Computational modelling of human stem cell-derived cardiomyocytes - Texture descriptors for biological image processing

This thesis investigates two distinct research topics. The main topic (Part I) is the computational modelling of cardiomyocytes derived from human stem cells, both embryonic (hESC-CM) and induced-pluripotent (hiPSC-CM). The aim of this research line lies in developing models of the electrophysiology of hESC-CM and hiPSC-CM in order to integrate the available experimental data and getting in-silico models to be used for studying/making new hypotheses/planning experiments on aspects not fully understood yet, such as the maturation process, the functionality of the Ca2+ hangling or why the hESC-CM/hiPSC-CM action potentials (APs) show some differences with respect to APs from adult cardiomyocytes. Chapter I.1 introduces the main concepts about hESC-CMs/hiPSC-CMs, the cardiac AP, and computational modelling. Chapter I.2 presents the hESC-CM AP model, able to simulate the maturation process through two developmental stages, Early and Late, based on experimental and literature data. Chapter I.3 describes the hiPSC-CM AP model, able to simulate the ventricular-like and atrial-like phenotypes. This model was used to assess which currents are responsible for the differences between the ventricular-like AP and the adult ventricular AP. The secondary topic (Part II) consists in the study of texture descriptors for biological image processing. Chapter II.1 provides an overview on important texture descriptors such as Local Binary Pattern or Local Phase Quantization. Moreover the non-binary coding and the multi-threshold approach are here introduced. Chapter II.2 shows that the non-binary coding and the multi-threshold approach improve the classification performance of cellular/sub-cellular part images, taken from six datasets. Chapter II.3 describes the case study of the classification of indirect immunofluorescence images of HEp2 cells, used for the antinuclear antibody clinical test. Finally the general conclusions are reported.

Utilizzo del DNA come archivio digitale a lungo termine

La tesi riguarda l'utilizzo del DNA come archivio digitale; vengono mostrati i vantaggi di questo approccio concettuale, il metodo di codifica per ottenere le stringhe di DNA partendo da un generico file, l'efficienza del protocollo e i suoi costi.

Plasticity in body and peripersonal space representations

A successful interaction with objects in the environment requires integrating information concerning object-location with the shape, dimension and position of body parts in space. The former information is coded in a multisensory representation of the space around the body, i.e. peripersonal space (PPS), whereas the latter is enabled by an online, constantly updated, action-orientated multisensory representation of the body (BR) that is critical for action. One of the critical features of these representations is that both PPS and BR are not fixed, but they dynamically change depending on different types of experience. In a series of experiment, I studied plastic properties of PPS and BR in humans. I have developed a series of methods to measure the boundaries of PPS representation (Chapter 4), to study its neural correlates (Chapter 3) and to assess BRs. These tasks have been used to study changes in PPS and BR following tool-use (Chapter 5), multisensory stimulation (Chapter 6), amputation and prosthesis implantation (Chapter 7) or social interaction (Chapter 8). I found that changes in the function (tool-use) and the structure (amputation and prosthesis implantation) of the physical body elongate or shrink both PPS and BR. Social context and social interaction also shape PPS representation. Such high degree of plasticity suggests that our sense of body in space is not given at once, but it is constantly constructed and adapted through experience.

Alzheimer: analisi di un modello matematico che include il ruolo dei prioni

Nella tesi è stata studiata stabilità e ben posizione di un'equazione differenziale che codifica la progressione dell'Alzheimer

Metodologie di caratterizzazione della smoothness di movimenti volontari di arto superiore

Ormai da diversi anni vengono utilizzate tecnologie più o meno sofisticate in ambito riabilitativo, grazie alle conoscenze sviluppate nel campo della medicina riabilitativa e in altri ambiti tra i quali le neuroscienze, la neurofiiologia, la biomeccanica e l'imaging. La ricerca tecnologica più avanzata in questo settore coinvolge dispositivi robotici e realtà virtuale con lo scopo di arrivare ad ottenere tecniche sempre migliori. Questo approccio è anche la base di studi del movimento e l'interesse che si ha riguardo al modo in cui avvengono la pianificazione e l'esecuzione dell'atto motorio. Di particolare rilevanza sono i submovimenti, ovvero le frammentazioni che compongono un movimento continuo umano, i quali forniscono un'analisi compatta di codifica del moto e si rivelano i principali responsabili della caratteristica di smoothness delle traiettorie risultanti. Sotto l'ipotesi che esistano tali unità discrete, la capacità di isolarle e caratterizzarle accuratamente fornisce una descrizione dell'atto motorio, dunque un'analisi che può portare a nuove scoperte negli studi delle performance motorie, della riabilitazione e del sistema di controllo motorio nell'uomo. Il presente elaborato mostra una panoramica all'approccio dello studio del movimento e della sua decomposizione, partendo dal modo in cui viene generato e controllato all'interno del nostro organismo, fino alle tecniche computazionali sfruttate per modellare ciò che avviene nel sistema motorio. Il primo capitolo centra il problema nel suo contesto di utilizzo, ovvero quello della riabilitazione neuromotoria con la quale si cerca di sfruttare le tecniche più innovative per ottenere risultati più efficienti e soddisfacenti e sempre meno soggettivi. Il capitolo successivo fornisce la visione anatomo-fisiologica del problema, infatti si cerca di spiegare il funzionamento generale di produzione dei comandi motori a cui seguono la vera e propria attuazione e l'eventuale correzione; alla base di questo meccanismo sta anche la possibilità di rendere efficaci le suddette tecniche riabilitative. Sono, poi, introdotti i submovimenti e le conclusioni a cui si è arrivati nel corso degli anni grazie a varie ricerche di caratterizzazione della smoothness che mettono in relazione tale caratteristica con i submovimenti stessi. Nella terza parte si ha una visione d'insieme del modo in cui le tecnologie più recenti possono essere applicate nell'ambito di studio della tesi: la realtà virtuale, così come la robotica, giocano un ruolo fondamentale per la misurazione e la rilevazione della cinematica del corpo umano (nel caso specifico, la cinematica dell'arto superiore). Nel quarto capitolo vengono descritti alcuni modelli con cui si cerca di estrarre le proprietà del movimento per poterne comprendere al meglio la natura ed il modo in cui viene generato. Si conclude il lavoro spiegando come l'elaborato possa essere sfruttato quale base per costruire prove sperimentali e di come le tecniche presentate possano essere utilizzate in contesti ancora più innovativi.

Espressione eterologa e purificazione della istone deacetilasi umana 1 (HDAC1)

La proteina umana HDAC1 fa parte della famiglia delle HDAC (Istone Deacetilasi); questi enzimi, ad azione deacetilasica, catalizzano la reazione di rimozione di un gruppo acetile a livello degli istoni, componenti fondamentali della cromatina, la cui struttura influenza il ciclo cellulare e la regolazione dell’espressione genica. L’importanza della proteina in questione, a scopo terapeutico, risiede nello studio degli inibitori ad essa associati, i quali risultano utili a livello farmacologico, come coadiuvanti nelle terapie per la cura di tumori. La produzione di HDAC1 ha previsto l’utilizzo di due diversi ceppi del batterio Escherichia coli, denominati TOP10 e BW25993, che sono serviti come sistemi “ospiti” per l’inserimento del vettore di espressione pBAD-HDAC1 contenente la porzione di DNA che codifica per la proteina ricombinante. Sono state determinate le condizioni più idonee, per entrambi i sistemi analizzati, in modo da massimizzare l’espressione della proteina indotta mediante aggiunta di arabinosio al terreno di coltura. A seconda della combinazione ceppo-vettore, infatti, il livello di espressione ottenuto cambia significativamente. In seguito, gli estratti proteici totali sono stati sottoposti a purificazione mediante diversi passaggi cromatografici ed è stata determinata la resa finale del processo. La caratterizzazione della proteina ricombinante purificata ha evidenziato una forma aggregata, di tipo ottamerico, che potrebbe influenzare l’attività enzimatica. Per questo motivo sono stati portati avanti numerosi tentativi di dissociazione dell’oligomero incubando HDAC1 con diversi agenti. Un effetto disaggregante è stato osservato solo in presenza di due detergenti, SDS (anionico) e CTAB (cationico), i quali hanno permesso di ottenere la proteina in forma monomerica. Tra i due detergenti, l’SDS è risultato più efficace, mentre per il CTAB si richiedono ulteriori indagini ed approfondimenti. Altri studi, infine, sono auspicabili ai fini di migliorare ulteriormente la fase di espressione, in modo da rendere il protocollo di produzione adatto ad un’applicazione a livello industriale.

Trasformate wavelet

La presente tesi vuole dare una descrizione delle Trasformate Wavelet indirizzata alla codifica dell’immagine in formato JPEG2000. Dopo aver quindi descritto le prime fasi della codifica di un’immagine, procederemo allo studio dei difetti derivanti dall’analisi tramite la Trasformata Discreta del Coseno (utilizzata nel formato predecessore JPEG). Dopo aver quindi descritto l’analisi multirisoluzione e le caratteristiche che la differenziano da quest’ultima, analizzeremo la Trasformata Wavelet dandone solo pochi accenni teorici e cercando di dedurla, in una maniera più indirizzata all’applicazione. Concluderemo la tesi descrivendo la codifica dei coefficienti calcolati, e portando esempi delle innumerevoli applicazioni dell’analisi multirisoluzione nei diversi campi scientifici e di trasmissione dei segnali.

Engineering the synthesis of lantibiotics in e. Coli by combining the cynnamicin and nisin modification systems.

I lantibiotici sono molecole peptidiche prodotte da un gran numero di batteri Gram-positivi, posseggono attività antibatterica contro un ampio spettro di germi, e rappresentano una potenziale soluzione alla crescente problematica dei patogeni multi-resistenti. La loro attività consiste nel legame alla membrana del bersaglio, che viene quindi destabilizzata mediante l’induzione di pori che determinano la morte del patogeno. Tipicamente i lantibiotici sono formati da un “leader-peptide” e da un “core-peptide”. Il primo è necessario per il riconoscimento della molecola da parte di enzimi che effettuano modifiche post-traduzionali del secondo - che sarà la regione con attività battericida una volta scissa dal “leader-peptide”. Le modifiche post-traduzionali anticipate determinano il contenuto di amminoacidi lantionina (Lan) e metil-lantionina (MeLan), caratterizzati dalla presenza di ponti-tioetere che conferiscono maggior resistenza contro le proteasi, e permettono di aggirare la principale limitazione all’uso dei peptidi in ambito terapeutico. La nisina è il lantibiotico più studiato e caratterizzato, prodotto dal batterio L. lactis che è stato utilizzato per oltre venti anni nell’industria alimentare. La nisina è un peptide lungo 34 amminoacidi, che contiene anelli di lantionina e metil-lantionina, introdotti dall’azione degli enzimi nisB e nisC, mentre il taglio del “leader-peptide” è svolto dall’enzima nisP. Questo elaborato affronta l’ingegnerizzazione della sintesi e della modifica di lantibiotici nel batterio E.coli. In particolare si affronta l’implementazione dell’espressione eterologa in E.coli del lantibiotico cinnamicina, prodotto in natura dal batterio Streptomyces cinnamoneus. Questo particolare lantibiotico, lungo diciannove amminoacidi dopo il taglio del leader, subisce modifiche da parte dell’enzima CinM, responsabile dell’introduzione degli aminoacidi Lan e MeLan, dell’enzima CinX responsabile dell’idrossilazione dell’acido aspartico (Asp), e infine dell’enzima cinorf7 deputato all’introduzione del ponte di lisinoalanina (Lal). Una volta confermata l’attività della cinnamicina e di conseguenza quella dell’enzima CinM, si è deciso di tentare la modifica della nisina da parte di CinM. A tal proposito è stato necessario progettare un gene sintetico che codifica nisina con un leader chimerico, formato cioè dalla fusione del leader della cinnamicina e del leader della nisina. Il prodotto finale, dopo il taglio del leader da parte di nisP, è una nisina completamente modificata. Questo risultato ne permette però la modifica utilizzando un solo enzima invece di due, riducendo il carico metabolico sul batterio che la produce, e inoltre apre la strada all’utilizzo di CinM per la modifica di altri lantibiotici seguendo lo stesso approccio, nonché all’introduzione del ponte di lisinoalanina, in quanto l’enzima cinorf7 necessita della presenza di CinM per svolgere la sua funzione.

Codici ciclici e basi di Gröbner

Richiamo di elementi di algebra, tra cui: polinomi, ordini monomiali e base di Gröbner per ideali e sottomoduli con anche algoritmo FGLM. Descrizione dei codici, dei codici lineari, codifica e decodifica, matrice generatrice, matrice forma standard, matrice di controllo parità, codici ciclici con corrispondenza con ideali e polinomi generatori. Codice Reed-Solomon caso particolare di codice ciclico. Codici ciclici m-dimensionali e codifica sistematica con basi di Gröbner. Algoritmo di decodifica per Reed-Solomon con soluzione chiave e utilizzando basi di Gröbner sui sottomoduli.

Polar Codes for error correction: Analysis and Decoding Algorithms

I Polar Codes sono la prima classe di codici a correzione d’errore di cui è stato dimostrato il raggiungimento della capacità per ogni canale simmetrico, discreto e senza memoria, grazie ad un nuovo metodo introdotto recentemente, chiamato ”Channel Polarization”. In questa tesi verranno descritti in dettaglio i principali algoritmi di codifica e decodifica. In particolare verranno confrontate le prestazioni dei simulatori sviluppati per il ”Successive Cancellation Decoder” e per il ”Successive Cancellation List Decoder” rispetto ai risultati riportati in letteratura. Al fine di migliorare la distanza minima e di conseguenza le prestazioni, utilizzeremo uno schema concatenato con il polar code come codice interno ed un CRC come codice esterno. Proporremo inoltre una nuova tecnica per analizzare la channel polarization nel caso di trasmissione su canale AWGN che risulta il modello statistico più appropriato per le comunicazioni satellitari e nelle applicazioni deep space. In aggiunta, investigheremo l’importanza di una accurata approssimazione delle funzioni di polarizzazione.

La enseñanza del diccionario escolar como fuente de información léxico-gramatical para el alumno

El diccionario escolar y, por extensión, cualquier diccionario lingüístico, es una obra en la que se codifica la máxima cantidad posible de conocimientos lingüísticos. Allí se disponen, en forma de definiciones, abreviaturas, ejemplos y notas, informaciones acerca del significado, la pronunciación, la ortografía, la categoría gramatical, el género, la morfología, la sintaxis, el registro y la familia de las palabras, entre otras. El objetivo del presente trabajo es proveer de algunas pautas para utilizar el diccionario en el aula no sólo como un libro al que se acude para consultar el significado de un vocablo, sino como una fuente de información léxico-gramatical invalorable para el alumno, que resulta útil para la comprensión y la producción textuales en la escuela. Por otra parte, haremos referencia a las convenciones que "ordenan" estas informaciones en el diccionario y a la necesidad de que el alumno sea entrenado en su manejo para alcanzar una correcta decodificación. Para ello, explicaremos los usos del diccionario en el aula que resultan inadecuados y brindaremos algunas recomendaciones para la enseñanza de su uso de acuerdo al tipo de público, las habilidades con las que cuenta y las destrezas que se deben desarrollar

La enseñanza del diccionario escolar como fuente de información léxico-gramatical para el alumno

El diccionario escolar y, por extensión, cualquier diccionario lingüístico, es una obra en la que se codifica la máxima cantidad posible de conocimientos lingüísticos. Allí se disponen, en forma de definiciones, abreviaturas, ejemplos y notas, informaciones acerca del significado, la pronunciación, la ortografía, la categoría gramatical, el género, la morfología, la sintaxis, el registro y la familia de las palabras, entre otras. El objetivo del presente trabajo es proveer de algunas pautas para utilizar el diccionario en el aula no sólo como un libro al que se acude para consultar el significado de un vocablo, sino como una fuente de información léxico-gramatical invalorable para el alumno, que resulta útil para la comprensión y la producción textuales en la escuela. Por otra parte, haremos referencia a las convenciones que "ordenan" estas informaciones en el diccionario y a la necesidad de que el alumno sea entrenado en su manejo para alcanzar una correcta decodificación. Para ello, explicaremos los usos del diccionario en el aula que resultan inadecuados y brindaremos algunas recomendaciones para la enseñanza de su uso de acuerdo al tipo de público, las habilidades con las que cuenta y las destrezas que se deben desarrollar

La enseñanza del diccionario escolar como fuente de información léxico-gramatical para el alumno

El diccionario escolar y, por extensión, cualquier diccionario lingüístico, es una obra en la que se codifica la máxima cantidad posible de conocimientos lingüísticos. Allí se disponen, en forma de definiciones, abreviaturas, ejemplos y notas, informaciones acerca del significado, la pronunciación, la ortografía, la categoría gramatical, el género, la morfología, la sintaxis, el registro y la familia de las palabras, entre otras. El objetivo del presente trabajo es proveer de algunas pautas para utilizar el diccionario en el aula no sólo como un libro al que se acude para consultar el significado de un vocablo, sino como una fuente de información léxico-gramatical invalorable para el alumno, que resulta útil para la comprensión y la producción textuales en la escuela. Por otra parte, haremos referencia a las convenciones que "ordenan" estas informaciones en el diccionario y a la necesidad de que el alumno sea entrenado en su manejo para alcanzar una correcta decodificación. Para ello, explicaremos los usos del diccionario en el aula que resultan inadecuados y brindaremos algunas recomendaciones para la enseñanza de su uso de acuerdo al tipo de público, las habilidades con las que cuenta y las destrezas que se deben desarrollar

Caracterización molecular del mutante riso 1508 de cebada : modificaciones transcripcionales y posttranscripcionales en el desarrollo de la semilla

La semilla es el principal órgano reproductivo de las plantas espermatofitas, permitiendo la dispersión de las poblaciones y asegurando su supervivencia gracias a su tolerancia a la desecación y a su capacidad para germinar bajo condiciones ambientales óptimas. El rendimiento y valor económico de los cereales, que constituyen la primera cosecha mundial, depende, en buena medida, de la eficacia con que se acumulan en la semilla sustancias de reserva: proteínas, carbohidratos y lípidos. El principal carbohidrato acumulado en la semilla de cebada es el almidón y la fracción mayoritaria de proteínas es la de las prolaminas (solubles en etanol al 70%); estas proteínas tienen muy bajo contenido en lisina, un aminoácido esencial en la dieta de animales monogástricos. Con el fin de mejorar el valor nutricional de la semilla de cebada, se han obtenido diferentes mutantes con un mayor contenido en este aminoácido. Riso 1508 es un mutante de cebada rico en lisina cuya mutación lys3a, de efectos pleiotrópicos, segrega como un único gen mendeliano. Entre otros, presenta una reducción drástica de la expresión de algunos genes que codifican proteínas de reserva de tipo prolamina, en concreto, presenta reducida la expresión de los genes que codifican B-, C- y ϒ-Hordeínas y del inhibidor de tripsina CMe, pero no tiene alterada la expresión del gen que codifica las D-Hordeínas. Este último gen carece en su promotor del motivo GLM (5’‐(G/A)TGA(G/C)TCA(T/C)‐3’), que es reconocido por factores transcripcionales bZIP. En este trabajo, el mutante de cebada Riso 1508 se ha utilizado como herramienta para profundizar en el conocimiento de la regulación génica en semillas durante las fases de la maduración y la germinación. Para ello, en una primera aproximación, se llevó a cabo un análisis transcriptómico comparando el genotipo mutante con el silvestre durante la maduración de la semilla. Además de confirmar variaciones en los genes que codifican proteínas de reserva, este análisis indicó que también estaban afectados los genes relacionados con metabolismo de carbohidratos. Por ello se decidió caracterizar la familia multigénica de sacarosas sintasa (SUSy) en cebada. Se anotaron dos nuevos genes, HvSs3 y HvSs4, cuya expresión se comparó con la de los genes HvSs1 y HvSs2, previamente descritos en el laboratorio. La expresión de los cuatro genes en tejidos diferentes y su respuesta a estreses abióticos se analizó mediante RT-qPCR. HvSs1 y HvSs2 se expresaron preferencialmente durante el desarrollo del endospermo, y HvSs1 también fue un tránscrito abundante durante la germinación. HvSs1 se indujo en hojas en condiciones de anoxia y HvSs3 por estrés hídrico, y ambos genes se indujeron por tratamientos de frío. La localización subcelular de las cuatro isoformas no fue sólo citoplásmica, sino que también se localizaron en zonas próximas a retículo endoplásmico y en la cara interna de la membrana plasmática; además, se observó una co-localización de HvSS1 con el marcador de mitocondrias. Estos datos sugieren un papel distinto aunque parcialmente solapante de las cuatro Sacarosa Sintasas de cebada, descritas hasta la fecha. Las cinéticas de expresión de los genes que codifican los TFs más importantes implicados en la regulación génica durante el desarrollo del endospermo de cebada, se analizaron por RT-qPCR en ambos genotipos, demostrando que los TFs de la clase DOF aparecieron desregulados durante todo el proceso en Riso 1508 comparado con el cv. Bomi, aunque también se observaron diferencias significativas en algunos de los que codifican bZIPs. Estudios previos indicaban que el ortólogo de BLZ2 en maíz, O2, se regula post-traduccionalmente mediante un mecanismo de fosforilación/defosforilación reversible, y que la forma defosforilada es la fisiológicamente activa. En este trabajo se demostró que BLZ2 está sujeto a este tipo de regulación y que la proteín-fosfatasa HvPP2C2 está implicada en el proceso. La interacción de HvPP2C2 y BLZ2 tiene lugar en el núcleo celular únicamente en presencia de 100 μM ABA. En el mutante Riso 1508, BLZ2 se encuentra en un estado hiperfosforilado tanto durante la maduración como durante la germinación de la semilla, lo que dificultaría la unión de BLZ2 a las secuencias GLM en los promotores de los genes que codifican B-, C-,y ϒ- Hordeínas y CMe. Summary The seed is the main reproductive organ of spermatophyte plants allowing the spread of populations and ensuring their survival through its desiccation tolerance and because of their ability to germinate under optimum environmental conditions. Yield and economic value of cereal crops, that constitute the first world crop, depend largely on the efficiency with which they accumulate in the seed reserve substances: proteins, carbohydrates and lipids. The main carbohydrate accumulated in the barley seed is starch and the major protein fraction is that of prolamins (soluble in 70% ethanol); these proteins have a very low lysine content, an essential amino-acid for the diet of monogastric animals. In order to improve the nutritional value of the barley seed, different mutants have been obtained with a higher content of this amino-acid. Riso 1508 is one lysine-rich mutant whose mutation (lys3a) segregates as a single Mendelian gene with pleiotropic effects, such as a drastic reduction of genes encoding the trypsin inhibitor CMe and the B-, C-and ϒ-hordeins, but has not altered the expression of the gene encoding the D-hordeins. This latter gene lacks in its promotor the GLM motif (5’‐(G/A)TGA(G/C)TCA(T/C)‐3’), that is recognised by bZIP transcription factors In this work we have used the barley mutant Riso 1508 as a tool for better understanding gene regulation in seeds during the maturation and germination phases. To this aim, a transcriptomic analysis was performed comparing wild and mutant genotypes during seed maturation. Besides confirming variations in the expression of genes encoding reserve proteins, this analysis indicated that some genes related with carbohydrate metabolism were also affected. It was therefore decided to characterize the multigene family of sucrose synthases (SUSy) in barley. Two new genes were annotated, HvSs3 and HvSs4, and its expression was compared with that of genes HvSs1 and HvSs2, previously described in our laboratory. The expression of the four genes in different tissues and in response to abiotic stresses was analyzed by RTqPCR. HvSs1 and HvSs2 were preferentially expressed during the development of the endosperm, and the HvSs1 transcript was also abundant upon germination. HvSs1 was induced in leaves by anoxic conditions, HvSs3 by water stress, and both genes were induced by cold treatments. The subcellular localization of all four isoforms was not only cytoplasmic, but they could be found along the endoplasmic reticulum and at the inner side of the cell membrane; HvSS1, was also associated with the mitochondrial marker. These data suggest a distinct but partially overlapping roles for the barley sucrose synthases, described so far. The expression kinetics of the genes encoding the most important TFs involved in gene regulation during barley endosperm development was analyzed by RT-qPCR in both genotypes. These data show that the genes encoding DOF TFs were mis-regulated throughout the process in Riso 1508, although significant differences were also found among some of those encoding bZIPs. Previous studies indicated that the BLZ2 orthologue in maize, O2, was post-translationally regulated by reversible phosphorylation/dephosphorylation and that the dephosphorylated protein is the physiologically active form. In this work we demostrate that BLZ2 is under a similar regulation and that the proteinphosphatase HvPP2C2 is implicated in the process. The interaction between HvPP2C2 and BLZ2 takes place in the cell nucleus only in the presence of 100 μM ABA. In the Riso 1508 mutant, BLZ2 is found in a hyperphosphorylated state in the maturation phase and upon seed germination; because of this, the BLZ2 binding to the GLM promoter sequences of genes encoding B-, C- y ϒ- Hordeins and CMe would be decreased in the mutant.

Estudio molecular de gluteninas de alto y bajo peso molecular en Triticum aestivum ssp. vulgare L. y su relación con la calidad panadera

El trigo blando (Triticum aestivum ssp vulgare L., AABBDD, 2n=6x=42) presenta propiedades viscoélasticas únicas debidas a la presencia en la harina de las prolaminas: gluteninas y gliadinas. Ambos tipos de proteínas forman parte de la red de gluten. Basándose en la movilidad en SDS-PAGE, las gluteninas se clasifican en dos grupos: gluteninas de alto peso molecular (HMW-GS) y gluteninas de bajo peso molecular (LMW-GS). Los genes que codifican para las HMW-GS se encuentran en tres loci del grupo 1 de cromosomas: Glu-A1, Glu-B1 y Glu-D1. Cada locus codifica para uno o dos polipéptidos o subunidades. La variación alélica de las HMW-GS es el principal determinante de de la calidad harino-panadera y ha sido ampliamente estudiado tanto a nivel de proteína como de ADN. El conocimiento de estas proteínas ha contribuido sustancialmente al progreso de los programas de mejora para la calidad del trigo. Comparadas con las HMW-GS, las LMW-GS forman una familia proteica mucho más compleja. La mayoría de los genes LMW se localizan en el grupo 1 de cromosomas en tres loci: Glu-A3, Glu-B3 y Glu-D3 que se encuentran estrechamente ligados a los loci que codifican para gliadinas. El número de copias de estos genes ha sido estimado entre 10-40 en trigo hexaploide, pero el número exacto aún se desconoce debido a la ausencia de un método eficiente para diferenciar los miembros de esta familia multigénica. La nomenclatura de los alelos LMW-GS por electroforesis convencional es complicada, y diferentes autores asignan distintos alelos a la misma variedad lo que dificulta aún más el estudio de esta compleja familia. El uso de marcadores moleculares para la discriminación de genes LMW, aunque es una tarea dificil, puede ser muy útil para los programas de mejora. El objetivo de este trabajo ha sido profundizar en la relación entre las gluteninas y la calidad panadera y desarrollar marcadores moleculares que permitan ayudar en la correcta clasificación de HMW-GS y LMW-GS. Se han obtenido dos poblaciones de líneas avanzadas F4:6 a partir de los cruzamientos entre las variedades ‘Tigre’ x ‘Gazul’ y ‘Fiel’ x ‘Taber’, seleccionándose para los análisis de calidad las líneas homogéneas para HMW-GS, LMW-GS y gliadinas. La determinación alélica de HMW-GS se llevó a cabo por SDS-PAGE, y se complementó con análisis moleculares, desarrollándose un nuevo marcador de PCR para diferenciar entre las subunidades Bx7 y Bx7*del locus Glu-B1. Resumen 2 La determinación alélica para LMW-GS se llevó a cabo mediante SDS-PAGE siguiendo distintas nomenclaturas y utilizando variedades testigo para cada alelo. El resultado no fue concluyente para el locus Glu-B3, así que se recurrió a marcadores moleculares. El ADN de los parentales y de los testigos se amplificó usando cebadores diseñados en regiones conservadas de los genes LMW y fue posteriormente analizado mediante electroforesis capilar. Los patrones de amplificación obtenidos fueron comparados entre las distintas muestras y permitieron establecer una relación con los alelos de LMW-GS. Con este método se pudo aclarar la determinación alélica de este locus para los cuatro parentales La calidad de la harina fue testada mediante porcentaje de contenido en proteína, prueba de sedimentación (SDSS) y alveógrafo de Chopin (parámetros P, L, P/L y W). Los valores fueron analizados en relación a la composición en gluteninas. Las líneas del cruzamiento ‘Fiel’ x ‘Taber’ mostraron una clara influencia del locus Glu-A3 en la variación de los valores de SDSS. Las líneas que llevaban el nuevo alelo Glu-A3b’ presentaron valores significativamente mayores que los de las líneas con el alelo Glu-A3f. En las líneas procedentes del cruzamiento ‘Tigre ’x ‘Gazul’, los loci Glu-B1 y Glu-B3 loci mostraron ambos influencia en los parámetros de calidad. Los resultados indicaron que: para los valores de SDSS y P, las líneas con las HMW-GS Bx7OE+By8 fueron significativamente mejores que las líneas con Bx17+By18; y las líneas que llevaban el alelo Glu-B3ac presentaban valores de P significativamente superiores que las líneas con el alelo Glu-B3ad y significativamente menores para los valores de L . El análisis de los valores de calidad en relación a los fragmentos LMW amplificados, reveló un efecto significativo entre dos fragmentos (2-616 y 2-636) con los valores de P. La presencia del fragmento 2-636 estaba asociada a valores de P mayores. Estos fragmentos fueron clonados y secuenciados, confirmándose que correspondían a genes del locus Glu-B3. El estudio de la secuencia reveló que la diferencia entre ambos se hallaba en algunos SNPs y en una deleción de 21 nucleótidos que en la proteína correspondería a un InDel de un heptapéptido en la región repetida de la proteína. En este trabajo, la utilización de líneas que difieren en el locus Glu-B3 ha permitido el análisis de la influencia de este locus (el peor caracterizado hasta la fecha) en la calidad panadera. Además, se ha validado el uso de marcadores moleculares en la determinación alélica de las LMW-GS y su relación con la calidad panadera. Summary 3 Bread wheat (Triticum aestivum ssp vulgare L., AABBDD, 2n=6x=42) flour has unique dough viscoelastic properties conferred by prolamins: glutenins and gliadins. Both types of proteins are cross-linked to form gluten polymers. On the basis of their mobility in SDS-PAGE, glutenins can be classified in two groups: high molecular weight glutenins (HMW-GS) and low molecular weight glutenins (LMW-GS). Genes encoding HMW-GS are located on group 1 chromosomes in three loci: Glu-A1, Glu-B1 and Glu-D1, each one encoding two polypeptides, named subunits. Allelic variation of HMW-GS is the most important determinant for bread making quality, and has been exhaustively studied at protein and DNA level. The knowledge of these proteins has substantially contributed to genetic improvement of bread quality in breeding programs. Compared to HMW-GS, LMW-GS are a much more complex family. Most genes encoded LMW-GS are located on group 1 chromosomes. Glu-A3, Glu-B3 and Glu-D3 loci are closely linked to the gliadin loci. The total gene copy number has been estimated to vary from 10–40 in hexaploid wheat. However, the exact copy number of LMW-GS genes is still unknown, mostly due to lack of efficient methods to distinguish members of this multigene family. Nomenclature of LMW-GS alleles is also unclear, and different authors can assign different alleles to the same variety increasing confusion in the study of this complex family. The use of molecular markers for the discrimination of LMW-GS genes might be very useful in breeding programs, but their wide application is not easy. The objective of this work is to gain insight into the relationship between glutenins and bread quality, and the developing of molecular markers that help in the allele classification of HMW-GS and LMW-GS. Two populations of advanced lines F4:6 were obtained from the cross ‘Tigre’ x ‘Gazul’ and ‘Fiel’ x ‘Taber’. Lines homogeneous for HMW-GS, LMW-GS and gliadins pattern were selected for quality analysis. The allele classification of HMW-GS was performed by SDS-PAGE, and then complemented by PCR analysis. A new PCR marker was developed to undoubtedly differentiate between two similar subunits from Glu-B1 locus, Bx7 and Bx7*. The allele classification of LMW-GS was initially performed by SDS-PAGE following different established nomenclatures and using standard varieties. The results were not completely concluding for Glu-B3 locus, so a molecular marker system was applied. DNA from parental lines and standard varieties was amplified using primers designed in conserved domains of LMW genes and analyzed by capillary electrophoresis. The pattern of amplification products obtained was compared among samples and related to the protein allele classification. It was possible to establish a correspondence between specific amplification products and almost all LMW alleles analyzed. With this method, the allele classification of the four parental lines was clarified. Flour quality of F4:6 advanced lines were tested by protein content, sedimentation test (SDSS) and alveograph (P, L, P/L and W). The values were analyzed in relation to the lines prolamin composition. In the ‘Fiel’ x ‘Taber’ population, Glu-A3 locus showed an influence in SDSS values. Lines carrying new allele Glu-A3b’, presented a significantly higher SDSS value than lines with Glu-A3f allele. In the ‘Tigre ’x ‘Gazul’ population, the Glu-B1 and Glu-B3 loci also showed an effect in quality parameters, in SDSS, and P and L values. Results indicated that: for SDSS and P, lines with Bx7OE+By8 were significantly better than lines with Bx17+By18; lines carrying Glu-B3ac allele had a significantly higher P values than Glu-B3ad allele values. lines with and lower L The analysis of quality parameters and amplified LMW fragments revealed a significant influence of two peaks (2-616 y 2-636) in P values. The presence of 2-636 peak gave higher P values than 2-616. These fragments had been cloned and sequenced and identified as Glu-B3 genes. The sequence analysis revealed that the molecular difference between them was some SNPs and a small deletion of 21 nucleotides that in the protein would produce an InDel of a heptapeptide in the repetitive region. In this work, the analysis of two crosses with differences in Glu-3 composition has made possible to study the influence of LMG-GS in quality parameters. Specifically, the influence of Glu-B3, the most interesting and less studied loci has been possible. The results have shown that Glu-B3 allele composition influences the alveograph parameter P (tenacity). The existence of different molecular variants of Glu-B3 alleles have been assessed by using a molecular marker method. This work supports the use of molecular approaches in the study of the very complex LMW-GS family, and validates their application in the analysis of advanced recombinant lines for quality studies.