Medidas sanitarias para prevenir el ingreso y producción de haloanisoles en bodegas

La contaminación del vino con aromas y/o sabores “fúngicos" o “a moho" es consecuencia de la presencia de ciertos compuestos conocidos como haloanisoles, producidos por hongos filamentosos. El objetivo del presente trabajo es realizar una revisión bibliográfica de la información disponible relacionada con los hongos filamentosos productores de haloanisoles; su permanencia, desarrollo y la bioquímica de las reacciones de síntesis de haloanisoles, a fin de poder establecer las medidas sanitarias preventivas correspondientes.

Biogeografía de especies de Fusarium en el litoral mediterráneo de España

El trabajo presentado estudia la presencia de Fusarium oxysporum, F.solani(sensulato), F. equiseti y F.acuminatum en puntos del litoral de Almería, Alicante, Gerona e Islas Baleares (Menorca, Ibiza, Espalmador). Se analizaron tanto arenas de las playas (zonas intermareal y supramareal) como fondos marino situados a 27,9 y 7,2 metros de profundidad en Almería y a 10 m de profundidad en las Islas Baleares. Exceptuando el litoral de Gerona, en el resto de los enclaves se presentaron varias especies de Fusarium que se aislaron de las arenas de las playas, confirmando así resultados obtenidos con anterioridad. Lo más novedoso fue encontrar especies de Fusarium a diferentes profundidades marinas. En Almería F.oxysporum y F.equisti se aislaron a 27,9 y7,2 m profundidad. F. acuminatum se aisló de la muetra recogida a 27m de profundidad. En las islas Baleares, a10m de profundidad, se aislaron F. oxysporum, F. solani (sensulato), F.equiseti y F.acuminatum. El efecto antrópico, el comportamiento como "airborne" o los arrastres de aguas por las ramblas y torrentes podría explicar la presencia de estas especies en los hábitats mencionados. La permanencia de estas especies en los hábitats mencionados, especialmente en la zona intermareal de las playas y en los fondos marinos donde soportan elevadas presiones osmóticas por la alta salinidad del agua del mar Mediterráneo, permitirá estudios específicos sobre el comportamiento de estos hongos en medios muy salinos. Otros hongos aislados de arenas de playa y fondos marinos fueron: Acremonium, Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Dreschlera, Gliocladium Humicola, Penicillium, Phialophora, Rhizopus, Stemphylium, Trichoderma, Trichocladium y Ulocladium. Muchos de ellos fueron aislados del fondo marino, testimoniando así que estos hábitats no son exclusivos de Fusarium.

In vitro evaluation of commercial fibrolytic enzymes for improving the nutritive value of low-quality forages.

The aim of this work was to assess the effects of four doses of three commercial fibrolytic enzymes on ruminal fermentation of rice straw, maize stover and Pennisetum purpureum clon Cuba CT115 hay in batch cultures of ruminal micro-organisms from sheep. One enzyme was produced by Penicillium funiculosum (PEN) and two were from Trichoderma longibrachiatum (TL1 and TL2). Each liquid enzyme was diluted 200 (D1), 100 (D2), 50 (D3) and 10 (D4) - fold and applied to each substrate in quadruplicate over time and incubated for 120 h in rumen fluid. The D4 dose of each enzyme increased (P<0.05) the fractional rate of gas production and organic matter effective degradability for all substrates, and TL2 had similar effects when applied at D3. In 9 h incubations, PEN at D4, TL1 at all tested doses, and TL2 at D2, D3 and D4 increased (P<0.05) volatile fatty acid production and dry matter degradability for all substrates. The commercial enzymes tested were effective at increasing in vitro ruminal fermentation of low-quality forages, although effective doses varied with the enzyme.

Treatment of tropical forages with exogenous fibrolytiic enzymes: effects on chemical composition and in vitro rumen fermentation

The effects of three treatments of fibrolytic enzymes (cellulase from Trichoderma longibrachiatum (CEL), xylanase from rumen micro-organisms (XYL) and a 1:1 mixture of CEL and XYL (MIX) on the in vitro fermentation of two samples of Pennisetum clandestinum (P1 and P2), two samples of Dichanthium aristatum (D1 and D2) and one sample of each Acacia decurrens and Acacia mangium (A1 and A2) were investigated. The first experiment compared the effects of two methods of applying the enzymes to forages, either at the time of incubation or 24 h before, on the in vitro gas production. In general, the 24 h pre-treatment resulted in higher values of gas production rate, and this application method was chosen for a second study investigating the effects of enzymes on chemical composition and in vitro fermentation of forages. The pre-treatment with CEL for 24 h reduced (p < 0.05) the content of neutral detergent fibre (NDF) of P1, P2, D1 and D2, and that of MIX reduced the NDF content of P1 and D1, but XYL had no effect on any forage. The CEL treatment increased (p < 0.05) total volatile fatty acid (VFA) production for all forages (ranging from 8.6% to 22.7%), but in general, no effects of MIX and XYL were observed. For both P. clandestinum samples, CEL treatment reduced (p < 0.05) the molar proportion of acetate and increased (p < 0.05) that of butyrate, but only subtle changes in VFA profile were observed for the rest of forages. Under the conditions of the present experiment, the treatment of tropical forages with CEL stimulated their in vitro ruminal fermentation, but XYL did not produce any positive effect. These results showed clearly that effectiveness of enzymes varied with the incubated forage and further study is warranted to investigate specific, optimal enzyme-substrate combinations.

Cellulose-binding domains promote hydrolysis of different sites on crystalline cellulose

The cohesin-dockerin interaction in Clostridium thermocellum cellulosome mediates the tight binding of cellulolytic enzymes to the cellulosome-integrating protein CipA. Here, this interaction was used to study the effect of different cellulose-binding domains (CBDs) on the enzymatic activity of C. thermocellum endoglucanase CelD (1,4-β-d endoglucanase, EC3.2.1.4) toward various cellulosic substrates. The seventh cohesin domain of CipA was fused to CBDs originating from the Trichoderma reesei cellobiohydrolases I and II (CBDCBH1 and CBDCBH2) (1,4-β-d glucan-cellobiohydrolase, EC3.2.1.91), from the Cellulomonas fimi xylanase/exoglucanase Cex (CBDCex) (β-1,4-d glucanase, EC3.2.1.8), and from C. thermocellum CipA (CBDCipA). The CBD-cohesin hybrids interacted with the dockerin domain of CelD, leading to the formation of CelD-CBD complexes. Each of the CBDs increased the fraction of cellulose accessible to hydrolysis by CelD in the order CBDCBH1 < CBDCBH2 ≈ CBDCex < CBDCipA. In all cases, the extent of hydrolysis was limited by the disappearance of sites accessible to CelD. Addition of a batch of fresh cellulose after completion of the reaction resulted in a new burst of activity, proving the reversible binding of the intact complexes despite the apparent binding irreversibility of some CBDs. Furthermore, burst of activity also was observed upon adding new batches of CelD–CBD complexes that contained a CBD differing from the first one. This complementation between different CBDs suggests that the sites made available for hydrolysis by each of the CBDs are at least partially nonoverlapping. The only exception was CBDCipA, whose sites appeared to overlap all of the other sites.

Slow and Prolonged Activation of the p47 Protein Kinase during Hypersensitive Cell Death in a Culture of Tobacco Cells

To investigate the involvement of protein kinases in the signaling cascade that leads to hypersensitive cell death, we used a previously established system in which a fungal elicitor, xylanase from Trichoderma viride (TvX), induces a hypersensitive reaction in tobacco (Nicotiana tabacum) cells in culture (line XD6S). The elicitor induced the slow and prolonged activation of a p47 protein kinase, which has the characteristics of a family member of the mitogen-activated protein kinases. An inhibitor of protein kinases, staurosporine, and a blocker of Ca channels, Gd3+ ions, both of which blocked the TvX-induced hypersensitive cell death, inhibited the TvX-induced activation of p47 protein kinase. Moreover, an inhibitor of serine/threonine protein phosphatase alone induced both rapid cell death and the persistent activation of the p47 protein kinase. Thus, the p47 protein kinase might be a component of the signal transduction pathway that leads to hypersensitive cell death, and the regulation of the duration of activation of the p47 protein kinase might be important in determining the destiny of tobacco cells.

Estudos de proteômica, estruturais e funcionais de proteínas envolvidas na degradação da biomassa lignocelulósica: expansinas microbianas e hidrolases de glicosídeos termofílicas

O Brasil possui uma posição privilegiada quando se refere à produção de etanol. Por questões históricas e geográficas o país é responsável por mais de 30 % da produção mundial de etanol, com uma produção nacional de mais de 28 bilhões de litros em 2014. Para maximizar o rendimento desse processo, está em desenvolvimento a tecnologia associada ao etanol de segunda geração ou etanol lignocelulósico. Os principais desafios desta tecnologia são: melhorar a eficiência de conversão do substrato em produto e a produção em grande escala utilizando substratos de baixo custo. Com o objetivo de melhorar a eficiência do processo de conversão foram estudadas proteínas auxiliares (expansinas) que, em conjunto com celulases, melhoram a despolimerização de biomassa lignocelulósica em açúcares fermentescíveis. Além disso, realizou-se também a caracterização de enzimas ativas de carboidratos (CAZymes) de origem termofílica do organismo Thermogemmatispora sp. T81, devido a capacidade que estas proteínas apresentam de manter a atividade e conformação estrutural em altas temperaturas por um prolongado período de tempo. A partir de análises utilizando bioinformática, os genes que codificam para expansinas de Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei foram clonados e expressos em E. coli, e seus produtos gênicos (as expansinas) tiveram seus índices de sinergismo (devido atuação conjunta com coquetéis comerciais) e atividade catalítica determinados. Adicionalmente, dispondo de alinhamentos estruturais, foi proposto um mecanismo hidrolítico para elas. Em relação à bactéria Thermogemmatispora sp. T81, foram realizadas análises genômicas e proteômicas, a fim de selecionar enzimas superexpressas em meio celulósico. Seus genes foram clonados heterologamente em E. coli e o produto de expressão caracterizado bioquimicamente (cromatografia, ensaios de atividade e perfil de hidrólise) e estruturalmente (SAXS e dicroísmo circular). Os índices de sinergismo determinados foram de 2,47; 1,96 e 2,44 para as expansinas de Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei, respectivamente. A partir dos alinhamentos estruturais foi proposto a díade Asp/Glu como sitio catalítico em expansinas. As análises de proteômica possibilitaram a seleção de quatro alvos de clonagem, por apresentarem alto índice de expressão quando a bactéria foi cultivada em meio celulósico. Estas proteínas foram caracterizadas quanto a atividade e apresentaram um perfil comum: temperatura ótima de ação (de 70 a 75 °C), pH ótimo de 5, e hidrolisam preferencialmente substratos hemicelulósicos (xilano). A porcentagem de estruturais secundárias das proteínas em estudo foram confirmadas com predições teóricas ao se utilizar a técnica de dicroísmo circular. Desta maneira, os objetivos iniciais propostos neste projeto foram concluídos com a determinação do grau de sinergismo das proteínas expansinas em estudo e a proposição de um mecanismo de hidrólise para as mesmas, considerando que tais proteínas por mais de 20 anos tiveram sua atividade definida exclusivamente como acessória. Além disso, este estudo contribui com a identificação e seleção de genes para CAZymes termofilícas com aplicação biotecnológica devido às propriedades termoestáveis apresentadas.

Compatibilidade entre tratamentos químico e biológico de sementes de feijão para controle de Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli

Atualmente, a produtividade do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) pode ser reduzida devido à ocorrência de doenças em todo o território nacional, destacando-se a murcha de fusário, causada por Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli (Fop). No campo, o patógeno é disseminado a longas distâncias através das sementes infectadas e/ou contaminadas e a sua sobrevivência ocorre, principalmente, no solo. Os objetivos deste trabalho foram: avaliar a inibição do crescimento micelial de Fop por Trichoderma spp.; classificar a sensibilidade in vitro de Fop e Trichoderma spp., separadamente, a fungicidas e verificar a compatibilidade entre fungicidas químicos e biológicos para controle de Fop, presente nas sementes e no solo. Para avaliar a inibição do crescimento micelial de Fop, foram utilizados três isolados do patógeno, os quais foram confrontados, in vitro, com três isolados de Trichoderma spp. em testes de cultura pareada e produção de metabólitos voláteis a 20-22°C. Os experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado, com cinco repetições para cada isolado de Trichoderma. Para a classificação da sensibilidade in vitro de Fop e Trichoderma a fungicidas, foram avaliados os mesmos isolados anteriormente utilizados. Foram comparados dez fungicidas, em doses entre 0 a 100 mg L-1 que foram ajustadas de acordo com a CI50 de cada fungicida. Com base na percentagem de inibição do crescimento micelial, foram estimados os valores da concentração inibitória de 50% (CI50) e 100% (CI100) e selecionaram-se os fungicidas compatíveis com Trichoderma spp. A compatibilidade entre tratamentos químico e biológico foi avaliada através da inoculação artificial de sementes de feijão com um isolado de Fop (IAC 11.299-1) e infestação do mesmo no solo. As sementes foram tratadas com os fungicidas fludioxonil, flutriafol e tiofanato metílico, e com os três produtos biológicos, separadamente e em misturas. Avaliou-se o efeito dos tratamentos por meio dos testes de sanidade, germinação, comprimento de plântulas, massa da matéria seca em laboratório e índice de velocidade de emergência e porcentagem de emergência em estufa não climatizada. O efeito protetor dos tratamentos foi verificado através do teste de transmissão do patógeno solo-planta. Todos os isolados de Trichoderma apresentaram antagonismo in vitro contra Fop. No teste de cultura pareada foi observada uma redução de 15 a 20% no crescimento micelial do patógeno. No teste de produção de metabólitos voláteis, o isolado T12-1086G05 foi responsável pela maior inibição do crescimento micelial de Fop (10 a 48%). Os testes de sensibilidade in vitro mostraram que tiofanato metílico, flutriafol e fludioxonil foram compatíveis com Trichoderma (CI50 > 2 mg L-1). Com exceção do flutriafol e do GF 422 isolados e em mistura, todos os tratamentos foram eficientes na erradicação de Fop nas sementes, sem afetar a sua qualidade fisiológica. No teste de transmissão, verificou-se que a incidência de Fop foi de 5 a 40% no hipocótilo e de 5 a 30% nas raízes de feijoeiro provenientes de sementes tratadas com os produtos.

Mechanical effects of plant cell wall enzymes on cellulose/xyloglucan composites

Xyloglucan-acting enzymes are believed to have effects on type I primary plant cell wall mechanical properties. In order to get a better understanding of these effects, a range of enzymes with different in vitro modes of action were tested against cell wall analogues (bio-composite materials based on Acetobacter xylinus cellulose and xyloglucan). Tomato pericarp xyloglucan endo transglycosylase (tXET) and nasturtium seed xyloglucanase (nXGase) were produced heterologously in Pichia pastoris. Their action against the cell wall analogues was compared with that of a commercial preparation of Trichoderma endo-glucanase (EndoGase). Both 'hydrolytic' enzymes (nXGase and EndoGase) were able to depolymerise not only the cross-link xyloglucan fraction but also the surface-bound fraction. Consequent major changes in cellulose fibril architecture were observed. In mechanical terms, removal of xyloglucan cross-links from composites resulted in increased stiffness (at high strain) and decreased visco-elasticity with similar extensibility. On the other hand, true transglycosylase activity (tXET) did not affect the cellulose/xyloglucan ratio. No change in composite stiffness or extensibility resulted, but a significant increase in creep behaviour was observed in the presence of active tXET. These results provide direct in vitro evidence for the involvement of cell wall xyloglucan-specific enzymes in mechanical changes underlying plant cell wall re-modelling and growth processes. Mechanical consequences of tXET action are shown to be complimentary to those of cucumber expansin.

Breakdown of plant cell biomass by filamentous fungi

Three species of filamentous fungi, Botrytis cinerea, Sporotrichum thermophile and Trichoderma viride, have been selected to assess the potential of utilizing filamentous fungi to degrade plant cell biomass produced by mass cell culture techniques. All three fungal species grew comparatively well on plant cell biomass with no requirement for supplementary nutrients. Of the three species assessed B. cinerea demonstrated the most growth. This species also produced the greatest yield of D-glucose. However, when culture conditions were modified, yields of D-glucose were markedly reduced indicating that the combination of species and culture conditions must be thoroughly investigated to ensure maximum product yield. The growth of filamentous fungi on plant cells also markedly affected the nature of the resulting fungal-plant cell residue, increasing the levels of soluble carbohydrates and essential amino acids with the largest increase in these materials being promoted by B. cinerea.

The breakdown of plant cell biomass by fungi

Three species of fungi Sporotrichum thermophile, Botrytis cinerea and Trichoderma viride were assessed for their ability to utilize a variety of plant cell substrates (methanol extracted), Catharanthus roseus, Daucus carota, re-autoclaved C. roseus, re-autoclaved D. carota) which preliminary studies had indicated contained the necessary nutrients for fungal growth. Incubated in a suitable manner all three fungal species were able to grow on C. roseus and D. carota plant cell biomass in addition to material which had undergone methanol extraction or a re-autoclaving process to remove soluble components. Fungal biomass yields were markedly influenced by substrate, with each fungal species demonstrating a preference for particular plant cell material. Incubation conditions i.e. static or shaken and temperature also proved important. Release of glucose (i.e. values higher than Day 0) promoted by fungal breakdown of plant cell biomass was only noted with methanol extracted, re-autoclaved C. roseus and re-autoclaved D. carota material. A re-autoclaved substrate was also generally associated with high fungal C1, Cx, B-glucosidase and endo-polygalacturonase activity. In addition for each enzyme highest values were usually obtained from a particular fungal species. Buffering cultures at pH 3 or 5 further influenced enzyme activity, however in a majority of cases when flasks were unbuffered and the pH rose naturally to alkaline values higher enzyme activity was recorded. Likewise Tween 80 addition had only a limited beneficial effect. Finally filtrates containing glucose produced both from the re-autoclaving process and through fungal activity on plant cell biomass were utilized for Fusarium oxysporum, Saccharomyces cerevisiae and C. roseus plant cell culture. Although reasonable fungal biomass was obtained the use of such filtrates proved unsuitable for plant cell growth.

Evaluación in vitro de hongos nativos antagonistas de Moniliophthora rereri (Cif. & Par., Evans et al.,) en el cultivo de cacao (Theobroma cacao L.)

El cacao es afectado por una diversidad de microorganismos patógenos, entre ellos el hongo Moniliophthora roreri (Cif. & Par., Evans et al.,) causante de la moniliasis, que es una de las enfermedades de mayor importancia de este cultivo. El uso irracional de plaguicidas sintéticos para el manejo de esta enfermedad ha generado problemas al agroecosistema y la salud humana, por lo que se está demandando el uso de alternativas agroecológicas. En este contexto, el objetivo principal de esta investigación fue generar información acerca de la capacidad antagónica in vitro mostrada por hongos nativos contra la moniliasis del cacao. Se recolectaron muestras de suelo, hojas, corteza, frutos sanos y enfermos en tres zonas cacaoteras de Nicaragua para la caracterización morfológica del patógeno y de los potenciales microorganismos antagonistas. Las pruebas de antagonismo “in vitro” se realizaron a través de la técnica del cultivo dual. Se evaluó el crecimiento radial del patógeno y de los antagonistas, el porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) del patógeno y la capacidad de control biológico de los hongos antagonistas. Se probaron cuatro técnicas para la conservación de los hongos antagonistas. Se obtuvieron cuatro aislados del patógeno M. roreri y 17 aislados de hongos antagonistas. El PICR del patógeno ejercida por aislados del antagonista Trichoderma varió de 40.13% a 46.77%, en los aislados del antagonista Paecilomyces el PICR osciló entre 59.38% y 67.43%, en el único aislado del antagonista Clonostachys el PICR fue de 62.33%-67.22%. Los 17 aislados se ubicaron en las clases 1, 2 y 3 de la escala de valoración de antagonismo. La mejor técnica de conservación de hongos antagonistas y de M. roreri fue la de conservación con glicerol. Los resultados de este estudio indican que en el agroecosistema de cacao existen microorganismos nativos que tienen potencial para ser usados como agentes de control biológico del patógeno M. roreri.

Otimização da produção biotecnológica de lipases e correlação com a produção de biossurfactantes

As lipases e os biossurfactantes são compostos produzidos por microrganismos através de fermentações em estado sólido (FES) ou sumberso (FSm), os quais são aplicáveis nas indústrias alimentícia e farmacêutica, na bioenergia e na biorremediação, entre outras. O objetivo geral deste trabalho foi otimizar a produção de lipases através de fermentação em estado sólido e fermentação submersa. Os fungos foram selecionados quanto à habilidade de produção de lipases através de FES e FSm e aqueles que apresentaram as maiores atividades lipolíticas foram utilizados na seleção de variáveis significativas e na otimização da produção de lipases nos dois modos de cultivo. Foram empregadas técnicas seqüenciais de planejamento experimental, incluindo planejamentos fracionários, completos e a metodologia de superfície de resposta para a otimização da produção de lipases. As variáveis estudadas na FES foram o pH, o tipo de farelo como fonte de carbono, a fonte de nitrogênio, o indutor, a concentração da fonte de nitrogênio, a concentração do indutor e a cepa do fungo. Na FSm, além das variáveis estudadas na FES, estudaram-se as variáveis concentração inicial de inóculo e agitação. As enzimas produzidas foram caracterizadas quanto à temperatura e pH ótimos e quanto à estabilidade a temperatura e pH. Nas condições otimizadas de produção de lipases, foi avaliada a correlação entre a produção de lipases e bioemulsificantes. Inicialmente foram isolados 28 fungos. Os fungos Aspergillus O- 4 e Aspergillus E-6 foram selecionados como bons produtores de lipases no processo de fermentação em estado sólido e os fungos Penicillium E-3, Trichoderma E-19 e Aspergillus O-8 como bons produtores de lipases através da fermentação submersa. As condições otimizadas para a produção de lipases através de fermentação em estado sólido foram obtidas utilizando-se o fungo Aspergillus O-4, farelo de soja, 2% de nitrato de sódio, 2% de azeite de oliva e pHs inferiores a 5, obtendo-se atividades lipolíticas máximas de 57 U. As condições otimizadas para a produção de lipases na fermentação submersa foram obtidas utilizando-se o fungo Aspergillus O-8, farelo de trigo, 4,5% de extrato de levedura, 2% de óleo de soja e pH 7,15. A máxima atividade obtida durante a etapa de otimização foi 6 U. As lipases obtidas por FES apresentaram atividades máximas a 35ºC e pH 6,0, enquanto que as obtidas por FSm apresentaram ótimos a 37ºC e pH 7,2. A estabilidade térmica das lipases produzidas via FSm foi superior a das lipases obtidas via FES, com atividades residuais de 72% e 26,8% após 1h de exposição a 90ºC e 60ºC, respectivamente. As lipases obtidas via FES foram mais estáveis em pH´s alcalinos, com atividades residuais superiores a 60% após 24 h de exposição, enquanto as lipases produzidas via FSm foram mais estáveis em pH´s ácidos, com 80% de atividade residual na faixa de pH entre 3,5 e 6,5. Na fermentação submersa a correlação entre a produção de lipases e a atividade emulsificante óleo em água (O/A) e água em óleo (A/O) dos extratos foi 95,4% e 86,8%, respectivamente, obtendo-se atividades emulsificantes máximas O/A e A/O de 2,95 UE e 42,7 UE. Embora a maior produção de lipases tenha sido obtida na fermentação em estado sólido, não houve produção concomitante de biossurfactantes. Os extratos da fermentação submersa apresentaram redução da tensão superficial de 50 mN m -1 para 28 mN m -1 e atividade antimicrobiana frente ao microrganismo S. aureus ATCC 25923, com potenciais antimicrobianos de 36 a 43% nos três primeiros dias de fermentação. A fermentação submersa foi a técnica que apresentou os melhores resultados de otimização da produção de lipases, bem como de produção simultânea de biossurfactantes.

Degradação de Ocratoxina a: estudo de processo e toxicidade

A ocratoxina A (OTA), micotoxina encontrada em diferentes níveis e em diversas matrizes, apresenta efeitos carcinogênicos, nefrotóxicos e teratogênicos. O desenvolvimento de métodos capazes de diminuir esta contaminação a níveis permitidos pela legislação é incentivado e os processos biológicos utilizados envolvem o uso de enzimas e/ou microrganismos para degradação da OTA e são preferenciais pela especificidade, bem como pelas condições brandas para a detoxificação. O objetivo do trabalho foi estudar a ação de carboxipeptidase A nos níveis e na toxicidade de OTA, visando aplicar a técnica para detoxificar farinhas de trigo. Primeiramente foi estimado o risco de exposição à ocratoxina A pelo consumo de farinhas de trigo. Para isso foram estabelecidas condições de determinação de OTA em farinhas de trigo, empregando técnicas de estatística multivariada para definir os principais interferentes na extração de OTA pelo método de QuEChERS e detecção em CLAE-FL. O método validado permitiu a avaliação da ocorrência natural em 20 amostras de farinha de trigo, estando estas contaminadas na faixa de 0,22 a 0,85 µg.kg-1 , apresentando um valor de ingestão diária de 0,08 ngOTA.dia-1 .kgmassacorpórea -1 e uma disponibilidade de 94,4%. Em seguida foi realizada a padronização da extração de carboxipeptidase A em biomassa de Rhizopus oryzae que consistiu em agitação ultrassônica durante 30 minutos numa potencia fixa de 150 W e 40 kHz e a triagem de agentes biológicos para degradação de OTA. Para o estudo da degradação in vitro de OTA, método de extração e detecção de OTA e OTα em CLAEFL foi validado e o processo de degradação foi realizado com Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei, obtendo-se uma redução máxima de 63,5% e 57,7%, respectivamente. A degradação apresentou uma correlação alta (R>0,9) e significativa (p<0,05) com a produção de Otα, indicando que ocorreu a produção de enzimas capazes de hidrolisar a micotoxina, por exemplo, a carboxipeptidase A. O estudo da toxicidade de OTA e seu metabólito OTα foi realizado em neutrófilos humanos, onde foi observado a ausência de efeito tóxico de OTα. Também foi determinado o mecanismo de toxicidade de OTA pelo aumento de Ca2+ intracelular pela liberação a partir das reservas internas. Esta liberação, subsequentemente, provoca uma cascata de eventos, nomeadamente: a produção de espécies reativas, depleção de ATP, perda de ΔΨm, levando à morte por necrose. Para reduzir o risco de exposição à micotoxina pela ingestão de matéria prima contaminada, carboxipeptidase A extraída de diferentes fontes foi aplicada na hidrólise de OTA em farinha de trigo para posterior determinação do conteúdo residual de OTA e OTα, empregando método validado. O estudo mostrou uma redução de OTA entre 16,8 e 78,5% e produção de OTα entre 2 a 8,2 ng.g-1 . As carboxipeptidases mais promissoras para degradação foram as provenientes de Rhizopus e Trichoderma e a carboxipeptidase comercial. Ficou demonstrado que se pode recomendar a aplicação de enzimas proteolíticas, tipo carboxipeptidase, para reduzir o risco de exposição à micotoxina quando utilizada matéria prima contaminada, por exemplo, farinha de trigo para diferentes processos. A transformação de OTA para OTα e seus efeitos na redução da toxicidade da micotoxina corroboram com esta afirmação.

Interação de microorganismos na solubilização de fósforo e potássio de rochas para produção de biofertilizantes

he present model of agriculture is based on intensive use of industrial inputs, due to its rapid response, but it brings harmful consequences to the environment, and it is necessary the use of modern inputs. And an alternative is the use of rock biofertilizers in agriculture, a product easy to use, with higher residual effect and does not harm the environment. The objective of study was to evaluate the inoculation and co-inoculation of different microorganisms in the solubilization of rock phosphate and potash ground microbial evaluating the best performance in the production of biofertilizers comparing with rocks pure in soil chemical properties and, verify effect of inoculation of the bacterium Paenibacillus polymyxa in the absorption of minerals dissolved in the development of cowpea (Vigna unguiculata [L.] Walp.). The first bioassay was conducted in Laboratory (UFRN) for 72 days in Petri dishes, where the rock powder was increased by 10% and sulfur co-inoculated and inoculated with bacterial suspension of Paenibacillus polymyxa grown in medium tryptone soy broth, Ralstonia solanacearum in medium Kelman, Cromobacterium violaceum in medium Luria-Bertani and Acidithiobacillus thiooxidans in medium Tuovinen and Kelly,and fungi Trichoderma humatum and Penicillium fellutanum in malt extract. Every 12 days, samples were removed in order to build up the release curve of minerals. The second bioassay was conducted in a greenhouse of the Agricultural Research Corporation of Rio Grande do Norte in experimental delineation in randomized block designs, was used 10 kg of an Yellow Argissolo Dystrophic per pot with the addition of treatments super phosphate simple (SS), potassium chloride (KCl), pure rock, biofertilizers in doses 40, 70, 100 and 200% of the recommendation for SS and KCl, and a control, or not inoculated with bacteria P. polymyxa. Were used seeds of cowpea BRS Potiguar and co-inoculated with the bacterial suspension of Bradyrhizobium japonicum and P. polymyxa. The first crop was harvested 45 days after planting, were evaluated in the dry matter (ADM), macronutrients (N, P, K, Ca, Mg) and micronutrients (Zn, Fe, Mn) in ADM. And the second at 75 days assessing levels of macro end micronutrients in plants and soil, and the maximum adsorption capacity of P in soil. The results showed synergism in co-inoculations with P. polymyxa+R. solanacearum and, P. polymyxa+C. violaceum solubilizations providing higher P and K, respectively, and better solubilization time at 36 days. The pH was lower in biofertilizers higher doses, but there was better with their addition to P at the highest dose. Significant reduction of maximum adsorption capacity of phosphorus with increasing dose of biofertilizer. For K and Ca was better with SS+KCl, and Mg to pure rock. There was an effect of fertilization on the absorption, with better results for P, K and ADM with SS+KCL, and N, Ca and Mg for biofertilizers. Generally, the P. polymyxa not influence the absorption of the elements in the plant. In treatments with the uninoculated P. polymyxa chemical fertilizer had an average significantly higher for weight and number of grains. And in the presence of the bacteria, biofertilizers and chemical fertilizers had positive values in relation to rock and control. The data show that the rocks and biofertilizers could meet the need of nutrients the plants revealed as potential for sustainable agriculture