994 resultados para signalisation cellulaire
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Au cours des dernires annes, une slection gntique importante a t faite pour amliorer la production de lait des bovins, ceci au dtriment des performances reproductives. Cette diminution de performance na cependant pas t rapporte chez la gnisse prsentant un mme potentiel gntique. Cette immense production de lait et les changements mtaboliques qui laccompagnent ont donc un impact ngatif sur lefficacit reproductive des vaches laitires qui subissent un stress mtabolique suprieur celui des gnisses. Le but de ltude tait dacqurir une meilleure connaissance des diffrences molculaires et mtaboliques entre ces deux groupes danimaux pour amener une meilleure comprhension de la pathogense de linfertilit chez la vache laitire. Pour ce faire, les vagues folliculaires de vaches en lactation (30-50 jours en lait; N = 12) et de gnisses (N = 10) ont t synchronises par ablation cho guide des follicules et par traitement hormonal avec injection de prostaglandine et insertion dun implant de progestrone. Laspiration du liquide folliculaire et des cellules de la granulosa du follicule dominant a t faite au jour 6. Les paramtres mtaboliques mesurs chez les animaux partir de prises de sang, faites au jour 6, confirment un plus grand stress mtabolique chez la vache, les niveaux de BHBA, acides biliaires et cholestrol tant plus levs et le niveau de glucose plus bas chez celles-ci. Un total de six chantillons a t utilis pour le squenage dARN et des analyses bio-informatiques ont t effectues. Plusieurs gnes et voies de signalisation ont prsent des diffrences entre les deux groupes danimaux incluant le cycle cellulaire et la production dhormones. Une confirmation des rsultats par PCR en temps rel a t faite, mais la grande variation intragroupe a nui lobtention de rsultats significatifs. Conjointement, une culture primaire de cellules de la granulosa a t ralise pour valuer leffet des acides biliaires sur la strodogense suite la dtection dune plus grande quantit de ceux-ci chez la vache laitire. La prsence dacide biliaire dans la culture cellulaire cause une diminution de laccumulation destradiol ainsi que de lexpression des gnes CYP19A1 et CYP11A1. Les rsultats prsents dans ce mmoire indiquent une diffrence potentielle au niveau mtabolique et molculaire des follicules dominants entre la vache laitire et la gnisse pouvant avoir une responsabilit dans la diminution de lefficacit reproductive observe chez la vache laitire.
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Linflammation fait partie des processus ractionnels de dfense dont dispose lorganisme en rponse aux agressions, assurant lintgrit de lhte. En rponse au dommage tissulaire, plusieurs mdiateurs inflammatoires interviennent dans le processus de linflammation. Lors de ces dommages, des signaux de dangers provenant de cellules endommages sont relchs dans lenvironnement tissulaire, pouvant causer des dommages cellulaires et tissulaires. Les macrophages, tout comme dautres cellules, peuvent tre activs par ces signaux de danger, menant la scrtion de molcules telles que des cytokines et des chimiokines pouvant modifier le microenvironnement tissulaire. Les insultes au tissu sain peuvent entrainer la mort cellulaire telle que lapoptose. Les molcules pouvant tre relches lors de celle-ci contribuent au microenvironnement, notamment de par linfluence de celles-ci sur le macrophage. Parmi ces mdiateurs, nous avons identifi le Milk Fat Globule-Epidermal growth factor 8 (MFG-E8), un acteur important dans la rsolution de linflammation, comme tant relch spcifiquement par les cellules apoptotiques. Nous avons mis lhypothse que le microenvironnement apoptotique tissulaire, via la relche de MFG-E8, module le phnotype du macrophage, modifiant le microenvironnement, la rponse inflammatoire ainsi que le devenir de linsulte tissulaire. Nos objectifs sont 1) de caractriser ce microenvironnement apoptotique tissulaire et la cintique de relche du MFG-E8 par les cellules apoptotiques, 2) den valuer son rle dans la modulation du phnotype du macrophage ainsi que 3) den tudier, in vivo, son influence sur lenvironnement inflammatoire et le devenir tissulaire. Dans le premier article prsent, nous avons dmontr que les cellules endothliales apoptotiques relchent le MFG-E8 de faon Caspase-3 dpendante. La stimulation des macrophages par lenvironnement conditionn par les cellules endothliales apoptotiques mne ladoption dun profil macrophagien davantage anti-inflammatoire et moindrement pro-inflammatoire. Ce phnotype est rduit par linhibition de la Caspase-3 et il dpend de la prsence de MFG-E8. De plus, le potentiel du MFG-E8 la reprogrammation du macrophage pro-inflammatoire a t dmontr via un modle exprimental de pritonite. Ce changement phnotypique mdi par MFG-E8 implique une signalisation STAT3. Ayant dmontr que les cellules pithliales apoptotiques, linstar des cellules endothliales apoptotiques, relchent elles aussi de faon apoptose-dpendante le MFG-E8, nous avons tudi plus exhaustivement un modle in vivo riche en apoptose pithliale, lobstruction urtrale unilatrale. Dans ce deuxime article prsent, nous rapportons limplication bnfique de MFG-E8 dans ce modle de pathologie rnale obstructive. Nous avons constat que la prsence ou ladministration de MFG-E8 rduit le dommage tissulaire et la fibrose. La protection confre par MFG-E8 est mdie via la modulation de lactivation de linflammasome. De plus, nos rsultats illustrent limportance du phnotype anti-inflammatoire du macrophage mdi par le MFG-E8 dans la rgulation ngative de lactivation de linflammasome rnal et du dommage tissulaire. Cette thse prsente la premire description de la relche Caspase-3-dpendante de MFG-E8 par les cellules apoptotiques. Elle dmontre galement limportance du MFG-E8 dans le microenvironnement apoptotique inflammatoire dans lattnuation du phnotype pro-inflammatoire du macrophage. De plus, nous avons dmontr son rle protecteur dans des modles in vivo de transplantation aortique et de rparation tissulaire, de mme que dans un modle de maladie rnale chronique o nous avons montr que cette protection confre par MFG-E8 est mdie par la rgulation ngative de linflammasome tissulaire. Nos rsultats suggrent ainsi que le MFG-E8 pourrait tre considr comme un interrupteur inflammatoire et ainsi comme une cible potentielle dans la modulation de maladies inflammatoires.
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L'arthrose est la maladie musculo-squelettique la plus commune dans le monde. Elle est l'une des principales causes de douleur et dincapacite chez les adultes, et elle represente un fardeau considerable sur le systeme de soins de sante. L'arthrose est une maladie de larticulation entiere, impliquant non seulement le cartilage articulaire, mais aussi la synoviale, les ligaments et los sous-chondral. Larthrose est caracterisee par la degenerescence progressive du cartilage articulaire, la formation dosteophytes, le remodelage de l'os sous-chondral, la deterioration des tendons et des ligaments et l'inflammation de la membrane synoviale. Les traitements actuels aident seulement a soulager les symptomes precoces de la maladie, cest pour cette raison que l'arthrose est caracterisee par une progression presque inevitable vers la phase terminale de la maladie. La pathogenie exacte de l'arthrose est encore inconnue, mais on sait que l'evenement cle est la degradation du cartilage articulaire. Le cartilage articulaire est compose uniquement des chondrocytes; les cellules responsables de la synthese de la matrice extracellulaire et du maintien de l'homeostasie du cartilage articulaire. Les chondrocytes maintiennent la matrice du cartilage en remplacant les macromolecules degradees et en repondant aux lesions du cartilage et aux degenerescences focales en augmentant l'activite de synthese locale. Les chondrocytes ont un taux faible de renouvellement, cest pour cette raison quils utilisent des mecanismes endogenes tels que l'autophagie (un processus de survie cellulaire et dadaptation) pour enlever les organelles et les macromolecules endommages et pour maintenir l'homeostasie du cartilage articulaire. i L'autophagie est une voie de degradation lysosomale qui est essentielle pour la survie, la differenciation, le developpement et lhomeostasie. Elle regule la maturation et favorise la survie des chondrocytes matures sous le stress et des conditions hypoxiques. Des etudes effectuees par nous et d'autres ont montre quun dereglement de lautophagie est associe a une diminution de la chondroprotection, a l'augmentation de la mort cellulaire et a la degenerescence du cartilage articulaire. Carames et al ont montre que l'autophagie est constitutivement exprimee dans le cartilage articulaire humain normal. Toutefois, l'expression des inducteurs principaux de l'autophagie est reduite dans le vieux cartilage. Nos etudes precedentes ont egalement identifie des principaux genes de lautophagie qui sont exprimes a des niveaux plus faibles dans le cartilage humain atteint de l'arthrose. Les memes resultats ont ete montres dans le cartilage articulaire provenant des modeles de larthrose experimentaux chez la souris et le chien. Plus precisement, nous avons remarque que l'expression dUnc-51 like kinase-1 (ULK1) est faible dans cartilage humain atteint de l'arthrose et des modeles experimentaux de larthrose. ULK1 est la serine / threonine proteine kinase et elle est linducteur principal de lautophagie. La perte de lexpression de ULK1 se traduit par un niveau dautophagie faible. Etant donne quune signalisation adequate de l'autophagie est necessaire pour maintenir la chondroprotection ainsi que l'homeostasie du cartilage articulaire, nous avons propose lhypothese suivante : une expression adequate de ULK1 est requise pour linduction de lautophagie dans le cartilage articulaire et une perte de cette expression se traduira par une diminution de la chondroprotection, et une augmentation de la mort des chondrocytes ce qui conduit a la degenerescence du cartilage articulaire. Le role exact de ULK1 dans la pathogenie de l'arthrose est inconnue, jai alors cree pour la premiere fois, des souris KO ULK1specifiquement dans le cartilage en utilisant la technologie Cre-Lox et jai ensuite soumis ces souris a la destabilisation du menisque medial (DMM), un modele de l'arthrose de la souris pour elucider le role specifique in vivo de ULK1 dans pathogenese de l'arthrose. Mes resultats montrent que ULK1 est essentielle pour le maintien de l'homeostasie du cartilage articulaire. Plus precisement, je montre que la perte de ULK1 dans le cartilage articulaire a cause un phenotype de larthrose accelere, associe a la degenerescence acceleree du cartilage, laugmentation de la mort cellulaire des chondrocytes, et laugmentation de l'expression des facteurs cataboliques. En utilisant des chondrocytes provenant des patients atteints de larthrose et qui ont ete transfectees avec le plasmide d'expression ULK1, je montre quULK1 est capable de reduire lexpression de la proteine mTOR (principal regulateur negatif de lautophagie) et de diminuer lexpression des facteurs cataboliques comme MMP-13 et ADAMTS-5 et COX-2. Mes resultats jusqu'a present indiquent que ULK1 est une cible therapeutique potentielle pour maintenir l'homeostasie du cartilage articulaire.
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Le cancer de lovaire (COv) est le cancer gyncologique le plus ltal chez la femme et les traitements existants, chirurgie et chimiothrapie, ont peu volu au cours des dernires dcennies. Nous proposons que la comprhension des diffrents destins cellulaires tels que la snescence que peuvent choisir les cellules du cancer de lovaire en rponse la chimiothrapie pourrait conduire de nouvelles opportunits thrapeutiques. La snescence cellulaire a t largement associe lactivit de la protine TP53, qui est mute dans plus de 90% des cas de cancer de lovaire sreux de haut grade (COv-SHG), la forme la plus commune de la maladie. Dans nos travaux, partir dchantillons drivs de patientes, nous montrons que les cultures primaires du cancer de lovaire sreux de haut grade exposes au stress ou des drogues utilises en chimiothrapie entrent en senescence grce lactivit dun isoforme du gne CDKN2A (p16INK4A). Dans ces cellules, nous avons valu les caractristiques fondamentales de la snescence cellulaire tels que les altrations morphologiques, lactivit bta galactosidase associe la snescence, les dommages lADN, larrt du cycle cellulaire et le phnotype scrtoire associ la snescence. En utilisant des micromatrices tissulaires construites partir dchantillons humains de COv-SHG pr- et post-chimiothrapie, accompagnes de leurs donnes cliniques, nous avons quantifi des marqueurs de snescence incluant une diminution de la prolifration cellulaire quelques semaines aprs chimiothrapie. De faon intressante, lexpression de p16INK4A dans les chantillons de COv-SHG prtraitement corrle avec une survie prolonge des patientes suite au traitement. Ceci suggre ainsi pour la premire fois un impact biologique bnfique pour la prsence de cellules cancreuses qui sont capable dactiver la snescence, particulirement pour le traitement du cancer de lovaire. Dans le but de complmenter les thrapies actuelles avec des approches de manipulation pharmacologique de la snescence, nos rsultats suggrent quil serait important de dterminer limpact positif ou ngatif de la snescence induite par la thrapie sur la progression de la maladie et la survie, pour chaque type de cancer de faon indpendante.
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Lvolution dune cellule tumorale initie une tumeur solide ncessite, chaque tape, un microenvironnement favorable sa survie et sa croissance. Le microenvironnement tumoral est compar un foyer dinflammation chronique dont la composition cellulaire et molculaire est complexe. Les cellules souches msenchymateuses (CSM) reprsentent lun des principaux acteurs cellulaires prsents. Elles migrent vers les sites tumoraux o elles soutiennent linflammation, langiogense et le dveloppement tumoral en activant plusieurs voies de signalisation. Une des voies majeures qui contribuent linflammation est la voie de signalisation NF-B. Linitiation de cette voie provient de la membrane cellulaire entre autres des cavoles. Nous soumettons lhypothse que lune des cavines, protines associes aux cavoles, modulerait le phnotype inflammatoire etou migratoire dans les CSM traites la cytokine TNF- (facteur de ncrose tumorale ) en modulant la voie de signalisation NF-B. En effet, nous avons observ une rgulation la hausse de lexpression de la COX-2 (cyclooxygnase-2) et une diminution de lexpression dIB qui sont synonymes de lactivation de la voie NF-B dans les CSM que nous avons traites au TNF-. Nous avons trouv que le TNF- induit la migration des CSM, et que la rpression gnique de la Cavine-2 augmente significativement la migration des CSM traites par le TNF-. La rpression gnique de la Cavine-2 vient aussi amplifier la tubulogense dans les CSM en rponse au TNF-. Dun point de vue molculaire, la rpression gnique de la Cavine-2 a montr une trs forte amplification de l'expression protique de la COX-2 dans les CSM en rponse au TNF-. Dans ces mmes cellules o la Cavine-2 a t rprime, et suite un traitement au TNF-, le pic de phosphorylation est plus intense et la courbe de phosphorylation est plus prolonge dans le temps. Ces observations nous permettent daffirmer que la Cavine-2 a un rle rpresseur sur lexpression de COX-2. Collectivement, nos rsultats montrent que la Cavine-2 peut tre propose comme un gne suppresseur de tumeur et est de ce fait, une bonne cible thrapeutique dans les CSM qui permettraient dagir des stades prcoces du dveloppement tumoral.
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ADP-ribosylation factor-1 (ARF1) est une petite GTPase principalement connue pour son rle dans la formation de vsicules au niveau de lappareil de Golgi. Rcemment, dans des cellules de cancer du sein, nous avons dmontr quARF1 est aussi un mdiateur important de la signalisation du rcepteur du facteur de croissance pidermique (EGFR) contrlant la prolifration, la migration et l'invasion cellulaire. Cependant, le mcanisme par lequel lEGFR active la GTPase ainsi que le rle de cette dernire dans la rgulation de la fonction du rcepteur demeure inconnue. Dans cette thse, nous avions comme objectifs de dfinir le mcanisme d'activation de ARF1 dans les cellules de cancer du sein hautement invasif et dmontrer que lactivation de cette isoforme de ARF joue un rle essentiel dans la rsistance de ces cellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nos tudes dmontrent que les protines dadaptatrices Grb2 et p66Shc jouent un rle important dans l'activation de ARF1. Alors que Grb2 favorise le recrutement dARF1 l'EGFR ainsi que l'activation de cette petite GTPase, p66Shc inhibe le recrutement du complexe Grb2-ARF1 au rcepteur et donc contribue limiter lactivation dARF1. De plus, nous dmontrons que ARF1 favorise la rsistance aux inhibiteurs des tyrosines kinases dans les cellules de cancer du sein hautement invasif. En effet, une diminution de lexpression de ARF1 a augment la sensibilit descellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nous montrons galement que de hauts niveaux de ARF1 contribuent la rsistance des cellules ces mdicaments en amliorant la survie et les signaux prolifratifs travers ERK1/2, Src et AKT, tout en bloquant les voies apoptotiques (p38MAPK et JNK). Enfin, nous mettons en vidence le rle de la protine ARF1 dans lapoptose en rponse aux traitements des inhibiteurs de lEGFR. Nos rsultats indiquent que la dpletion dARF1 promeut la mort cellulaire induite par gefitinib, en augmentant l'expression de facteurs pro-apoptotiques (p66shc, Bax), en altrant le potentiel de la membrane mitochondriale et la libration du cytochrome C. Ensemble, nos rsultats dlimitent un nouveau mcanisme d'activation de ARF1 dans les cellules du cancer du sein hautement invasif et impliquent lactivit dARF1 comme un mdiateur important de la rsistance aux inhibiteurs EGFR.
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Afin deffectuer des tudes fonctionnelles sur le gnome de la souris, notre laboratoire a gnr une bibliothque de clones de cellules souches embryonnaires (ESC) prsentant des suppressions chromosomiques chevauchantes alatoires la bibliothque DELES. Cette bibliothque contient des dltions couvrant environ 25% du gnome murin. Dans le laboratoire, nous comptons identifier de nouveaux dterminants du destin des cellules hmatopotiques en utilisant cet outil. Un crible primaire utilisant la benzidine pour dmontrer la prsence d'hmoglobine dans des corps embryodes (EBS) a permis didentifier plusieurs clones dlts prsentant un phnotype hmatopotique anormal. Comme cet essai ne vrifie que la prsence d'hmoglobine, le but de mon projet est d'tablir un essai in vitro de diffrenciation des ESC permettant de mesurer le potentiel hmatopotique de clones DELES. Mon hypothse est que lessai de diffrenciation hmatopotique publi par le Dr Keller peut tre import dans notre laboratoire et utilis pour tudier l'engagement hmatopotique des clones DELES. laide dessais de RT-QPCR et de FACS, jai pu contrler la cintique de diffrenciation hmatopotique en suivant lexpression des gnes hmatopotiques et des marqueurs de surface comme CD41, c-kit, RUNX1, GATA2, CD45, -globine 1 et TER-119. Cet essai sera utilis pour valider le potentiel hmatopotique des clones DELES candidats identifis dans le crible principal. Mon projet secondaire vise utiliser la mme stratgie rtro-virale a base de Cre-loxP utilise pour gnrer la bibliothque DELES pour gnrer une bibliothque de cellules KBM-7 contenant des suppressions chromosomiques chevauchantes. Mon but ici est de tester si la ligne cellulaire leumique humaine presque haplode KBM-7 peut tre exploite en utilisant l'approche DELES pour crer cette bibliothque. La bibliothque de clones KBM-7 servira dfinir les activits molculaires de drogues anti-leucmiques potentielless que nous avons identifies dans le laboratoire parce quelles inhibent la croissance cellulaire dans plusieurs chantillons de leucmie mylode aigu drivs de patients. Elle me permettra galement d'identifier les voies de signalisation molculaires qui, lorsque gntiquement perturbes, peuvent confrer une rsistance ces drogues.
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4-1BB (CD137) est un membre de la superfamille TNFR qui est impliqu dans la transmission des signaux de survie aux lymphocytes. TRAF1 est une protine adaptatrice qui est recrute par 4-1BB et autres TNFRs et est caractrise par une expression trs restreinte aux lymphocytes, cellules dendritiques et certaines cellules pithliales. TRAF1 est ncessaire pour lexpansion et la survie des cellules T mmoire en prsence d'agonistes anti-4-1BB in vivo. De plus, TRAF1 est requise en aval de 4-1BB pour activer (phosphoryler) la MAP kinase Erk implique dans la rgulation de la molcule pro-apoptotique Bim. Suite lactivation du rcepteur 4-1BB, TRAF1 et ERK sont impliqus dans la phosphorylation de Bim et la modulation de son expression. Lactivation et la rgulation de TRAF1 et Bim ont un rle important dans la survie des cellules T CD8 mmoires. Dans cette tude, nous avons utilis une approche protomique afin de pouvoir identifier de nouveaux partenaires de liaison de TRAF1. Utilisant cette stratgie, nous avons identifi que LSP1 (Leukocyte Specific Protein 1) est recrut dans le complexe de signalisation 4-1BB de manire TRAF1 dpendante. Une caractrisation plus pousse de linteraction entre TRAF1 et LSP1 a montr que LSP1 lie la rgion unique N-terminal de TRAF1 de faon indpendante de la rgion conserve C-terminal. linstar des cellules T dficientes en TRAF1, les cellules T dficientes en LSP1 ne sont pas capables dactiver ERK en aval de 4-1BB et par consquent ne peuvent pas rguler Bim. Ainsi, TRAF1 et LSP1 cooprent en aval de 4-1BB dans le but dactiver ERK et rguler en aval les niveaux de Bim dans les cellules T CD8. Selon la littrature, le rcepteur 4-1BB nest pas exprim la surface des cellules B murines, mais le rcepteur 4-1BB favorise la prolifration et la survie des cellules B humaines. Cependant, il est important d'tudier l'expression du rcepteur 4-1BB dans les cellules B murines afin de disposer d'un modle murin et de prdire la rponse clinique la manipulation de 4-1BB. En utilisant diffrentes stimulations de cellules B murines primaires, nous avons identifi que le rcepteur 4-1BB est exprim la surface des cellules B de souris suite une stimulation avec le LPS (Lipopolysaccharides). Une caractrisation plus pousse a montr que le rcepteur 4-1BB est induit dans les cellules B murines d'une manire dpendante de TLR4 (Toll Like Receptor 4). Collectivement, notre travail a dmontr que la stimulation avec le LPS induit lexpression du rcepteur 4-1BB la surface des cellules B murines, menant ainsi l'induction de TRAF1. De plus, TRAF1 et LSP1 cooprent en aval de 4-1BB pour activer la signalisation de la Map kinase ERK dans les cellules B murines de manire similaire aux cellules T. Les cellules B dficientes en TRAF1 et les cellules B dficientes en LSP1 ne sont pas en mesure d'activer la voie ERK en aval de 4-1BB et montrent un niveau dexpression du rcepteur significativement diminu compar aux cellules B dune souris WT. Ainsi, TRAF1 et LSP1 sont ncessaires pour une expression maximale du rcepteur 4-1BB la surface cellulaire de cellules B murines et cooprent en aval de 4-1BB afin d'activer la cascade ERK dans les cellules B murines.
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Le cancer de lovaire (COv) est le cancer gyncologique le plus ltal chez la femme et les traitements existants, chirurgie et chimiothrapie, ont peu volu au cours des dernires dcennies. Nous proposons que la comprhension des diffrents destins cellulaires tels que la snescence que peuvent choisir les cellules du cancer de lovaire en rponse la chimiothrapie pourrait conduire de nouvelles opportunits thrapeutiques. La snescence cellulaire a t largement associe lactivit de la protine TP53, qui est mute dans plus de 90% des cas de cancer de lovaire sreux de haut grade (COv-SHG), la forme la plus commune de la maladie. Dans nos travaux, partir dchantillons drivs de patientes, nous montrons que les cultures primaires du cancer de lovaire sreux de haut grade exposes au stress ou des drogues utilises en chimiothrapie entrent en senescence grce lactivit dun isoforme du gne CDKN2A (p16INK4A). Dans ces cellules, nous avons valu les caractristiques fondamentales de la snescence cellulaire tels que les altrations morphologiques, lactivit bta galactosidase associe la snescence, les dommages lADN, larrt du cycle cellulaire et le phnotype scrtoire associ la snescence. En utilisant des micromatrices tissulaires construites partir dchantillons humains de COv-SHG pr- et post-chimiothrapie, accompagnes de leurs donnes cliniques, nous avons quantifi des marqueurs de snescence incluant une diminution de la prolifration cellulaire quelques semaines aprs chimiothrapie. De faon intressante, lexpression de p16INK4A dans les chantillons de COv-SHG prtraitement corrle avec une survie prolonge des patientes suite au traitement. Ceci suggre ainsi pour la premire fois un impact biologique bnfique pour la prsence de cellules cancreuses qui sont capable dactiver la snescence, particulirement pour le traitement du cancer de lovaire. Dans le but de complmenter les thrapies actuelles avec des approches de manipulation pharmacologique de la snescence, nos rsultats suggrent quil serait important de dterminer limpact positif ou ngatif de la snescence induite par la thrapie sur la progression de la maladie et la survie, pour chaque type de cancer de faon indpendante.
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Lvolution dune cellule tumorale initie une tumeur solide ncessite, chaque tape, un microenvironnement favorable sa survie et sa croissance. Le microenvironnement tumoral est compar un foyer dinflammation chronique dont la composition cellulaire et molculaire est complexe. Les cellules souches msenchymateuses (CSM) reprsentent lun des principaux acteurs cellulaires prsents. Elles migrent vers les sites tumoraux o elles soutiennent linflammation, langiogense et le dveloppement tumoral en activant plusieurs voies de signalisation. Une des voies majeures qui contribuent linflammation est la voie de signalisation NF-B. Linitiation de cette voie provient de la membrane cellulaire entre autres des cavoles. Nous soumettons lhypothse que lune des cavines, protines associes aux cavoles, modulerait le phnotype inflammatoire etou migratoire dans les CSM traites la cytokine TNF- (facteur de ncrose tumorale ) en modulant la voie de signalisation NF-B. En effet, nous avons observ une rgulation la hausse de lexpression de la COX-2 (cyclooxygnase-2) et une diminution de lexpression dIB qui sont synonymes de lactivation de la voie NF-B dans les CSM que nous avons traites au TNF-. Nous avons trouv que le TNF- induit la migration des CSM, et que la rpression gnique de la Cavine-2 augmente significativement la migration des CSM traites par le TNF-. La rpression gnique de la Cavine-2 vient aussi amplifier la tubulogense dans les CSM en rponse au TNF-. Dun point de vue molculaire, la rpression gnique de la Cavine-2 a montr une trs forte amplification de l'expression protique de la COX-2 dans les CSM en rponse au TNF-. Dans ces mmes cellules o la Cavine-2 a t rprime, et suite un traitement au TNF-, le pic de phosphorylation est plus intense et la courbe de phosphorylation est plus prolonge dans le temps. Ces observations nous permettent daffirmer que la Cavine-2 a un rle rpresseur sur lexpression de COX-2. Collectivement, nos rsultats montrent que la Cavine-2 peut tre propose comme un gne suppresseur de tumeur et est de ce fait, une bonne cible thrapeutique dans les CSM qui permettraient dagir des stades prcoces du dveloppement tumoral.
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ADP-ribosylation factor-1 (ARF1) est une petite GTPase principalement connue pour son rle dans la formation de vsicules au niveau de lappareil de Golgi. Rcemment, dans des cellules de cancer du sein, nous avons dmontr quARF1 est aussi un mdiateur important de la signalisation du rcepteur du facteur de croissance pidermique (EGFR) contrlant la prolifration, la migration et l'invasion cellulaire. Cependant, le mcanisme par lequel lEGFR active la GTPase ainsi que le rle de cette dernire dans la rgulation de la fonction du rcepteur demeure inconnue. Dans cette thse, nous avions comme objectifs de dfinir le mcanisme d'activation de ARF1 dans les cellules de cancer du sein hautement invasif et dmontrer que lactivation de cette isoforme de ARF joue un rle essentiel dans la rsistance de ces cellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nos tudes dmontrent que les protines dadaptatrices Grb2 et p66Shc jouent un rle important dans l'activation de ARF1. Alors que Grb2 favorise le recrutement dARF1 l'EGFR ainsi que l'activation de cette petite GTPase, p66Shc inhibe le recrutement du complexe Grb2-ARF1 au rcepteur et donc contribue limiter lactivation dARF1. De plus, nous dmontrons que ARF1 favorise la rsistance aux inhibiteurs des tyrosines kinases dans les cellules de cancer du sein hautement invasif. En effet, une diminution de lexpression de ARF1 a augment la sensibilit descellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nous montrons galement que de hauts niveaux de ARF1 contribuent la rsistance des cellules ces mdicaments en amliorant la survie et les signaux prolifratifs travers ERK1/2, Src et AKT, tout en bloquant les voies apoptotiques (p38MAPK et JNK). Enfin, nous mettons en vidence le rle de la protine ARF1 dans lapoptose en rponse aux traitements des inhibiteurs de lEGFR. Nos rsultats indiquent que la dpletion dARF1 promeut la mort cellulaire induite par gefitinib, en augmentant l'expression de facteurs pro-apoptotiques (p66shc, Bax), en altrant le potentiel de la membrane mitochondriale et la libration du cytochrome C. Ensemble, nos rsultats dlimitent un nouveau mcanisme d'activation de ARF1 dans les cellules du cancer du sein hautement invasif et impliquent lactivit dARF1 comme un mdiateur important de la rsistance aux inhibiteurs EGFR.
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Afin deffectuer des tudes fonctionnelles sur le gnome de la souris, notre laboratoire a gnr une bibliothque de clones de cellules souches embryonnaires (ESC) prsentant des suppressions chromosomiques chevauchantes alatoires la bibliothque DELES. Cette bibliothque contient des dltions couvrant environ 25% du gnome murin. Dans le laboratoire, nous comptons identifier de nouveaux dterminants du destin des cellules hmatopotiques en utilisant cet outil. Un crible primaire utilisant la benzidine pour dmontrer la prsence d'hmoglobine dans des corps embryodes (EBS) a permis didentifier plusieurs clones dlts prsentant un phnotype hmatopotique anormal. Comme cet essai ne vrifie que la prsence d'hmoglobine, le but de mon projet est d'tablir un essai in vitro de diffrenciation des ESC permettant de mesurer le potentiel hmatopotique de clones DELES. Mon hypothse est que lessai de diffrenciation hmatopotique publi par le Dr Keller peut tre import dans notre laboratoire et utilis pour tudier l'engagement hmatopotique des clones DELES. laide dessais de RT-QPCR et de FACS, jai pu contrler la cintique de diffrenciation hmatopotique en suivant lexpression des gnes hmatopotiques et des marqueurs de surface comme CD41, c-kit, RUNX1, GATA2, CD45, -globine 1 et TER-119. Cet essai sera utilis pour valider le potentiel hmatopotique des clones DELES candidats identifis dans le crible principal. Mon projet secondaire vise utiliser la mme stratgie rtro-virale a base de Cre-loxP utilise pour gnrer la bibliothque DELES pour gnrer une bibliothque de cellules KBM-7 contenant des suppressions chromosomiques chevauchantes. Mon but ici est de tester si la ligne cellulaire leumique humaine presque haplode KBM-7 peut tre exploite en utilisant l'approche DELES pour crer cette bibliothque. La bibliothque de clones KBM-7 servira dfinir les activits molculaires de drogues anti-leucmiques potentielless que nous avons identifies dans le laboratoire parce quelles inhibent la croissance cellulaire dans plusieurs chantillons de leucmie mylode aigu drivs de patients. Elle me permettra galement d'identifier les voies de signalisation molculaires qui, lorsque gntiquement perturbes, peuvent confrer une rsistance ces drogues.
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4-1BB (CD137) est un membre de la superfamille TNFR qui est impliqu dans la transmission des signaux de survie aux lymphocytes. TRAF1 est une protine adaptatrice qui est recrute par 4-1BB et autres TNFRs et est caractrise par une expression trs restreinte aux lymphocytes, cellules dendritiques et certaines cellules pithliales. TRAF1 est ncessaire pour lexpansion et la survie des cellules T mmoire en prsence d'agonistes anti-4-1BB in vivo. De plus, TRAF1 est requise en aval de 4-1BB pour activer (phosphoryler) la MAP kinase Erk implique dans la rgulation de la molcule pro-apoptotique Bim. Suite lactivation du rcepteur 4-1BB, TRAF1 et ERK sont impliqus dans la phosphorylation de Bim et la modulation de son expression. Lactivation et la rgulation de TRAF1 et Bim ont un rle important dans la survie des cellules T CD8 mmoires. Dans cette tude, nous avons utilis une approche protomique afin de pouvoir identifier de nouveaux partenaires de liaison de TRAF1. Utilisant cette stratgie, nous avons identifi que LSP1 (Leukocyte Specific Protein 1) est recrut dans le complexe de signalisation 4-1BB de manire TRAF1 dpendante. Une caractrisation plus pousse de linteraction entre TRAF1 et LSP1 a montr que LSP1 lie la rgion unique N-terminal de TRAF1 de faon indpendante de la rgion conserve C-terminal. linstar des cellules T dficientes en TRAF1, les cellules T dficientes en LSP1 ne sont pas capables dactiver ERK en aval de 4-1BB et par consquent ne peuvent pas rguler Bim. Ainsi, TRAF1 et LSP1 cooprent en aval de 4-1BB dans le but dactiver ERK et rguler en aval les niveaux de Bim dans les cellules T CD8. Selon la littrature, le rcepteur 4-1BB nest pas exprim la surface des cellules B murines, mais le rcepteur 4-1BB favorise la prolifration et la survie des cellules B humaines. Cependant, il est important d'tudier l'expression du rcepteur 4-1BB dans les cellules B murines afin de disposer d'un modle murin et de prdire la rponse clinique la manipulation de 4-1BB. En utilisant diffrentes stimulations de cellules B murines primaires, nous avons identifi que le rcepteur 4-1BB est exprim la surface des cellules B de souris suite une stimulation avec le LPS (Lipopolysaccharides). Une caractrisation plus pousse a montr que le rcepteur 4-1BB est induit dans les cellules B murines d'une manire dpendante de TLR4 (Toll Like Receptor 4). Collectivement, notre travail a dmontr que la stimulation avec le LPS induit lexpression du rcepteur 4-1BB la surface des cellules B murines, menant ainsi l'induction de TRAF1. De plus, TRAF1 et LSP1 cooprent en aval de 4-1BB pour activer la signalisation de la Map kinase ERK dans les cellules B murines de manire similaire aux cellules T. Les cellules B dficientes en TRAF1 et les cellules B dficientes en LSP1 ne sont pas en mesure d'activer la voie ERK en aval de 4-1BB et montrent un niveau dexpression du rcepteur significativement diminu compar aux cellules B dune souris WT. Ainsi, TRAF1 et LSP1 sont ncessaires pour une expression maximale du rcepteur 4-1BB la surface cellulaire de cellules B murines et cooprent en aval de 4-1BB afin d'activer la cascade ERK dans les cellules B murines.
Resumo:
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