Laboratório de Química da Universidade Federal de Lavras. Em uma pesquisa preliminar, utilizando sementes de alface como indicadora de inibidores e extrato aquoso de espermoderma ("película prateada"), ficou evidenciada a presença de inibidores nesse tecido. Em uma segunda etapa o extrato aquoso da película prateada foi submetido a um fracionamento, em teste in vitro. Observou-se, por meio desse teste, que a fração ativa encontrava-se na fase metanólica, a qual foi concentrada sob vácuo e eluída através de coluna de sílica gel com metanol, água destilada e HCl 0,1M. Após concentração sob vácuo da fração ativa originou-se um sólido branco, que se mostrou homogêneo segundo análise por cromatografia em camada fina com placas de sílica gel. Por meio de análise de espectrometria de infravermelho, de massas e de ressonância magnética nuclear de ¹H e de 13C, atribuiu-se a tal sólido a estrutura da cafeína. Conclui-se que o espermoderma pode contribuir para a lenta germinação das sementes de café, possivelmente devido à presença de cafeína.

Padrões eletroforéticos da enzima alfa-amilase em sementes de milho submetidas a alta temperatura de secagem

Importantes mudanças fisiológicas e bioquímicas têm sido estudadas em sementes de milho submetidas a alta temperatura de secagem. O objetivo dessa pesquisa foi avaliar o efeito da secagem a alta temperatura nos padrões eletroforéticos da enzima a -amilase em sementes de linhagens, de híbridos simples e respectivos recíprocos. As sementes foram colhidas com teor de água de aproximadamente 35% e secadas a 45º C. A qualidade fisiológica das sementes de cada material foi avaliada pelo teste de germinação e a enzima alfa-amilase foi extraída de sementes germinadas, em tampão Tris-HCl 0,2 M. Sementes das linhagens secadas à sombra foram utilizadas como testemunha. Os perfis isoenzimáticos para a alfa-amilase revelaram uma maior intensidade de banda para as sementes das linhagens e de híbridos tolerantes a alta temperatura de secagem. Para as linhagens tolerantes a alta temperatura de secagem nenhuma diferença foi observada na atividade da enzima nas sementes secadas à sombra e artificialmente, o que já não ocorreu para as linhagens intolerantes, para as quais maior atividade foi verificada para as sementes secadas naturalmente. Foram observadas ainda diferenças na atividade da enzima alfa-amilase em sementes híbridas e nas dos seus respectivos recíprocos.

Qualidade fisiológica de sementes de milho, feijão, soja e alface na presença de extrato de tiririca

A espécie Cyperus rotundus (tiririca) é perene e de difícil controle. Os órgãos subterrâneos dessa ciperácea produzem inibidores capazes de interferir na germinação e no crescimento de plântulas e de plantas de várias espécies, fenômeno chamado de alelopatia. A inibição na germinação de sementes pode estar associada à interferência de substâncias alelopáticas na atividade de enzimas chaves no processo de germinação. Nesse trabalho foi avaliada a qualidade fisiológica assim como a atividade de enzimas envolvidas no processo de germinação em sementes de milho, feijão, soja e alface submetidas ao extrato de bulbos de tiririca. As sementes foram germinadas em substrato contendo extrato de bulbos de tiririca, nas concentrações de 10 g L-1 e 100 g L-1 e água destilada. A avaliação da qualidade fisiológica foi feita por meio de testes de germinação e vigor. Avaliou-se a atividade das enzimas superóxido-dismutase e esterase para todas as espécies, catalase para as sementes de milho e feijão, peroxidase e endo-b-mananase para as de alface, glutamato-oxalacetato-transaminase e a-amilase para as de milho e glicose-6-fosfato-desidrogenase para as de soja. Observou-se uma diminuição da germinação das sementes de alface com o aumento da concentração do extrato, inibição da germinação das sementes de milho e de feijão quando submetidas ao extrato na concentração de 10 g L-1 e um estímulo da germinação de sementes de soja na presença do extrato na concentração de 10 g L-1 e uma inibição em extrato na concentração de 100 g L-1. Foi observada redução da atividade das enzimas superóxido-dismutase, endo-b-mananase, peroxidase e a-amilase com o aumento da concentração do extrato. Para glutamato-oxalacetato-transaminase e glicose-6-fosfato-desidrogenase observou-se aumento da atividade da enzima com o aumento da concentração do extrato, indicando a perda da qualidade das sementes. Para esterase foi verificada menor atividade da enzima nas sementes de alface submetidas à germinação em substrato contendo 100 g L-1 e em soja menor atividade dessa enzima foi observada nas concentrações de 0 e 100 g L-1. Para catalase, observou-se padrões diferenciados de bandas sob concentrações de 10 e 100 g L-1 para o milho. O extrato de bulbos de tiririca interfere na qualidade fisiológica na atividade das enzimas envolvidas no processo de germinação de sementes de milho, feijão, soja e alface.

Compostos fenólicos inibidores da germinação em sementes de mamão (Carica papaya)

Sementes de mamão germinam lenta e irregularmente, o que tem sido atribuído à presença da sarcotesta. O trabalho teve como objetivos avaliar o efeito inibitório de extratos de sarcotesta na germinação de sementes de alface e quantificar compostos fenólicos em sementes de mamão. Foram utilizados frutos de mamão do grupo Formosa, híbrido Tainung 01, colhidos em Maio e Setembro/2005, obtendo-se sementes com e sem sarcotesta que foram avaliadas quanto à germinação aos 15 e 30 dias após a semeadura. Realizou-se um bioensaio com sementes de alface, que foram colocadas para germinar em substrato umedecido com água e com soluções obtidas a partir de extrato da sarcotesta de sementes de mamão. Determinou-se, também, o conteúdo de compostos fenólicos nas diferentes estruturas destas (sarcotesta, esclerotesta, endosperma e embrião), utilizando-se o ácido tânico como padrão e para reação de coloração, o reagente Folin-Ciacalteau, com leitura em espectrofotômetro a 765 nm. Verificou-se que o extrato de sarcotesta inibe a germinação e o crescimento da raiz primária das plântulas de alface, devido à presença de compostos fenólicos. Maior quantidade destes compostos foi observada na esclerotesta das sementes de mamão, seguida da sarcotesta, sendo praticamente nula a presença de tais compostos no embrião e no endosperma. Sementes oriundas da colheita de Maio/2005 exibiram dormência, apresentando maior conteúdo de fenóis na sarcotesta quando comparadas às sementes obtidas de frutos colhidos em Setembro/2005, as quais não apresentaram dormência.

Frecuencia de deficiencia de la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en población de neonatos con ictericia del área metropolitana de Monterrey, N.L.

Tesis (Maestro en Ciencias con especialidad en Genética) UANL

Ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona em cães assintomáticos com doença mixomatosa valvular mitral

As doenças cardíacas são um achado frequente na prática clínica. Saber se pacientes assintomáticos com doença mixomatosa da válvula mitral necessitam ou não de medicação numa fase inicial da doença não é tarefa fácil. A ativação neuro-hormonal, apesar de ter um efeito benéfico compensatório a curto prazo, torna-se deletéria a longo prazo, sendo que para isso é necessária intervenção farmacológica para inibir a sua atividade O SRAA (sistema renina angiotensina aldosterona) tem importantes mecanismos patofisiológicos implicados no desenvolvimento da insuficiência cardíaca congestiva e tem como produto final a aldosterona, que contribui para a remodelagem cardíaca. Neste trabalho verifiquei a inexistência de uma diferença significativa de valores de aldosterona sérica de cães assintomáticos com Doença Mixomatosa Valvular Mitral (estadio B2 da classificação ACVIM) e os valores do intervalo de referência desta hormona. Concluí também não haver relação entre a idade, ureia, creatinina, rácio Proteina-Creainina, Pressões arteriais sistólica, média e diastólica, frequência de pulso, parâmetros de remodelagem cardíaca e padrão do fluxo transmitral com os valores da aldosterona medidos. É através da evidência destes achados que sugiro a não instituição de um IECA neste tipo de pacientes. O uso precoce de IECA pode não só não trazer vantagens terapêuticas nesta fase da doença como também vai promover o aparecimento precoce de fenómenos de “escape da aldosterona”.

Avaliação de diterpenos isolados de P. ornatus como potenciais inibidores da COX-1

Os produtos naturais são uma importante fonte de possíveis novos fármacos para uso clínico. O Plectranthus ornatus Codd. pertence a um género associado ao isolamento de diterpenos que são compostos responsáveis ??por diversas actividades biológicas. Os três diterpenos em estudo foram isolados no passado de P. ornatus e são agora avaliados como potenciais inibidores da COX-1. Os resultados obtidos sugerem que o ácido rinocerotinoico (2), mas não a plectrornatina C (1) e o halimano (3), apresenta uma ligeira actividade inibidora da COX-1. Estudos em desenvolvimento visam entender se estes compostos têm efeito como inibidores da COX-2. Deste modo, pretendese verificar o seu possível interesse como agentes anti-inflamatórios.

Avaliação do potencial terapêutico de inibidores da Galectina-3 em modelo experimental de lesão hepática crônica

As lesões crônicas do fígado são resultantes de agressões persistentes, onde a desorganização e destruição do tecido podem desencadear processos de regeneração e fibrose. Para que a integridade e homeostase do órgão sejam restauradas, várias vias intracelulares e intercelulares são ativadas. Uma delas é a através da liberação de moléculas pró-fibrogênicas, a exemplo da lectina solúvel bgalactosídea, a galectina-3 (Gal-3). A alta expressão dessa lectina tem sido associada a fibrogênese no fígado. A descoberta de moléculas capazes de se ligar à Gal-3 e inibir a sua ação são importantes no desenvolvimento de terapias antifibrosantes. A pectina cítrica modificada (PCM) e a N-acetilactosamina (LacNAc) demonstraram ação benéfica no tratamento de doenças fibróticas, incluindo renais e cardíacas, contudo, pouco se sabe sobre suas eficácias na fibrose hepática. Diante disso, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos das administrações da PCM e LacNAc quanto aos níveis de Gal-3 e fibrose em modelo experimental de lesão hepática crônica. Inicialmente, a fibrose hepática foi induzida em camundongos C57BL/6 pela administração de tetracloreto de carbono a 20 por cento diluído em azeite de oliva. Grupos de camundongos com dois ou quatro meses de lesão foram tratados com PCM (1 por cento e 5 por cento, fornecida ad libitum) e com LacNAc, por via intraperitoneal. Adicionalmente, camundongos knockouts para o gene da Gal-3 (Gal-3-/-) foram utilizados como um controle. Subsequentemente às intervenções, análises morfométricas, bioquímicas, imunológicas e de biologia molecular foram realizadas. Na análise morfométrica, não se verificou alteração no percentual de tecido fibroso entre os grupos tratados com PCM (1 por cento e 5 por cento) ou LacNAc quando comparados com seus respectivos controles, o que foi confirmado pela dosagem dos níveis de hidroxiprolina. Adicionalmente, não foi observada alteração dos níveis de Gal-3, MMP-9 e TIMP-1 após tratamento com os inibidores. Os resultados obtidos indicaram que a PCM e a LacNAc não foram capazes de inibir a Gal-3 no fígado, e portanto, não interferiram na deposição de tecido fibroso nesse modelo experimental