Les enjeux soulevés par la pharmacogénomique revisités à la lumière de la responsabilité telle qu'envisagée par Paul Ricoeur

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Eph kinases and their ligands ephrins act in concert with sex hormones in regulating blood pressure

Les Erythropoietin-producing hepatocyte (EPH) sont la plus grande famille de récepteurs tyrosine kinase. Leurs ligands, les éphrines (EFNs), sont aussi des molécules exprimées à la surface cellulaire. Les EPH/EFNs sont impliqués dans de nombreux processus biologiques. L'hypertension artérielle (PA) est une maladie chronique qui, aujourd'hui, est devenue un problème médical critique dans le monde entier et un enjeu de santé publique. La découverte de nouvelles thérapeutiques de l'hypertension sont d'une grande importance pour la santé publique. Jusqu’à tout récemment, il existe seulement quelques études concernant le rôle de l’axe EPH/EFNs sur la fonction des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Dans nos études précédentes, nous avons montré qu'EPHB6 et EFNB1, de concert avec les hormones sexuelles, régulent la PA. Dans la présente étude, nous avons constaté que les différents membres de la famille EPH/EFN peuvent réguler soit positivement, soit négativement, la contractilité des CMLV et la PA: tandis que EPHB4 et EFNB2 appartiennent à la première catégorie, EFNB1, EFNB3 et EPHB6 appartiennent à la deuxième. In vivo, des souris males, mais non pas des femelles, porteuses d’une mutation EPHB4 (KO) spécifique du muscle lisse présentent une PA diminuée, comparée aux souris témoins (WT). Les CMLV de souris EPHB4 KO, en présence de testostérone, ont montré une contractilité réduite lors de la stimulation par la phényléphrine (PE). Au niveau moléculaire, la phosphorylation de la protéine kinase II dépendante de Ca2+/calmoduline et de la kinase de la chaine légère de la myosine (CLM) est augmentée, tandis que la phosphorylation de la kinase de la CLM est réduite dans les CMLV KO lors de la stimulation par PE, par rapport au WT CMLV. Cela fournit une base moléculaire à la réduction de la PA et de la contractilité des CMLV chez les souris EPHB4 KO. EFNB2 est le ligand majeur de l’EPHB4. Comme attendu, les souris EFNB2 KO spécifique du muscle lisse avaient un phénotype de PA semblable, quoique non identique, aux souris EPHB4 KO. Les souris mâles EFNB2 KO, mais pas femelles, sous régime régulier ou riche en sel, présentent une PA réduite, par rapport à leurs homologues WT. Au niveau cellulaire, les CMLV des souris KO ont montré une contractilité réduite lors de la stimulation par PE par rapport aux témoins WT. Une région de l’acide aminé (aa) 313 à l’aa 331 dans la partie intracellulaire d’EFNB2 est essentielle pour la signalisation inverse qui régule la contractilité des CMLV, selon des études de mutation-délétion. Dans une étude de génétique humaine, nous avons identifié, dans le gène EFNB2, six SNP qui étaient associées significativement au risque d'hypertension artérielle, de façon dépendante du sexe, ce qui corrobore nos résultats chez les souris. En revanche, la délétion du gène EFNB3 (KO) chez les souris femelles aboutit à une PA élevée et à une augmentation des résistances des petites artères in vivo, améliore la contractilité des petites artères ex-vivo et augmente la contractilité des CMLV in vitro. Les souris mâles KO ont une PA normale, mais la castration conduit à une augmentation significative de la PA dans les souris KO, mais pas dans les souris WT. Les CMLV des souris KO femelles ont montré une phosphorylation accrue de la CLM et une phosphorylation réduite de la kinase de la CLM, ce qui fournit à nouveau une base moléculaire aux phénotypes de PA et de contractilité des CMLV observés. Ce changement de signalisation est attribuable à une protéine adaptatrice Grip1. En effet, dans une étude d'association pan génomique par le Consortium International pour la Pression Sanguine, un SNP dans le gène GRIP1 a approché le seuil de significativité de la valeur p pour son association avec la pression diastolique. Nos recherches, pour la première fois, ont révélé que EPH/EFNs sont de nouveaux composants dans le système de régulation de la PA. Les membres de la famille EPH/EFN peuvent agir comme des forces Yin et Yang pour régler finement le tonus des vaisseaux pour assurer l'homéostasie de la PA et de sa régulation. Ces effets de EPH/EFNs dépendent du sexe et des niveaux d’hormones sexuelles. À partir de ces nouvelles connaissances, nous pourrions développer une nouvelle thérapie personnalisée pour l’hypertension artérielle, utilisant des antagonistes d'hormones sexuelles ou des thérapies de remplacement d'hormones sexuelles, selon les niveaux d'hormones sexuelles des patients et les mutations dans les gènes de l'EPH/EFN.

Bcl-xL (S49) and (S62) sequential phosphorylation/dephosphorylation during mitosis prevents chromosome instability and aneuploidy

Une caractéristique intéressante de la protéine Bcl-xL est la présence d'un domaine en boucle non-structurée entre les hélices α1 and α2 de la protéine. Ce domaine protéique n'est pas essentiel pour sa fonction anti-apoptotique et absent chez CED-9, la protéine orthologue chez Caenorhabditis elegans. A l'intérieur de ce domaine, Bcl-xL subit une phosphorylation et déphosphorylation dynamique sur les résidus Ser49 et Ser62 en phase G2 du cycle cellulaire et lors de la mitose. Lorsque ces résidus sont mutés et les protéines exprimées dans des cellules cancéreuses, les cellules démontrent plusieurs défauts mitotiques liés à l'instabilité chromosomique. Pour analyser les effets de Bcl-xL Ser49 et Ser62 dans les cellules normales, les présentes études ont été réalisées dans des cellules diploïdes humaines normales, et in vivo chez Caenorhabditis elegans. Dans une première étude, nous avons utilisé la lignée cellulaire de cellules fibroblastiques diploïdes humaines normales BJ, exprimant Bcl-xL (type sauvage), (S49A), (S49D), (S62A), (S62D) et les double (S49/62A) et (S49/62D) mutants. Les cellules exprimant les mutants de phosphorylation ont montré des cinétiques de doublement de la population cellulaire réduites. Ces effets sur la cinétique de doublement de la population cellulaire corrèle avec l'apparition de la sénescence cellulaire, sans impact sur les taux de mort cellulaire. Ces cellules sénescentes affichent des phénotypes typiques de sénescence associés notamment à haut niveau de l'activité β-galactosidase associée à la sénescence, la sécrétion d' interleukine-6, l'activation de p53 et de p21WAF1/ Cip1, un inhibiteur des complexes kinase cycline-dépendant, ainsi que la formation de foyers de chromatine nucléaire associés à γH2A.X. Les analyses de fluorescence par hybridation in situ et des caryotypes par coloration au Giemsa ont révélé que l'expression des mutants de phosphorylation de Bcl-xL provoquent de l'instabilité chromosomique et l'aneuploïdie. Ces résultats suggèrent que les cycles de phosphorylation et déphosphorylation dynamiques de Bcl-xL Ser49 et Ser62 sont importants dans le maintien de l'intégrité des chromosomes lors de la mitose dans les cellules normales. Dans une deuxième étude, nous avons entrepris des expériences chez Caenorhabditis elegans pour comprendre l'importance des résidus Ser49 et Ser62 de Bcl-xL in vivo. Les vers transgéniques portant les mutations de Bcl-xL (S49A, S62A, S49D, S62D et S49/62A) ont été générés et leurs effets ont été analysés sur les cellules germinales des jeunes vers adultes. Les vers portant les mutations de Bcl-xL ont montré une diminution de ponte et d'éclosion des oeufs, des variations de la longueur de leurs régions mitotiques et des zones de transition, des anomalies chromosomiques à leur stade de diplotène, et une augmentation de l'apoptose des cellules germinales. Certaines de ces souches transgéniques, en particulier les variants Ser/Ala, ont également montré des variations de durée de vie par rapport aux vers témoins. Ces observations in vivo ont confirmé l'importance de Ser49 et Ser62 à l'intérieur du domaine à boucle de Bcl-xL pour le maintien de la stabilité chromosomique. Ces études auront une incidence sur les futures stratégies visant à développer et à identifier des composés qui pourraient cibler non seulement le domaine anti-apoptotique de la protéine Bcl-xL, mais aussi son domaine mitotique pour la thérapie du cancer.

Régulation épigénétique de la défense antioxydante et de l'Angiopoietin-like 2 dans le contexte du vieillissement et des maladies cardiovasculaires

Suite à l’exposition à des facteurs de risque incluant la malnutrition, la dyslipidémie, la sédentarité et les désordres métaboliques, les maladies cardiovasculaires (MCV) sont caractérisées par un état pro-oxydant et pro-inflammatoire, et une dérégulation de l’expression de divers facteurs responsables de l’homéostasie de l’environnement rédox et inflammatoire. L’implication d’enzymes antioxydantes telles que les superoxyde dismutases (SOD) et les glutathion peroxydases (Gpx), ainsi que la contribution de médiateurs pro-inflammatoires tels que l’angiopoietin-like 2 (Angptl2) ont été rapportées dans le cadre des MCV. Toutefois, les mécanismes moléculaires sensibles aux facteurs de risque et menant au développement des MCV sont peu connus. L’épigénétique est un mécanisme de régulation de l’expression génique sensible aux stimuli extracellulaires et pourrait donc contribuer au développement des MCV. La méthylation de l’ADN est un des mécanismes épigénétiques pouvant varier tant de manière gène-spécifique qu’à l’échelle génomique, et la conséquence de tels changements sur l’expression des gènes ciblés dépend du site de méthylation. Puisqu’il a été démontré que des variations au niveau de la méthylation de l’ADN peuvent être associées à divers contextes pathologiques incluant les MCV, le but de nos travaux était d’étudier le lien entre la méthylation de gènes antioxydants et pro-inflammatoires avec leurs répercussions fonctionnelles biologiques en présence de facteurs de risques associés aux MCV, tels que le vieillissement, la dyslipidémie et la sédentarité. Dans la première étude, nous avons observé que dans l’artère fémorale de souris vieillissantes, la méthylation au niveau du promoteur du gène Sod2, codant pour l’enzyme antioxydante superoxyde dismutase de type 2 (SOD2 ou MnSOD), diminue avec l’âge. Ceci serait associé à l’induction de l’expression de MnSOD, renforçant ainsi la défense antioxydante endogène. Le vieillissement étant associé à une accumulation de la production de radicaux libres, nous avons étudié la vasodilatation dépendante de l’endothélium qui est sensible au stress oxydant. Nous avons observé que la capacité vasodilatatrice globale a été maintenue chez les souris âgées, aux dépens d’une diminution des facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium (EDHF) et d’une contribution accentuée de la voie du monoxyde d’azote (NO). Nous avons ensuite utilisé deux approches visant à réduire les niveaux de stress oxydant in vivo, soit la supplémentation avec un antioxydant, la catéchine, et l’exposition chronique à de l’exercice physique volontaire. Ces interventions ont permis de prévenir à la fois les changements au niveau de la fonction endothéliale et de l’hypométhylation de Sod2. Cette première étude démontre donc la sensibilité de la méthylation de l’ADN à l’environnement rédox. Dans la deuxième étude, nous avons démontré une régulation de l’expression de l’enzyme antioxydante glutathion peroxydase 1 (Gpx1) en lien avec la méthylation de son gène codant, Gpx1, dans un contexte de dyslipidémie sévère. Nos résultats démontrent que dans le muscle squelettique de souris transgéniques sévèrement dyslipidémiques (LDLr-/-; hApoB+/+), Gpx1 est hyperméthylé, ce qui diminue l’expression de Gpx1 et affaiblit la défense antioxydante endogène. Chez ces souris, l’exercice physique chronique a permis d’augmenter l’expression de Gpx1 en lien avec une hypométhylation transitoire de son gène. Cette étude démontre que le stress oxydant associé à la dyslipidémie sévère altère les mécanismes de défense antioxydante, en partie via un mécanisme épigénétique. De plus, on observe également que l’exercice physique permet de renverser ces effets et peut induire des changements épigénétiques, mais de manière transitoire. La troisième étude avait pour but d’étudier la régulation de l’Angptl2, une protéine circulante pro-inflammatoire, dans le contexte des MCV. Nous avons observé que chez des patients coronariens, la concentration circulante d’Angptl2 est significativement plus élevée que chez des sujets sains et ce, en lien avec une hypométhylation de son gène, ANGPTL2, mesurée dans les leucocytes circulants. Nous sommes les premiers à démontrer qu’en réponse à l’environnement pro-inflammatoire associé à une MCV, l’expression de l’Angptl2 est stimulée par un mécanisme épigénétique. Nos études ont permis d’identifier des nouvelles régions régulatrices différentiellement méthylées situées dans les gènes impliqués dans la défense antioxydante, soit Sod2 en lien avec le vieillissement et Gpx1 en lien avec la dyslipidémie et l’exercice. Nous avons également démontré un mécanisme de régulation de l’Angptl2 dépendant de la méthylation d’ANGPTL2 et ce, pour la première fois dans un contexte de MCV. Ces observations illustrent la nature dynamique de la régulation épigénétique par la méthylation de l’ADN en réponse aux stimuli environnementaux. Nos études contribuent ainsi à la compréhension et l’identification de mécanismes moléculaires impliqués dans le développement du phénotype pathologique suite à l’exposition aux facteurs de risque, ce qui ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.

Étude des gènes de fusion MLL dans les leucémies aigues humaines

Les leucémies aigues sont la conséquence d’une prolifération clonale et maligne des cellules hématopoïétiques. Elles surviennent suite à un évènement oncogénique qui se produit dans une cellule souche hématopoïétique (CSH) ou progénitrice. Cela lui confère une certaine instabilité qui engendre l’accumulation d’autres évènements génétiques et/ou épigénétiques responsables du développement clinique de la maladie. Les leucémies MLL représentent environ 10% des leucémies aigues et aujourd’hui, plus de 70 gènes de fusion ont été caractérisés. Les sangs de cordon sont une source importante de CSH et progénitrices. La purification de ces cellules et leur transformation en cellules leucémiques à l’aide de gènes de fusion MLL nous permettent de générer des leucémies aigues humaines dans des souris immunodéficientes NSG et ainsi étudier le potentiel leucémique de différents gènes de fusion MLL. Dans un premier temps, 4 gènes de fusion MLL ont été étudiés : MLL-AF9, MLL-AF4, MLL-ENL et MLL-ELL. In vitro, nous sommes capables de transformer des CSH en cellules leucémiques capables de proliférer rapidement. Les résultats in vivo nous montrent qu’il est possible de générer des leucémies avec les oncogènes MLL-AF9 et MLL-ENL. Pour les fusions MLL-ELL et MLL-AF4, bien que quelques leucémies ont pu être obtenues, plusieurs problèmes techniques nous empêchent aujourd’hui de disposer d’un modèle adéquat permettant l’étude complète de ces oncogènes. Dans un second temps, les leucémies aigues MLL-AF9 ont été étudiées dans un modèle contrôlé où les cellules souches proviennent d’un donneur unique. Grâce à ce modèle, nous avons pu démontrer que l’oncogène MLL-AF9 est suffisant pour induire le développement de la maladie. En effet aucune nouvelle mutation n’a pu être identifiée au cours du développement de la leucémie. Parmi les leucémies myéloïdes aigues (LMA) MLL-AF9 issues de ce modèle, certains gènes non mutés, dont RET, ont été identifiés comme étant de potentiels biomarqueurs de ce sous-groupe de leucémie.

Exploitation de l'analyse par graphes au niveau élémentaire en vue d'investigations du côté des attitudes et des habiletés logiques

L'école d'hier faisait de la grammaire et de l'analyse un usage prépondérant dans l'apprentissage de la langue. Une longue série de règles appliquées dans des exercices structurés préparait une certaine élite d'étudiants à "faire leurs humanités". Le temps passe, les choses évoluent, la grammaire se transforme. Lorsque nous avons commencé à enseigner au niveau élémentaire, les cours de grammaire et d'analyse ne différaient pas tellement de ceux des générations antérieures. Puis vinrent les années '70. Un programme cadre est instauré. Les maîtres endossent la responsabilité de la méthode utilisée et de son application. Une période d'instabilité se creuse, dont les élèves sont les plus grandes victimes. Nous atteignons la période critique où l'on constate que peu d'enfants maîtrisent leur orthographe d'usage à la fin de leur cours primaire. À qui imputer la faute? Devons-nous revenir à un enseignement systématique de la grammaire? Cette période nous aura permis de constater l'inefficacité de nos leçons traditionnelles en vue d'acquisitions orthographiques chez nos enfants; préférence accordée à l'induction des règles grammaticales usuelles; élimination des connaissances grammaticales inutiles aux besoins immédiats des élèves. Telle Tut notre option en ce qui concerne la grammaire. Mais que dire de l'analyse logique? […]

Le genre de la pauvreté : l'assistance aux indigents à Sherbrooke de 1922 à 1940

Le problème de la pauvreté au Québec n'est pas un fait inhérent à notre société contemporaine. Déjà, sous le Régime français, la colonie avait dû faire face à divers malaises sociaux dont notamment la pauvreté. Pour tenter de les endiguer, les dirigeants de la colonie se servirent du modèle d'assistance français, datant du 17e siècle, sous influence féodale et ecclésiale, pour le reproduire en Nouvelle-France. Ainsi, aux 17e et 18e siècles, la responsabilité des malades et des pauvres incomba aux réseaux de solidarité que constituaient la famille et la paroisse. Durant cette période, l'action de l'Église, grâce à des institutions telles que les Hôtels-Dieu et les hôpitaux généraux et celle de l'État, par sa politique subventionnaire, ne constituèrent toutefois qu'une intervention supplétive. Cependant, les débuts de l'industrialisation au 19e siècle, l'exode rural qui s'ensuivit ainsi que l'instabilité économique et l'immigration des populations britanniques, révélèrent l'insuffisance de la structure d'aide mise en place pour secourir les pauvres et les malades. Fondées à partir de 1830, différentes associations charitables se confrontèrent, elles aussi, à des problèmes d'ordre financier. À cause de sa situation névralgique comme institution sociale, l'Église s'assura graduellement, à partir de 1840, le contrôle des associations de charité mais surtout celui de l'administration de l'assistance au Québec. Et comme le dit si bien Jean-Marie Fecteau: «la charité devient, de plus en plus, affaire de religion et de groupe ethnique. Au cours de la décennie 1840, le mouvement s'amplifie.» En 1867, l'Acte de l'Amérique du Nord britannique attribua à la province de Québec, par l'article 92, la pleine juridiction en matière de bien-être et de santé sauf ce qui concerne les hôpitaux de la marine. La reformulation du code municipal en 1871 conféra aux municipalités, mais seulement à titre discrétionnaire, la charge de l'assistance directe et celle de soutenir les institutions de charité. [...]

Développement d'une librairie de code et d'outils bio-informatiques faciliant l'analyse de grandes quantités de données génomiques

Thèse décrivant l'écriture d'outils spécialisés facilitant l'analyse de grandes quantités de données provenant de technologie de séquencage haut débit.

La recherche internationale en génétique et l’utilisation secondaire des données : entre dissociation et harmonisation

L’étude des polymorphismes et des aspects multifactoriels des déterminants de la santé suscite un engouement majeur envers la recherche populationnelle en génétique et génomique. Cette méthode de recherche requiert cependant la collecte et l’analyse d’un nombre élevé d’échantillons biologiques et de données associées, ce qui stimule le développement des biobanques. Ces biobanques, composées des données personnelles et de santé de milliers de participants, constituent désormais une ressource essentielle permettant l’étude de l’étiologie des maladies complexes et multifactorielles, tout en augmentant la rapidité et la fiabilité des résultats de recherche. Afin d’optimiser l’utilisation de ces ressources, les chercheurs combinent maintenant les informations contenues dans différentes biobanques de manière à créer virtuellement des mégacohortes de sujets. Cependant, tout partage de données à des fins de recherche internationale est dépendant de la possibilité, à la fois légale et éthique, d’utiliser ces données aux fins pressenties. Le droit d’utiliser les données personnelles, médicales et génétiques de participants dans le cadre de recherches internationales est soumis à un ensemble complexe et exhaustif d’exigences légales et éthiques. Cette complexité est exacerbée lorsque les participants sont décédés. Fondée sur une révision de l’interprétation individualiste du concept de consentement éclairé, ainsi qu’une perspective constructiviste des concepts de confiance et d’autonomie, cette thèse se situe au carrefour de la recherche, du droit et de l’éthique, et a pour objectif de proposer un modèle promouvant l’harmonisation éthique et juridique des données aux fins de recherches internationales en génétique.

Bases génétiques de la différenciation adaptative en milieu anthropisé chez Macoma balthica, un bivalve marin à fort flux génique

Dans un contexte environnemental anthropisé, fragmenté et soumis à un changement climatique rapide, l’appréhension des processus d'adaptation locale des organismes marins par l'étude de zones de contact entre taxa proches constitue une approche privilégiée. Dans ces zones, des génotypes hybrides persistent malgré un état de maladaptation liée à des incompatibilités génétiques endogènes et/ou des barrières exogènes. L'histoire biogéographique complexe de la telline baltique Macoma balthica fait émerger quatre zones hybrides européennes, dont l'une, localisée autour de la Pointe Finistère (France), est le résultat d’un contact entre deux stocks génétiques ayant divergé en allopatrie. Ces divergences sont susceptibles de rompre la coadaptation entre génomes nucléaire et mitochondrial en raison de l'émergence d'incompatibilités mitonucléaires (MNIs). Ainsi, les sous-unités protéiques des cinq complexes de la chaine OXPHO sont codées à la fois par des gènes nucléaires et mitochondriaux, et une coévolution intergénomique étroite est requise pour maintenir la production énergétique cellulaire. De précédentes données de transcriptomique dévoilent de probables MNIs chez M. balthica au niveau des complexes respiratoires I et V, Afin d’apporter des éléments de compréhension aux mécanismes de maintien des zones hybrides dans un contexte de pression anthropique, le présent travail se propose de tester l'hypothèse de putatives MNIs dans cette zone de contact. Pour cela, (i) six mitogénomes correspondant à cinq lignées haplotypiques divergentes en Europe ont été séquencés et l'architecture génomique a été étudiée conjointement à une cartographie des mutations des 13 gènes mitochondriaux, (ii) le niveau de transcription de 5 gènes nucléaires et 8 gènes mitochondriaux (complexe I à V) des individus hybrides a été comparé à celui des lignées parentales après détermination du statut d'hybridation de chaque individu (six populations françaises). A défaut d'apporter des éléments de réponses concrets quant à l'existence de MNIs chez M. balthica, et ses répercussions évolutives en terme de dépression d'hybridation, ce travail constitue un tremplin vers une étude approfondie de la zone hybride française en développant de nouveaux outils moléculaires, et de solides techniques expérimentales pour la conduite de futurs croisements artificiels.

Augmentation de l’absorption intestinale à l’aide de promédicaments se liant aux gangliosides GM1

Le but de ce projet est de développer une approche biomimétique pour augmenter l'absorption de molécules actives peu perméables. Cette approche réplique le mécanisme d'internalisation de la toxine du choléra par sa liaison au récepteur GM1 à la surface des cellules intestinales. La technologie proposée est de synthétiser des promédicaments composés d'une molécule active, d'un espaceur et d'un peptide ayant de l'affinité pour le GM1. Les hypothèses de ce projet sont que le peptide faisant partie du promédicament augmentera l'absorption intestinale de médicaments peu perméables et que le complexe sera métabolisé rapidement après son absorption. Des prototypes de promédicaments ont été synthétisés et des essais de stabilité, d'affinité et de perméabilité sur les peptides et les promédicaments ont été développés et réalisés. Les résultats de cette étude ont démontré la possibilité de synthétiser des promédicaments à partir d'un peptide liant le GM1 et d'une molécule thérapeutique ayant une faible biodisponibilité. Les essais de stabilité, d'affinité et de perméabilité ont été optimisés et implémentés avec succès. Les études in vitro initiales ont rapporté des résultats prometteurs concernant les propriétés de liaison du peptide utilisé et d'un des promédicaments préparés. Par contre, les résultats des essais de stabilité ont montré un métabolisme partiel des promédicament dans le plasma ainsi qu'une instabilité des solutions mères. De plus, les essais de perméabilité se sont avérés non concluants. Les prochaines études porteront sur la préparation de nouveaux promédicaments par une approche similaire ainsi que sur l'investigation du mécanisme d'internalisation du peptide.

Eph kinases and their ligands ephrins act in concert with sex hormones in regulating blood pressure

Les Erythropoietin-producing hepatocyte (EPH) sont la plus grande famille de récepteurs tyrosine kinase. Leurs ligands, les éphrines (EFNs), sont aussi des molécules exprimées à la surface cellulaire. Les EPH/EFNs sont impliqués dans de nombreux processus biologiques. L'hypertension artérielle (PA) est une maladie chronique qui, aujourd'hui, est devenue un problème médical critique dans le monde entier et un enjeu de santé publique. La découverte de nouvelles thérapeutiques de l'hypertension sont d'une grande importance pour la santé publique. Jusqu’à tout récemment, il existe seulement quelques études concernant le rôle de l’axe EPH/EFNs sur la fonction des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Dans nos études précédentes, nous avons montré qu'EPHB6 et EFNB1, de concert avec les hormones sexuelles, régulent la PA. Dans la présente étude, nous avons constaté que les différents membres de la famille EPH/EFN peuvent réguler soit positivement, soit négativement, la contractilité des CMLV et la PA: tandis que EPHB4 et EFNB2 appartiennent à la première catégorie, EFNB1, EFNB3 et EPHB6 appartiennent à la deuxième. In vivo, des souris males, mais non pas des femelles, porteuses d’une mutation EPHB4 (KO) spécifique du muscle lisse présentent une PA diminuée, comparée aux souris témoins (WT). Les CMLV de souris EPHB4 KO, en présence de testostérone, ont montré une contractilité réduite lors de la stimulation par la phényléphrine (PE). Au niveau moléculaire, la phosphorylation de la protéine kinase II dépendante de Ca2+/calmoduline et de la kinase de la chaine légère de la myosine (CLM) est augmentée, tandis que la phosphorylation de la kinase de la CLM est réduite dans les CMLV KO lors de la stimulation par PE, par rapport au WT CMLV. Cela fournit une base moléculaire à la réduction de la PA et de la contractilité des CMLV chez les souris EPHB4 KO. EFNB2 est le ligand majeur de l’EPHB4. Comme attendu, les souris EFNB2 KO spécifique du muscle lisse avaient un phénotype de PA semblable, quoique non identique, aux souris EPHB4 KO. Les souris mâles EFNB2 KO, mais pas femelles, sous régime régulier ou riche en sel, présentent une PA réduite, par rapport à leurs homologues WT. Au niveau cellulaire, les CMLV des souris KO ont montré une contractilité réduite lors de la stimulation par PE par rapport aux témoins WT. Une région de l’acide aminé (aa) 313 à l’aa 331 dans la partie intracellulaire d’EFNB2 est essentielle pour la signalisation inverse qui régule la contractilité des CMLV, selon des études de mutation-délétion. Dans une étude de génétique humaine, nous avons identifié, dans le gène EFNB2, six SNP qui étaient associées significativement au risque d'hypertension artérielle, de façon dépendante du sexe, ce qui corrobore nos résultats chez les souris. En revanche, la délétion du gène EFNB3 (KO) chez les souris femelles aboutit à une PA élevée et à une augmentation des résistances des petites artères in vivo, améliore la contractilité des petites artères ex-vivo et augmente la contractilité des CMLV in vitro. Les souris mâles KO ont une PA normale, mais la castration conduit à une augmentation significative de la PA dans les souris KO, mais pas dans les souris WT. Les CMLV des souris KO femelles ont montré une phosphorylation accrue de la CLM et une phosphorylation réduite de la kinase de la CLM, ce qui fournit à nouveau une base moléculaire aux phénotypes de PA et de contractilité des CMLV observés. Ce changement de signalisation est attribuable à une protéine adaptatrice Grip1. En effet, dans une étude d'association pan génomique par le Consortium International pour la Pression Sanguine, un SNP dans le gène GRIP1 a approché le seuil de significativité de la valeur p pour son association avec la pression diastolique. Nos recherches, pour la première fois, ont révélé que EPH/EFNs sont de nouveaux composants dans le système de régulation de la PA. Les membres de la famille EPH/EFN peuvent agir comme des forces Yin et Yang pour régler finement le tonus des vaisseaux pour assurer l'homéostasie de la PA et de sa régulation. Ces effets de EPH/EFNs dépendent du sexe et des niveaux d’hormones sexuelles. À partir de ces nouvelles connaissances, nous pourrions développer une nouvelle thérapie personnalisée pour l’hypertension artérielle, utilisant des antagonistes d'hormones sexuelles ou des thérapies de remplacement d'hormones sexuelles, selon les niveaux d'hormones sexuelles des patients et les mutations dans les gènes de l'EPH/EFN.

Bcl-xL (S49) and (S62) sequential phosphorylation/dephosphorylation during mitosis prevents chromosome instability and aneuploidy

Une caractéristique intéressante de la protéine Bcl-xL est la présence d'un domaine en boucle non-structurée entre les hélices α1 and α2 de la protéine. Ce domaine protéique n'est pas essentiel pour sa fonction anti-apoptotique et absent chez CED-9, la protéine orthologue chez Caenorhabditis elegans. A l'intérieur de ce domaine, Bcl-xL subit une phosphorylation et déphosphorylation dynamique sur les résidus Ser49 et Ser62 en phase G2 du cycle cellulaire et lors de la mitose. Lorsque ces résidus sont mutés et les protéines exprimées dans des cellules cancéreuses, les cellules démontrent plusieurs défauts mitotiques liés à l'instabilité chromosomique. Pour analyser les effets de Bcl-xL Ser49 et Ser62 dans les cellules normales, les présentes études ont été réalisées dans des cellules diploïdes humaines normales, et in vivo chez Caenorhabditis elegans. Dans une première étude, nous avons utilisé la lignée cellulaire de cellules fibroblastiques diploïdes humaines normales BJ, exprimant Bcl-xL (type sauvage), (S49A), (S49D), (S62A), (S62D) et les double (S49/62A) et (S49/62D) mutants. Les cellules exprimant les mutants de phosphorylation ont montré des cinétiques de doublement de la population cellulaire réduites. Ces effets sur la cinétique de doublement de la population cellulaire corrèle avec l'apparition de la sénescence cellulaire, sans impact sur les taux de mort cellulaire. Ces cellules sénescentes affichent des phénotypes typiques de sénescence associés notamment à haut niveau de l'activité β-galactosidase associée à la sénescence, la sécrétion d' interleukine-6, l'activation de p53 et de p21WAF1/ Cip1, un inhibiteur des complexes kinase cycline-dépendant, ainsi que la formation de foyers de chromatine nucléaire associés à γH2A.X. Les analyses de fluorescence par hybridation in situ et des caryotypes par coloration au Giemsa ont révélé que l'expression des mutants de phosphorylation de Bcl-xL provoquent de l'instabilité chromosomique et l'aneuploïdie. Ces résultats suggèrent que les cycles de phosphorylation et déphosphorylation dynamiques de Bcl-xL Ser49 et Ser62 sont importants dans le maintien de l'intégrité des chromosomes lors de la mitose dans les cellules normales. Dans une deuxième étude, nous avons entrepris des expériences chez Caenorhabditis elegans pour comprendre l'importance des résidus Ser49 et Ser62 de Bcl-xL in vivo. Les vers transgéniques portant les mutations de Bcl-xL (S49A, S62A, S49D, S62D et S49/62A) ont été générés et leurs effets ont été analysés sur les cellules germinales des jeunes vers adultes. Les vers portant les mutations de Bcl-xL ont montré une diminution de ponte et d'éclosion des oeufs, des variations de la longueur de leurs régions mitotiques et des zones de transition, des anomalies chromosomiques à leur stade de diplotène, et une augmentation de l'apoptose des cellules germinales. Certaines de ces souches transgéniques, en particulier les variants Ser/Ala, ont également montré des variations de durée de vie par rapport aux vers témoins. Ces observations in vivo ont confirmé l'importance de Ser49 et Ser62 à l'intérieur du domaine à boucle de Bcl-xL pour le maintien de la stabilité chromosomique. Ces études auront une incidence sur les futures stratégies visant à développer et à identifier des composés qui pourraient cibler non seulement le domaine anti-apoptotique de la protéine Bcl-xL, mais aussi son domaine mitotique pour la thérapie du cancer.

Régulation épigénétique de la défense antioxydante et de l'Angiopoietin-like 2 dans le contexte du vieillissement et des maladies cardiovasculaires

Suite à l’exposition à des facteurs de risque incluant la malnutrition, la dyslipidémie, la sédentarité et les désordres métaboliques, les maladies cardiovasculaires (MCV) sont caractérisées par un état pro-oxydant et pro-inflammatoire, et une dérégulation de l’expression de divers facteurs responsables de l’homéostasie de l’environnement rédox et inflammatoire. L’implication d’enzymes antioxydantes telles que les superoxyde dismutases (SOD) et les glutathion peroxydases (Gpx), ainsi que la contribution de médiateurs pro-inflammatoires tels que l’angiopoietin-like 2 (Angptl2) ont été rapportées dans le cadre des MCV. Toutefois, les mécanismes moléculaires sensibles aux facteurs de risque et menant au développement des MCV sont peu connus. L’épigénétique est un mécanisme de régulation de l’expression génique sensible aux stimuli extracellulaires et pourrait donc contribuer au développement des MCV. La méthylation de l’ADN est un des mécanismes épigénétiques pouvant varier tant de manière gène-spécifique qu’à l’échelle génomique, et la conséquence de tels changements sur l’expression des gènes ciblés dépend du site de méthylation. Puisqu’il a été démontré que des variations au niveau de la méthylation de l’ADN peuvent être associées à divers contextes pathologiques incluant les MCV, le but de nos travaux était d’étudier le lien entre la méthylation de gènes antioxydants et pro-inflammatoires avec leurs répercussions fonctionnelles biologiques en présence de facteurs de risques associés aux MCV, tels que le vieillissement, la dyslipidémie et la sédentarité. Dans la première étude, nous avons observé que dans l’artère fémorale de souris vieillissantes, la méthylation au niveau du promoteur du gène Sod2, codant pour l’enzyme antioxydante superoxyde dismutase de type 2 (SOD2 ou MnSOD), diminue avec l’âge. Ceci serait associé à l’induction de l’expression de MnSOD, renforçant ainsi la défense antioxydante endogène. Le vieillissement étant associé à une accumulation de la production de radicaux libres, nous avons étudié la vasodilatation dépendante de l’endothélium qui est sensible au stress oxydant. Nous avons observé que la capacité vasodilatatrice globale a été maintenue chez les souris âgées, aux dépens d’une diminution des facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium (EDHF) et d’une contribution accentuée de la voie du monoxyde d’azote (NO). Nous avons ensuite utilisé deux approches visant à réduire les niveaux de stress oxydant in vivo, soit la supplémentation avec un antioxydant, la catéchine, et l’exposition chronique à de l’exercice physique volontaire. Ces interventions ont permis de prévenir à la fois les changements au niveau de la fonction endothéliale et de l’hypométhylation de Sod2. Cette première étude démontre donc la sensibilité de la méthylation de l’ADN à l’environnement rédox. Dans la deuxième étude, nous avons démontré une régulation de l’expression de l’enzyme antioxydante glutathion peroxydase 1 (Gpx1) en lien avec la méthylation de son gène codant, Gpx1, dans un contexte de dyslipidémie sévère. Nos résultats démontrent que dans le muscle squelettique de souris transgéniques sévèrement dyslipidémiques (LDLr-/-; hApoB+/+), Gpx1 est hyperméthylé, ce qui diminue l’expression de Gpx1 et affaiblit la défense antioxydante endogène. Chez ces souris, l’exercice physique chronique a permis d’augmenter l’expression de Gpx1 en lien avec une hypométhylation transitoire de son gène. Cette étude démontre que le stress oxydant associé à la dyslipidémie sévère altère les mécanismes de défense antioxydante, en partie via un mécanisme épigénétique. De plus, on observe également que l’exercice physique permet de renverser ces effets et peut induire des changements épigénétiques, mais de manière transitoire. La troisième étude avait pour but d’étudier la régulation de l’Angptl2, une protéine circulante pro-inflammatoire, dans le contexte des MCV. Nous avons observé que chez des patients coronariens, la concentration circulante d’Angptl2 est significativement plus élevée que chez des sujets sains et ce, en lien avec une hypométhylation de son gène, ANGPTL2, mesurée dans les leucocytes circulants. Nous sommes les premiers à démontrer qu’en réponse à l’environnement pro-inflammatoire associé à une MCV, l’expression de l’Angptl2 est stimulée par un mécanisme épigénétique. Nos études ont permis d’identifier des nouvelles régions régulatrices différentiellement méthylées situées dans les gènes impliqués dans la défense antioxydante, soit Sod2 en lien avec le vieillissement et Gpx1 en lien avec la dyslipidémie et l’exercice. Nous avons également démontré un mécanisme de régulation de l’Angptl2 dépendant de la méthylation d’ANGPTL2 et ce, pour la première fois dans un contexte de MCV. Ces observations illustrent la nature dynamique de la régulation épigénétique par la méthylation de l’ADN en réponse aux stimuli environnementaux. Nos études contribuent ainsi à la compréhension et l’identification de mécanismes moléculaires impliqués dans le développement du phénotype pathologique suite à l’exposition aux facteurs de risque, ce qui ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.

The ways behind the railways: Algarve's railway line. Technique transfers and transport development in Southern Portugal

Esta dissertação pretende contribuir para um melhor conhecimento da complexidade das redes de transferência de conhecimentos e técnicas, no domínio da engenharia civil e mais concretamente através dos caminhos-de-ferro, nos séculos XIX e XX. Em Portugal, os caminhos-de-ferro estiveram no cerne de um vasto debate, sobretudo político, concomitante com uma instabilidade crescente no cenário político e uma fase de fragilidade económica. É neste contexto que a Linha do Sul e Sueste vai ser construída (seguida pela sua extensão até Vila Real de Santo António e pela construção do ramal de Portimão, que chegará a Lagos). Este empreendimento é uma clara ilustração da realidade portuguesa de então, no que concerne ao desenvolvimento desta rede de transportes, que nos permite, igualmente, conhecer e compreender quem interveio no processo de construção da linha (os engenheiros, as empresas, entre outros aspectos) e assim determinar quais as influências e transferências técnicas que tiveram lugar; RESUMEE: Cette mémoire attire à la contribution pour une meilleure connaissance de la complexité des réseaux de transfert de techniques et connaissances qui ont eu lieu dans le domaine de l’ingénierie civile, surtout dans les chemins de fer, au XIXème et XXème siècles. Au Portugal, les chemins de fer sont été le cerne d’un très vaste débat, coïncidant avec une croissante instabilité dans le scenario politique et aussi une phase économique fragile. C’est dans ce contexte que la Ligne du Sud et Sud-est va être bâti (suivi par l’extension jusqu’à Vila Real de Santo António et la construction de l’embranchement ferroviaire Portimão). Cette entreprise c’est une illustration claire de la réalité portugaise, en concernant l’implémentation de cette réseau de transport, que nous permettre de comprendre et également bien connaitre qui a intervenu dans le processus de construction de la ligne (les ingénieurs, entreprises, etcetera), ainsi que déterminer les influences et les transferts techniques qui ont eu lieu; ABSTRACT: With this master’s thesis, the aim is to be able to contribute to a better understanding of the complex network of technique’s and knowledge transfers, that took place within the field of civil engineering, in the 19th and 20th centuries, namely on the railways. In Portugal, railways take-up was a wide and ample debate, coinciding with an uprising turmoil on the Portuguese political outskirt and a phase of economic frailty. It’s in this context that the construction of the South and Southeast Line took place (followed, later on, by its extension until Vila Real de Santo António and by the construction of the Portimão’s branch). This enterprise is, as we pretend to prove in this master’s thesis, a clear example of the Portuguese reality, enabling us to understand and to get to know those who intervened in the construction’s process (the engineers and the companies) as well as determining influences and technique transfers that have taken place.