七叶树组织及细胞培养产生生育酚的研究

从七叶树（Aesculus Chinensis Bunge）的未成熟的果实的子叶中诱导出愈伤组织;愈伤组织在pH5.8，温度26 ± 1 ℃，加有NAA，TBA，K，CA的MS培养基上生长良好。光对愈伤组织的生长有促进作用，植醇对生长有抑制作用;进行了发酵罐培养。 利用TLC、质谱分离鉴定了γ-生育酚的存在，并利用HPLC、荧光法测定了生育酚的含量。结果表明，愈伤组织中生育酚的含量在3.2～6.6mg/100g干重;光对生育酚的合成有促进作用;植醇是生育酚合成的可能前体;悬浮培养不利于生育酚的合成，培养液中没有发现生育酚的存在。生育酚的合成与组织的生长速率成正相关。

猕猴桃属两个种的原生质体培养与体细胞杂交

猕猴桃是重要的栽培果树，但目前栽培品种过于单一，不能满足生产和消费的需求。由于猕猴桃的雌雄异株特性、种间杂交亲合性差、遗传上高度杂合以及育种周期长等特点，常规杂交育种困难很大。现代生物技术，如原生质体培养和体细胞杂交等，为培育新品种提供了新途径。 毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)和软枣猕猴桃(A.arguta)是猕猴桃属中具有重要利用价值的两个种。毛花猕猴桃果实大小在猕猴桃属中次于中华猕猴桃(A.chinensis)和美味猕猴桃(A.deliciosa)列第三位，果实维生素C含量达1014 mg/l00 g FW。软枣猕猴桃极耐寒，在-40℃下可安全越冬，其果实表面光滑无毛。这两个种是品种改良的重要种质资源。 作为生物技术基础的组织培养与植株再生系统，在毛花猕猴桃上尚未见报道。软枣猕猴桃的组织培养仅有一例报道，且芽分化率和分化系数都很低。这两个种的原生质体培养及与美味猕猴桃的原生质体融合也未见报道。针对这种情况，本试验对毛花猕猴桃和软枣猕猴桃的组织培养、原生质体培养及其与美味猕猴桃品种“Hayward”的原生质体融合进行研究，结果建立了较理想的毛花猕猴桃和软枣猕猴桃组织培养系统;首次从毛花猕猴桃原生质体得到再生植株和从软枣猕猴桃原生质体培养再生愈伤组织;通过改进融合方法，建立了毛花猕猴桃+美味猕猴桃和软枣猕猴桃+美味猕猴桃的原生质体融合体系，并将异核体培养分裂得到细胞团。这些结果有利于今后毛花猕猴桃和软枣猕猴桃资源的开发利用。主要试验结果如下： 以毛花猕猴桃试管实生苗叶片和茎段为外植体，培养在附加一定浓度Zea或CPPU的MS培养基上，产生的愈伤组织不经转代就可分化芽。试管苗茎段在附加0.0025 mg/L CPPU和0.1 mg/LIAA的MS培养基上愈伤组织产生、芽分化和苗生长都较理想;试管苗叶片则以附加0.025 mg/L CPPU和0.l mg/LIAA或0.5 mg/L Zea和0.1 mg/LIAA的MS培养基较好。当苗生长至1.0 cm时经诱导生根形成完整植株。 在软枣猕猴桃组织培养中，外植体种类、诱导培养基的激素种类和诱导分化时细胞分裂素种类都有重要影响。无菌苗茎段容易愈伤组织化，但分化困难;叶片外植体产生愈伤组织较难，但分化容易。在含Zea的MS培养基上，两种外植体产生的愈伤组织不经转代即能分化芽。分化培养基中添加Zea能有效地诱导芽分化，其中以2.0 mg/L Zea芽的分化最好，而Kin和BAP在0.5- 2.0 mg/L浓度范围内愈伤组织不分化。 以毛花猕猴桃或软枣猕猴桃试管苗叶片为分离原生质体的材料。试管苗的培养条件对原生质体分离效果及其培养反应有显著影响。弱光培养条件对两个种试管苗的原生质体分离及其培养都有好处，试管苗培养基也有重要影响。毛花猕猴桃和软枣猕猴桃试管苗合适培养基分别为MS基本培养基（大量元素减半）和MS+0.00025 mg/L CPPU+ 0.1 mg/LIAA。在此条件下培养的两个种的试管苗叶片，经酶解后原生质体产量分别为0.7-1.8×l06和3.0-3.5×l06/1 g FW，其原生质体在合适培养基上能够分裂。 毛花猕猴桃原生质体培养在MS培养基（去除NH4N03）附加l.0mg/L2，4-D液体培养基中，约10天时发生第一次分裂，分裂能持续下去并在培养3个月时形成约2mm大小愈伤组织。直接将其转入固体培养基中使其增殖和分化。在附加Zea 0.5 mg/L+ O.l mg/L IAA的MS培养基上继代2次，愈伤组织开始分化芽。芽伸长后切下诱导生根，形成完整植株。软枣猕猴桃原生质体培养基中，MS培养基附加2，4-D配合Zea或Kin对启动分裂是必须的，其中以MS＋2，4-D 0.5 mg/L+ Zea 0.5 mg/L最好，在此培养基上原生质体第一次分裂发生在4-6天时，培养12-14天时见到第三次分裂，培养三周的分裂频率为23%。培养45天后形成许多小愈伤组织块。软枣猕猴桃原生质体再生的愈伤组织从液体培养基转入固体培养基后未见进一步分裂。 对18株毛花猕猴桃原生质体再生植株的体细胞染色体数目作了观察，其中12株为整倍体，二倍体和四倍体各六株;另外六株为混倍体，其染色体数目变化在59-203之间。还发现原生质体再生植株有丝分裂间期细胞存在多核现象，有多核细胞的共10株，细胞内多核数目以双核和三核较常见，最多的有七个核。原生质体供体植株为2n=2x=58，未发现多核细胞。原生质体再生植株体细胞多核现象未见报道。 利用毛花猕猴桃或软枣猕猴桃叶片原生质体分别与愈伤组织来源的美味猕猴桃原生质体进行融合，融合方法为高Ca++高pH值PEG法。对Kao等(1975)报道的融合步骤作了修改。影响融合效率的因素主要有PEG种类、融合作用时间和融合液中DMSO浓度。最佳的融合条件为40%PEG (Sigma，MW3350)+10%DMSO，作用40 min。毛花猕猴桃+美味猕猴桃和软枣猕猴桃+美味猕猴桃的融合频率分别可达14.5%和13.6%。异核体经培养可分裂并形成细胞团。

羊草繁殖生物学特性的研究

羊草(Leymus chinensis (Trin.) Tzvel. )又称碱草，隶属禾本科，赖草属，因其营养价值高，富含蛋白质，适口性好，抗旱，耐盐碱，耐贫瘠，抗逆性强，适应性广等优点，对我国发展草原畜牧业和退化草地、荒漠化治理方面具有举足轻重的作用。近年来，由于自然环境变劣，荒漠化加剧，以及过度放牧等不利影响，加之羊草本身固有的“三低”问题（即结实率低、出苗率低、产草量低）已对羊草生物多样性维持构成了严重的威胁，严重限制了我国人工草地建设和天然草地的改良和沙化治理的步伐。加强羊草生物学研究，开展羊草种质生物多样性保护，成为当前研究的紧迫课题。经对国内外相关文献的查新发现：国外发表的文献匮乏，国内的报导大多集中在草原生态等宏观领域，在羊草繁殖生物学方面缺乏系统的研究。本文以本课题组从国内外收集的羊草资源为材料，从以下几个方面进行了初步探索： 一、羊草繁殖性状与遗传多样性分子标记指标的相关分析。利用分子标记与形态标记对随机抽取的17份羊草种质进行了种质评估的比较研究。结果表明：两种方法均在17份供试材料中鉴别出9份羊草种质,说明分子标记方法用于羊草种质资源鉴定是可行的，并具有快速、准确、不受环境条件限制等优点。在40个10 Mer的随机引物当中筛选出21个有效引物，以之对9份羊草材料进行RAPD 分析，共扩增出115条带，其中95条带表现出多态性，多态比率82.61%，并筛选出S1213-900，S1213-1700，S1215-5500， S1396-1370，S1384-900，S1202-5180，S1220-2200，S1381-1580，S1211-1300，S1211-800为羊草种质所具有的10个特异性标记，据此可将羊草种质与披肩草、赖草加以区分。同时在羊草种内亦发现13条可区分供试羊草种质的特有标记。形态标记与分子标记相关性分析结果显示：羊草种质的小穗数，种子千粒重，叶色，有性繁殖量和结实率5个形态学指标与遗传多样性指标---特有带百分率及遗传距离之间，存在一定相关性。同时对羊草种质资源在收集和评价过程中存在的问题进行了探讨。 二、羊草不同基因型无性繁殖特性比较研究。以本课题组从吉林、内蒙古等省份收集的10个基因型羊草为供试材料，在相同的生态因子作用下，以吉生1号羊草为对照，对10个基因型羊草的叶数增量、芽数增量、芽高度、芽间距、芽重量、根量六个无性系形态性状指标进行测评。结果表明：基因型的差异也是影响羊草无性系生长发育的重要影响因子。因此，在今后的羊草无性繁殖生物学研究中，应综合考虑环境因子和基因型因子对羊草无性繁殖生长发育的影响。在所测评的10个基因型中，各基因型的形态性状指标差异很大，栽3基因型较其他基因型优于对照吉生1号，此结论可为今后培育羊草新种提供重要资料。 三、羊草幼穗离体培养方法的建立。其方法是取羊草幼穗为外植体，经0.1%升汞溶液表面消毒后，接种到含2mg/L的2,4-D的MS培养基上，置于恒温25℃条件下诱导愈伤组织。在加有1mg/L2,4-D的MS培养基上继代2次后，转移到含1mg/L KT和0.5mg/LNAA的MS培养基上分化培养得到再生芽。在除去激素后的基本培养基上获得了生根的试管苗。试管苗移栽到温室后生长正常。羊草试管苗的分化因基因型和外源激素条件的不同而异。 四、羊草有性生殖特性的研究。在自然条件下进行了羊草自交、异交结实性实验，采用FDA染色法检测羊草小孢子活性，并观测羊草雌蕊、雄蕊发育的时空特点。结果表明：在大田中羊草异交结实率远大于其自交结实率;成熟花药中有活性的花粉达到92.2%以上;同时，在发育时间顺序和空间结构上，羊草的雌蕊、雄蕊并不妨碍自体授粉。因此，初步结论认为羊草具自交不和性。

羊草生殖生物学研究

羊草 (Leymus chinensis (Trin.) Tzvel. ) ，隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部的重要草原建群种之一。羊草是牧草之王，属于我国有比较优势的战略性生物资源，对我国北方畜牧业发展以及保护生态环境均具有重要作用。 羊草较弱的有性生殖特性限制了其应用，本文从实验生物学角度，研究了羊草有性生殖的基本特点，并试图通过现代分子生物学手段探讨自交不亲和性的有关机理。本论文的主要结果如下： 1. 实验发现羊草具有自交不亲和性。以6 个羊草居群为材料，测定得知开放授粉时的结实率在6.5% - 56.7%之间，自交时结实率为0.6% - 4.3%，差异极其显著; FDA 染色法检测结果显示羊草成熟花药中有活性的花粉达到92.2% 以上;在发育时间顺序和空间结构上，羊草雌蕊、雄蕊适于异花和自花授粉;花粉柱头亲和性实验表明，自交花粉只有5.5%-11.7% 是亲和的，杂交花粉亲和率达到了60.0%-84.8%，说明自交花粉在柱头上萌发受到抑制，其次，荧光显微镜还观察到“不亲和花粉”在进入柱头后生长缓慢，或停止延伸。 2. 初步确定羊草自交不亲和性具有配子体型遗传特点。以不同居群羊草杂交后的姊妹系作为实验材料，观察到自交组合的亲和率变幅为0 % - 6.9 %，杂交组合的亲和率具有连续性变异和变幅较宽的特点（47.5％ - 96.0 %），且正反交结果具有一定的一致性（88.2％），表现出配子体遗传特性。 3. 羊草居群内结实率存在一定变异。以羊草单株为单位分别进行自交、随机互交和开放授粉，结果显示三者的平均结实率分别为4.6%，18.1% 和35.7%，株间的变异系数分别为33.4%，21.2%和17.1%，这些株间的变异均达到统计上的显著差异;同时羊草自交、杂交和开放授粉之间具有一定的相关性，显示羊草的这种株间差异与株系本身的生理特性相关。 4. 分离了羊草硫氧化还原蛋白 H 基因(ThioLc)并对其功能进行了分析。克隆了ThioLc全长和cDNA序列。序列分析结果显示，DNA全长2257 bp，包括3 个内含子和4 个外显子，与水稻Thio h 的cDNA 序列相比，具有 32.0% 的同源性;Southern 杂交显示 ThioLc 在羊草基因组中是单拷贝;Northern 杂交显示 ThioLc 在羊草根、茎、叶和幼小的雌蕊中没有表达, 在成熟雌蕊和幼小的花粉中微量表达, 在成熟花粉中大量表达，说明分离的羊草硫氧化还原蛋白H 基因具有花粉特异表达特点。 5. 原核表达的ThioLc 蛋白具有较高的催化活性。构建了ThioLc 基因的原核表达载体，检测证明ThioLc基因在大肠杆菌中正常表达;提取表达蛋白，纯化，用胰岛素和二硫苏糖醇反应体系进行硫氧化还原蛋白的催化作用反应，结果表明表达的蛋白具有催化活性。这一结果为进一步搜寻靶向蛋白和研究该蛋白的结构、功能和作用方式奠定了基础。

羊草细胞差异表达基因分析与遗传转化方法研究

羊草（Leymus chinensis (Trin.) Tzvel），隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部重要建群种之一。羊草是牧草之王，是我国比较有优势的战略性生物资源，对我国北方畜牧业的发展以及生态环境的保育均具有重要意义。近年来，由于缺乏科学管理、过度放牧等不利影响，加之羊草本身固有的“三低”问题（即抽穗率低、结实率低、发芽率低）已对羊草生物多样性维持构成了严重的威胁，限制了我国人工草地建设和天然草地的改良及沙化治理的步伐。因此，如何通过细胞、分子生物学以及生物技术手段改良羊草、快速评价和创造新的种质;如何加快育种进程便成为当前亟待解决的问题。本文围绕这些问题开展了系统的研究并取得如下结果： 1. 建立了羊草离体培养再生体系，并研究了影响愈伤组织诱导和植株再生的因素，影响植株再生的主要因素为激素配比和基因型。将3～5mm的幼穗接种到含有2,4-D 0～5.0mg/L的N6基本培养基上，随着2,4-D浓度的变化，愈伤组织诱导率不同，最高诱导率为93.21%（基因型C6）、最低为33.35%（吉生1号）;愈伤组织在N6(大)＋B5(微)＋KT1.0mg/L+BA1.0mg/L的培养基上可以分化出芽，并在1/2MS培养基上生根。羊草基因型W4不同幼穗诱导的愈伤组织在继代培养过程中其生长、褐化死亡等方面存在着差异;在分化培养过程中，不同幼穗的愈伤组织最高分化率为9.24%，最低分化率为5.26%。 2. 对来自同一基因型不同幼穗的愈伤组织中差异表达的基因进行了研究。采用DDRT-PCR技术对其差异表达的基因进行了分离，通过银染技术显示差异片段。将得到的差异片段进行回收、克隆测序，得到两个差异片段序列，经过序列分析表明，其中一个片段是与水稻翻译延伸因子eEF-1基因高度同源;另一差异片段与水稻谷胱甘肽转移酶GST基因高度同源。 3. 建立了羊草遗传转化方法。在获得羊草离体培养再生体系的基础上，采用基因枪法对羊草两个基因型进行转抗除草剂基因（PAT）的研究。对分别来自基因型W4和C3的愈伤组织各1430和1850块进行转化。在附加1.0mg/L PPT的培养基上进行一系列的筛选培养，共获得了23株再生苗，经过生根筛选培养，得到5株抗性苗，3株来自基因型W4，2株来自基因型C3。对5株植株进行PCR和Southern 检测，得到2株阳性苗，均来自基因型W4，对阳性植株经过无性繁殖得到的无性系进行PCR检测及Basta耐受性鉴定，外源基因可以在其无性系稳定遗传并表达，无性系除对Basta具有抗性外，其表型特征与对照无明显区别。

采用AFLP分子标记和分子生物学方法对资源植物的评价

中国资源植物丰富，蕴藏着优异的基因资源，开发和利用这些优异资源是植物学研究的重要课题。本文面向国家重大需求选择两种资源植物一羊草(Leymuschinensis (Trin.)Tzvel)和向日葵(llelia thus annuus L．)，采用分子标记技术和分子生物学方法对其进行评价和研究，以期为资源利用提供依据。由于两种植物本身的差别和采用的研究方法各异，故分别论述。 羊草，隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部重要建群种之一。羊草是牧草之王，是我国比较有优势的战略性生物资源，对我国北方畜牧业的发展以及生态环境的保育均具有重要意义。近年来，由于缺乏科学管理、过度放牧等不利影响，加之羊草本身固有的“三低”问题（即抽穗率低、结实率低、发芽率低）已对羊草生物多样性维持构成了严重的威胁，限制了我国人工草地建设和天然草地的改良及沙化治理的步伐。因此，如何通过形态调查结合生物技术手段评价羊草遗传多样性为建立核心种质及改良羊草、快速评价和创造新的种质、如何加快育种进程便成为当前亟待解决的问题。本文围绕这些问题开展了系统的研究并取得如下结果： 1． 对羊草的形态调查和AFLP分析，表明羊草是一种形态变异较大但是遗传变 异较小的物种。两种生态型的表现显著差异，其中灰绿生态型羊草比黄绿生 态型差异大。羊草遗传多样性与包括长期的栽培驯化、地理分布有很大的相 关性，地理来源相同的几乎全部聚到了一组。 2． 通过主成分分析和通径分析，简化了羊草31个性状分析的复杂性，了解到 羊草无性繁殖受好的营养生长促进。 3． AFLP分子标记技术在分析羊草遗传多样性方面有显著优势，尤其是对于羊 草这样多态性不高的物种是一种非常有效的分析工具。在分析AFLP数据时 采用聚类分析和主坐标分析相结合的方法，既兼顾了亲缘关系较近的种质之 间的关系调查也兼顾了亲缘关系较远的种质之间的关系调查。 4．羊草AFLP反应，不同引物所获得的总带数和多态性带数差别明显。羊草基因 组对3’端有选择性碱基TN的所有EcoRJ选择性引物扩增效果很差，前人 的有关赖草属的遗传研究也支持这一结果。 向日葵(n=17)，属于菊科( Compositae)向日葵属(Helia thus)，向日葵的研究重要领域是向日葵杂种生产，而细胞质雄性不育系的使用是杂种优势育种的核心。全世界90%以上的向日葵杂交种生产仍然在使用同一个细胞质类型PETI，玉米遗传单一给生产带来的毁灭性打击仍然令研究者和生产者记忆犹新，因此寻找更多的细胞质类型仍然是研究者的重要任务。本研究围绕一个新的不育源(G20023)的发现及鉴定，通过使用不育的G20023的保持系、恢复系、恢复的Fi代、回交一代之间比较以及与属于PETI细胞质类型的不育系的相应材料进行比较，找出与这一新的细胞质类型不育表型有关的可能差异序列，来探讨其不育机制，得到如下结果： 1、 通过田间杂交试验，证明G20023的保持系有很多（已证实有24份）， 目前找到的恢复系只有一个，H.maximiliani。G20023不育源作为一 种新的细胞质类型可以成为将来杂交育种的候选资源。同时，我们找 到一些表型证据，除了无花粉之外，G20023与PETI表型的典型不同 之处还在于前者的花药上下均为分离状态，而后者花药的基部联合， 顶部分离。显然，不同的细胞质类型在解剖结构上可能表现不尽相同。 2、 与线粒体基因组特异基因的核酸序列比较，结果表明，G20023线粒体 基因组上没有orfH522序列，与PETI表现出差异;此外，在基因atp6 位点也与PETI不同，而且在该位点也与同属向日葵ANTI不相同。同 时由于orf873并没有出现在ANTI中而出现在G20023中，因此我们可 以认为G20023这一个新的不育系是与ANTI和PETI不同的细胞质类 型。 3、 在参考常规线粒体DNA提取方法的基础上，我们做了很多改进，建立 了自己的向日葵线粒体DNA提取方法。该方法更快更简单，提取的线 粒体DNA完全可以用于酶切和杂交。 4、 G20023不育源由于其稳定的不育性状，可以作为培育无花粉彩色向日 葵杂交种的亲本材料，我们通过此不育源选育适当花色的无花粉观赏 向日葵生产杂交种。

水母雪莲DFR基因的克隆及其正义和反义植物表达载体的构建

水母雪莲（Saussurea medusa Maxim.）为多年生菊科植物，是我国珍稀药用资源。所含的主要生物活性成分是黄酮类物质，具有抗炎、镇痛、免疫抑制及抗氧化等功效。但由于水母雪莲生长环境特殊，生长缓慢，人工引种困难;加上长期掠夺性采挖，造成其野生药用资源短缺，已经不能满足市场的需求。近年来,世界上掀起了植物药开发的热潮,植物药以其天然低毒的特点倍受关注,而黄酮类化合物更是以其广谱的药理作用引人瞩目。 黄酮类化合物的合成代谢途径在植物界进化过程中很保守，黄酮类生物合成途径中的相关酶也已得到确证并进行了系统的研究。二氢黄酮醇-4-还原酶（Dihydroflavonol-4-reductase, DFR）是一个处于花色素或者原花色素合成途径中的关键酶，它与黄酮合成途径中的黄酮醇合成酶（flavonol synthase）竞争底物。本研究以水母雪莲为研究对象，根据近缘物种DFR基因的保守核苷酸序列设计兼并引物，通过PCR技术，从已经建立的水母雪莲红色愈伤组织cDNA文库中筛选到一个编码该酶的cDNA序列，该序列全长1166个碱基对。根据生物信息学分析，此cDNA编码342个氨基酸;Blastp分析结果显示，该氨基酸序列与同科植物翠菊（Callistephus chinensis）的相似性最高，达87%;SWISSMODEL软件预测其蛋白的三级结构与葡萄(Vitis vinifera)的十分相似，活性中心的关键氨基酸残基也完全一致。据此可以断定，我们所得到的cDNA为编码二氢黄酮醇还原酶的基因，并命名为水母雪莲二氢黄酮醇还原酶基因(SmDFR）。为了得到SmDFR的DNA序列，我们又设计特异引物，从水母雪莲的基因组中扩增出了由1871个碱基对组成的DNA序列，该序列包含五个内含子和六个外显子。 为了提高水母雪莲和大苞雪莲中黄酮类物质的含量，我们构建了SmDFR的反义植物表达载体，利用根癌农杆菌介导进行基因转化。通过改变影响农杆菌转化的实验条件包括外植体来源、农杆菌菌株、细菌浓度、外植体预培养时间、侵染时间和乙酰丁香酮的浓度进行转基因试验，目前尚未得到转基因植株。另外，我们构建了SmDFR正义植物表达载体，通过对拟南芥(Arabidopsis thaliana) DFR基因突变体和矮牵牛(Petunia hybrida)进行基因转化，来验证SmDFR的功能;目前，此实验尚在进行之中。

羊草遗传多样性分析和赖草属的分子系统发育

羊草（Leymus chinensis（Trin.）Tzvel.或Aneurolepidium chinense Trin.），隶属禾本科（Gramineae），大麦族（Hordeae），小麦亚族（Triticieae），赖草属（Leymus），兼具重要的生态价值和经济价值。面向国家重大需求，本论文选择羊草作为主要研究对象，开展了两方面的研究工作，即我国羊草种质资源的遗传多样性评价和赖草属物种的系统发育分析。 羊草是一种多年生根茎型禾草，根据叶色可以划分为黄绿型和灰绿型两种生态型。其分布范围横穿亚欧草原的东部，包括朝鲜和蒙古的西部，以及西伯利亚的西北部，集中分布于我国的东北部。羊草是我国典型草原植物群落中的优势种。它可以在多种土壤和气候条件下正常生长，如松嫩平原、内蒙古草原和黄土高原。从另一个角度讲，不同类型的生境也造就了羊草丰富的遗传多样性。 自上世纪90年代中期开始，我们陆续从我国东北部6个省市收集了293份羊草种质，包括205份灰绿型羊草和88份黄绿型羊草。经过连续3年的观测记录，通过37个重要农艺性状，对293份羊草的遗传多样性进行了评估。依据10个质量性状和27个数量性状，统计了羊草不同性状和不同地域羊草的Shannon遗传多样性指数，同时还使用了主成分分析和通径分析做了相关统计。结果显示：（1）与黄绿型羊草相比，灰绿型羊草具有更高的遗传变异（P<0.05）。结合这两个趋异型羊草的分布范围，可以得出两种类型羊草之间存在稳定的遗传差异;（2）通径分析显示，羊草营养生长性状和遗传多样性两者的组合效应可以解释羊草生殖特性中20.6％的遗传变异;（3）在124-128ºE这一区域，羊草的遗传多样性指数最高（H＝2.252），表明这一地区具有最丰富的羊草种质资源。 赖草属（Leymus Hochst.）是一个异源多倍体属，约有34个物种，该属未知基因组的起源一直争论不休。其倍性范围从四倍体（2n=4x=28）、八倍体（2n=8x=56）一直到十二倍体（2n=12x=84）。新麦草属（Psathyrostachys Nevski）只含有Ns一个基因组，约有9个物种。这两个属都是多年生牧草，具有抗旱、抗病和耐盐碱等生物学特性。 应用核糖体ITS（Internal Transcribed Spacer）序列和叶绿体trnL-F序列，我们对13个赖草属物种、小麦族18个属（40份二倍体材料）、以及Elymus californicus和Bromus catharticus，共计57份材料进行了系统发生分析。ITS序列分析表明，赖草属分别与新麦草属和小麦族中一个未知属在进化上具有紧密的关系。ITS谱系树表明赖草属内部存在大量的分化，以及赖草属物种具有多次起源的特征。trnL-F序列分析表明，赖草属物种的母本，部分来自Ns基因组，部分来自Xm基因组，这可能与赖草属物种的地理分布有关，分布于亚欧大陆的物种其母本是新麦草属，而分布于北美的大部分物种其母本是Xm基因组。trnL-F序列分析还表明，E. californicus和赖草属未知的基因组具有紧密的关系。以上研究结果表明：（1）从分子层面证明，赖草属的未知基因组并非来自薄冰草属，或是一个修正的新麦草基因组，其基因组组成应是NsNsXmXm;（2）赖草属物种的母本，部分来自Ns基因组，部分来自Xm基因组，这可能与赖草属物种的地理分布有关;（3）E. californicus的母本是Xm基因组，父本是Ns基因组，该物种应从披碱草属转移至赖草属。

羊草cDNA文库的构建及果聚糖水解酶的分离与鉴定

羊草(Leymus chinensis(Trin.) Tzvel.)又称碱草，隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部草甸草原及干旱草原上的重要建群种之一。作为一种兼具重要经济价值和生态价值的优良牧草，羊草受到了广泛的关注。但长期以来，对羊草的研究主要集中在生态学、生殖生物学方面，在分子生物学方面知之甚少。为了保存羊草基因资源，并在基因水平上研究羊草生物代谢的调控机理，本研究采用羊草根、叶片混合后做为材料，构建cDNA文库，并对文库中部分基因序列进行了分析。同时从中克隆获得羊草果聚糖水解酶全长基因并对这些基因进行了深入的生物信息学分析、转化毕赤酵母研究初步确定其功能，为深入了解羊草代谢的分子机制提供理论依据。主要结果如下： 1. 成功地构建了羊草根、叶混合cDNA文库，原始文库滴度达到4×106 pfu/ml，扩增文库滴度接近1011 pfu/ml ，重组率达97% 。PCR检测插入片段，均在0.5 kb到3 kb之间，l kb以上占68%。从文库中检测到了TC、γ-TMT、FEH基因，文库覆盖度达到要求且为PCR筛选文库提供了可能。 2. 随机挑取经检测过的597个单克隆进行测序，去除插入片段小于和污染序列后，获得了584条高质量的序列。所有584条EST序列与NCBI的核酸数据库比对时，有30.99%的EST序列与己知序列有很大的同源性：而与蛋白质数据库进行比对时，有61.27%的EST序列与已知序列有很大的同源性。核酸比对中，有32.87%的序列为未知功能新基因，而蛋白质比对结果只有11.27%的序列为未知功能新基因。其中获得5条全长基因。 3. 文库中测序得到果聚糖水解酶（FEH）片段，依据其核酸、蛋白序列，以羊草根茎为材料，结合果聚糖水解酶基因的保守序列设计引物，通过 RACE 方法，获得羊草果聚糖水解酶基因 Lc 1-FEH 的全长序列（2040bp），包含一个 1803bp 的开放阅读框，采用生物信息学方法对该基因编码蛋白质进行功能分析，该基因编码的氨基酸序列具有明显的果聚糖水解酶类蛋白特征(NDPNG，FRDP 和[WEC (V/P)D] 结构域)，其分子量为 66.8kD，等电点 pI 为 5.49，是一种酸性蛋白质。同源性分析结果表明Lc1-FEH与单子叶植物小麦、大麦和黑麦草细胞壁类酵素酶同源性最高，分别为89％、87％ 和72％。运用实时定量方法对Lc 1-FEH表达量在羊草发育各时期及不同逆境处理下进行测定，结果发现，幼苗中以叶中表达量最低，根茎中表达较高，成苗中花梗中的表达量最高；Lc1-FEH在转录水平明显受碱、ABA、SA及低温胁迫诱导，随着胁迫时间延长，表达量迅速增加，到达到最大值，之后表达水平逐渐降低，在盐、干旱的诱导下的表达量迅速降低。 4. 羊草果聚糖水解酶Lc1-FEH基因在毕赤酵母中的高效表达 将pMD-Lc1-FEH 质粒经双酶切后构建果聚糖酵母表达载体 pPICZα- Lc1-FEH 。将重组表达载体线性化后电击转化毕赤酵母Pichia pastoris X33，经抗生素 Zeocin 和酵母 PCR 筛选获得高效表达酵母工程菌。毕赤酵母表达的果聚糖水解酶蛋白经SDS-PAGE 分析表明Lc1-FEH表观分子量为 67 kD 左右。其最适反应 pH 值为 5.5，在 pH 值为 4.5~6.5 的范围内能保持较高的酶活力；表达Lc1-FEH的最适反应温度为 30 ℃；在温度在 20～30℃度范围内有较高的酶活。 Lc 1-FEH能够水解含有β-2，1糖苷键类型果聚糖：蔗果四糖、菊粉、6-蔗果三糖；而对β-2，6糖苷键类型果聚糖：6-蔗果三糖、新蔗果三糖、细菌类果聚糖及蔗糖基本不具水解活性。

北京怀柔常见山地灌丛聚类、排序的初步研究

次生山地灌丛是北京怀柔地区分布最广泛的植被类型。由野外资料，用包括模糊聚类在内的数值分类方法区分出如下三个重要的灌丛群落类型和一个萌生丛：荆条 （Vitex chinensis）灌丛、三桠绣线菊 （Spriaea trilobata）灌丛、平榛（Coryls heterophylla）灌丛与北鹅耳枥（Carpinus turczaninowii）萌生丛。主成分分析的排序提示了人较干燥到较湿润的生境梯度上植物群落分异与环境水分状况的密切关系，和显示了在些梯度上一些群落的过渡性质。相互平均法的排序支持了主成分分析的结果，并且表明了不同植物种在梯度上的分布主要受环境水分状况的影响。关联系数分析进一步探讨了环境水分梯度上种的集团分布。 地上生物量的收割用以显示群落中优势种的重要性。使用了回归分析与数量化理论I的方法来讨论某些灌木种干、鲜重的预测建模。 根据气孔扩散阻力测定的结果，荆条显得比三桠绣线菊有更强的控制水分散失的能力。

中国东北样带（NECT）羊草种群数量特性变化及其与环境因子的直接梯度分析

陆地样带研究是国际地圈一生物圈计划( IGBP)全球变化研究中最引入注目的创新之一。目前，国际上已经设立了15条陆地样带，而且正在开展各项研究工作。现有关于陆地样带的研究报道多集中在环境梯度分析、气候变化对植被初级生产力的影响及环境变化与植被变化的对应关系等方面，而关于陆地样带环境梯度变化上植物种群生态学的研究尚未见报道。 本研究以东北样带为平台，研究北纬43。31' - 44041'，东经125018’-115。31'范围内，即由湿润到干旱的环境梯度变化系列，羊草主要形态特征、种群密度、生物量、种子生产、生物量分配比例等变化规律及其与环境因子的相关关系，初步探讨了中国东北大尺度环境变化对羊草种群的影响及羊草对变化环境的适应规律。 在本研究的环境变化系列上，羊草种群外部形态的突出变化是种群植株高度由东至西沿降水量逐渐下降的梯度逐级递减，而且植株高度与生长季前期的降水量呈显著正相关关系。除旗叶外，羊草种群各叶片长度具有相似的变化趋势，即长春地区种群叶片长度远远大于其它种群，阿巴嘎旗地区种群叶片长度远远小于其它种群，其它8个种群叶片长度变化不大，呈平缓波动状态。除长春地区羊草叶片宽度显著大于其它种群外，其它9个种群间虽有一定的差异，但基本是处于波动状态。这说明羊草的各形态特征对该梯度环境变化的反映是不同的。 在该环境梯度上，羊草种群总密度、营养枝密度和生殖枝密度具有非常相似的变化趋势，均为由东至西呈先增后减的趋势，并且最大值都在长岭种马场地区。而且，无论是种群总密度，还是营养枝和生殖枝密度均与9月份平均温度显著相关，这是因为秋季高温对地上部分的营养物质向地下根茎转移及地下根茎芽的形成有利，丰富的物质积累和发育良好的地下根茎芽是翌年种群具有较高密度的保障。在本研究的10个种群中，除长春地区种群生殖枝分化率显著低于其它种群外，各羊草种群生殖枝分化率相对稳定，而且羊草种群生殖枝分化率与环境梯度上各环境因子间的相关性均不显著。 在本研究中，种群总生物量、营养枝生物量、生殖枝生物量和个体生物量等指标具有不同的变化趋势。表现为由东至西或由湿润到干旱，除生殖枝生物量在最东端的各种群中呈增加趋势外，种群总生物量和地上群体生物量（营养枝生物量和生殖枝生物量）均呈逐级盘低走势，而且干燥系数和生长季前期的降水量是决定总生物量和地上群体生物量变化的主要因素。地下根茎生物量表现为从湿润的长春市地区到半干旱的绍根地区呈缓慢盘低，而后随干旱程度的加重迅速增加，但至最干旱的阿巴嘎旗地区又迅速下降。在半干旱和干旱地区，植物根系生物量增加能使植物更有效地利用有限的水资源。羊草种群个体生物量的变化趋势基本一致，即除长春地区种群个体生物量远远大于其它9个种群外，各羊草种群个体生物量虽有所差异，但变化不大，基本水平波动状态。个体生物量的相对稳定是羊草能适应各种变化生境的重要保障，而且在该实验梯度上个体生物量的相对稳定是通过种群密度变化来调节的。 在本研究梯度上，虽然各种子生产指标有一定的变化，如锡林郭勒草原定位站种群和阿巴嘎旗种群的种穗长度、结实数和单位面积种子产量均较低等，但这些指标的变化与由东至西的降水量递减等气候因子变化是不一致的，如结实数、单位面积种子产量和种子重量等基本呈波动状态，只是在实验梯度的西端才有明显的下降。这说明在本研究的环境梯度系列上，环境因子对羊草种子生产有一定的影响，但最主要的影响可能是其自身遗传因素，这有待于今后的深入研究。 在本研究的环境梯度上，由东至西或由湿润到干旱的气候变化系列上，羊草种群根茎、营养枝、生殖枝和种子生物量分配比例呈现明显的规律性变化。最显著的表现是羊草种群根茎生物量分配比例随降水量的减少而逐渐增加。在水资源有限的生境下，大比例的根茎生物量分配能增加根系对地下水分的吸收，同时有利于物质和能量在根部的贮藏，这种机制能确保植物在干旱气候条件下生存。相反，羊草种群地上营养枝生物量分配比例由东至西逐渐下降，减少营养枝生物量分配比例可以降低营养枝水分蒸腾量，协调根部水分吸收和枝条蒸腾的关系，保持整个植物体的水分平衡。羊草种群生殖枝和种子生物量分配比例均呈两头低，中间高的变化趋势。这说明降水充足和严重干旱均不利于羊草有性生殖体的生产，半湿润和半干旱气候区是羊草种子生产的理想地域，这也可能是羊革能在半湿润和半干旱气候区大面积分布的原因。

羊草草原群落氮素平衡和碳水化合物贮藏对氮素添加的响应

草地在世界各种不同的气候带和土壤类型区均有分布，约占陆地面积的24%。尽管二十世纪中叶以来，人类通过各种措施，使氮素由大气圈进入生物圈的量已经翻了一翻，但是，草地生态系统由于没有得到足够的氮素补充，其生产力至少是季节性地受到氮素的制约。我国草原生态系统的退化与氮素匮乏已经引起了广泛重视。尽管一些研究者的工作已经涉及到氮素循环的一些方面，但是关于草原生态系统的氮素平衡过程的系统研究迄今尚未开展。地下器官中贮藏养分的积累是多年生牧草抵御不良环境条件的物质保障，碳水化合物是我国典型草原植物重要的贮藏营养物质。但是关于我国草原生态系统贮藏养分的研究还相当匮乏。值得一提的是，不合理的人类活动也加剧了草地生态系统氮素的损失，甚至对全球环境和人类健康产生了重要影响。为此，我们在中国科学院内蒙古草原生态系统定位研究站的羊草样地设计了氮素添加试验，采用15N稀释法对典型草原羊草群落的氮素吸收利用、氮素平衡进行了研究，并就氮素添加条件下，植物氮素利用与植物竞争的关系、氮素吸收分配与牧草生物产量与品质的关系进行了探讨。同时采用高效液相色谱对羊草群落植物贮藏碳水化合物的种类与含量进行了测定。 15N稀释法的试验结果表明：我国典型草原羊草群落吸收的氮素平均16.41%来源于肥料，83.59%来源于土壤。氮素添加不仅显著促进了羊草群落地上器官对肥料氮索和土壤氮素的吸收量，而且促进了地下器官对肥料氮素和土壤氮素的吸收量。生物量达到最大时，羊草群落吸收的氮素分配到地下器官中的比例平均为74.85%，分配到地上器官中的比例平均为25.15%。植物吸收的肥料氮素在地上和地下器官之间的分配比例约各占50%。 在我国典型草原羊草群落，植物对肥料氮素的回收率仅为31.61%，氮素添加显著影响羊草群落植物对肥料氮素的回收，随着氮素添加量的提高，地上和地下植物器官对肥料氮素的回收量均显著提高。凋落物的肥料氮素回收率为2.92%，地下凋落物的回收率显著高于地上凋落物。肥料氮素的土壤存留率为36.16%，主要分布在地表至40cm的土层范围内(>95%)。各土层存留的标记肥料氮素量均随着氮素添加量的增加而显著提高。肥料氮素的当季损失率为21.77%-43.38%。风险：收益分析表明，在本试验条件下，添加5.25gN/m2与28gN/m2的处理风险大于收益，添加17.5g/m2的处理风险最低，收益最高，在草原生态系统的管理中可以参考。 为了了解羊草群落植物的竞争能力是否对羊草群落植物的相对多度有影响，我们对不同盖度的10个物种的15N吸收速率、15N分配、植物组织氮素含量、单株生物量、根／冠比、氮素生产力等反映植物竞争能力的指标进行了测定和分析。发现向根系的氮素分配比例、根／冠比、和氮素生产力与植物的相对盖度显著正相关，向地上器官的氮素分配比例、氮素吸收速率与相对盖度呈显著负相关，而植物组织氮素含量、和单株生物量与植物相对盖度无关。 试验前，我们认为氮素吸收速率应该与植物的相对多度显著正相关，但是本试验发现却是显著负相关。这一结果说明，高的氮素吸收速率并不能代表较高的竞争能力，而是稀少植物能够与优势植物共存的一种生理机制。 氮素的吸收与分配显著地影响牧草的生物产量和品质。氮素添加提高了羊草生物量，促进了生物量向地上器官的分配比例，降低了向根系的分配比例，使根／冠比显著降低。氮素添加促进了羊草对氮素的吸收以及向茎叶中的分配比例，降低了向根系的分配比例，提高了羊草各器官的氮素含量和地上器官的蛋白质含量，对根系的蛋白质含量无显著影响。本试验条件下，氮素添加水平为17.5gN/m2时，羊草根、茎、叶生物产量均最高。与17.5gN/m2的处理相比较，添加28gN/m2的处理，羊草的生物产量以及牧草蛋白质含量均无显著差异。初步认为，本实验条件下，17. 5gN/m2是较为适宜的氮素添加量。 地下器官中贮藏养分的积累是多年生牧草抵御不良环境条件的物质保障，碳水化合物是我国典型草原植物重要的贮藏营养。采用高效液相色谱(HPLC)对羊草群落地下器官的贮藏性碳水化合物进行了分析。结果表明，羊草群落地下贮藏碳水化合物种类主要包括甘露糖醇、果聚糖、蔗糖、葡萄糖和果糖。其中甘露糖醇是最主要贮藏碳水化合物，约占60%;其次是果聚糖，约占30%。氮素添加量对羊草群落地下贮藏碳水化合物有显著影响。在0～50 g NH4N03. m-2.yr-1范围内，随着氮素添加量的增加，总糖、果聚糖、甘露糖醇的含量均逐渐升高。氮素添加时期对羊草群落地下贮藏碳水化合物含量亦有显著影响。7月初（雨季）添加氮素比4月份（牧草开始返青）更有利于牧草地下贮藏碳水化合物的积累。 对羊草根茎中的贮藏性碳水化合物的测定结果表明，羊草根茎中的贮藏碳水化合物组分主要包括果聚糖、甘露糖醇、蔗糖、葡萄糖和果糖。其中果聚糖是最主要贮藏碳水化合物，约占60%：其次是甘露糖醇，约占20%。氮素添加量对羊草根茎中的贮藏碳水化合物有显著影响。在0～17.5 g N/m2范围内，随着氮素添加量的增加，总糖、果聚糖、甘露糖醇的含量均逐渐升高。氮素添加时期对羊草根茎中的贮藏碳水化合物的含量亦有显著影响。在7月初添加氮素比4月份添加氮素更有利于贮藏碳水化合物的积累。

CO2浓度升高对羊草草原生产力和碳平衡的影响

自工业革命以来，大气的C02浓度以前所未有的速度增加，已经由280μmol mol-1升高到了360μmol mol-l。据预测，到下个世纪中／末期，C02浓度将为目前的二倍。C02浓度升高及其引起的全球气候变化必将影响到植物的生长发育，进而对整个生态系统产生巨大影响。因此，有关C02浓度升高对各类生态系统的影响的研究引起了广泛关注，成为近年来的研究热点。早期的研究多数集中于考察C02浓度升高对植物个体水平生长发育的影响。然而，高C02对植物的效应严重依赖于具体物种和具体环境条件，使得基于由短期盆栽实验获得的研究结果不能够有效地预测自然生态系统的行为。因此，长期、原位处理实验越来越受到重视。由于原位研究的难度较大，目前这方面的研究还不是很多。有限研究结果显示，由于生境条件和种间关系方面的巨大差异，自然生态系统对C02浓度升高的反应迥异。 草原生态系统由于C02浓度控制上比较容易实现，而且其物质循环相对较快，因而一直是C02富集实验研究最多的一类植被，生态系统水平的研究更是如此。然而涉及的区域和草原类型并不多，不足以进行可靠预测。目前，关于C02升高效应，研究比较系统的草原生态系统主要集中在：美国Kansas的高草草原、美国California的一年生草原、瑞士西北部的石灰质草原、美国Colorado的矮草草原和一些牧场。我国总土地面积的40%为草地，类型丰富，然而相关研究不多，尤其是对自然生态系统的原位研究几乎为空白。 为揭示C02浓度升高对羊草草原生产力和碳平衡的效应，我们在中国科学院内蒙古草原生态系统定位研究站的永久羊草样地开展了两年的C02倍增实验(2001，2002)。在羊草样地选择相对均匀地段设置12个开顶式气室（直径1.8m），每个气室内分成4个小样方(0.5m×0.5m)，其中6个气室在生长季给予加倍C02处理（约600μmol mol-l），另6个气室不补充C02（约300μmol moI-l）。地上部分用收割法取样，分种记录数量、高度和重量等指标，地下部分取样用环刀法。用Li-cor6400光合系统测定群落光合和呼吸速率。野外实验结束后，统一分析植物和土壤样品中的C、N等元素含量。另外，在内蒙古草原站院内设置了两组桶培实验，一组是取自羊草样地的带苗原状土，一组是取自羊草样地的混匀土，种上冰草(Agropyron cristatum)、紫花苜蓿(Medicago sativa)和无芒雀麦(Bromus inermis)的种子。2组桶培实验分别用两个水分梯度和两个C02梯度处理。水分处理分别为：浇水处理——每4天浇lOOOml水，相当于平均降雨量的160%;干旱处理——持续干旱，适时补水以保持植物不萎蔫，共浇水4000ml水。C02处理和取样方法与样地原位实验相同。主要研究结果和结论如下： 1)两年的C02加倍处理没有使羊草草原的生物量、植物种和功能型组成发生显著改变，桶培实验中，浇水处理显著促进了植物生长，原状土植物、种子苗实验的冰草和无芒雀麦对C02加倍处理同样不敏感，而种子苗实验的豆科植物紫花苜蓿在C02加倍处理下生物量显著提高。以上结果显示，由于水分和养分（特别是N）的限制，以及优势植物对C02的相对不敏感，C02浓度升高对羊草草原地上生物量和结构的效应相对不大。 2)羊草草原的根垂直分布在加倍C02条件下发生显著改变，但根生物量对C02加倍处 理相对不敏感。在4次取样中只有一次对C02加倍处理表现出显著变化，根长的变化与根生物量的变化不完全一致，根的比根长在加倍C02条件下增加。根垂直分布的变化趋势与降雨的时间分布相适应，干旱少雨时期C02使下层根量增加，多雨时期C02则使上层根量增加。以上结果显示，根的空间分布比根生物量对C02加倍处理更敏感。水分是根空间分布变化的驱动因子，加倍C02条件下，根空间分布的变化趋势倾向于优化对水分的充分利用。 3)加倍C02处理使羊草草原的群落光合速率显著提高，群落呼吸速率显著降低，因而使群落碳净输入量增加。土壤碳贮量占羊草草原碳总贮量的70%以上，碳总贮量及其组分（包括地上碳贮量、根碳贮量、土壤碳贮量）在两个C02浓度处理之问均没有显著差异。另外，加倍C02处理使羊草草原群落及其优势植物羊草的c：N比增加。以上结果显示，在加倍C02条件下羊草草原的碳净输入量增加，这意味着在未来高 C02条件F，羊草草原将作为碳汇对大气C02起反馈调节作用。其碳贮量对加倍C02 处理的不敏感与许多以前的研究结果相似，一般认为是由于土壤碳贮量本底太大， 掩盖了C02效应，这还有待于更长期原位实验的证实。羊草草原群落c：N比在高C02 浓度下的变化将影响凋落物降解、N素循环和动植物营养关系等，进而对生态系统 功能产生深远影响。

中国东北样带草原段关键种——羊草茎、叶显微结构的生态可塑性及群落功能群组成和多样性研究

陆地样带是国际地圈——生物圈计划(IGBP)研究中最引入注目的创新之一。目前，国际上已经设立了15条陆地样带，研究内容涉及环境梯度分析、气候变化对植被初级生产力的影响及环境变化、土地利用等与植被变化的对应关系等。沿该陆地样带分布较广的关键种生理适应性等方面对影响其生理功能形态结构的研究较少，特别是茎、叶等组织功能研究较少。 中国东北样带(NECT)是全球陆地样带的重要组成部分，多年来已开展了大量深入系统的研究工作，已成为我国生态学、地学等学科的重要研究平台。本研究以中国东北样带中西段广泛分布的重要关键种——羊草（Leymus chinensis）为研究对象，分析了羊草茎、叶显微结构的生态可塑性及其与水分利用效率的关系，进而阐述了羊草适应不同生境条件，特别是适应水分变化的机制，为揭示羊草及其种群、群落乃至以羊草为优势种或建群种的草地生态系统在全球变化背景下的发展趋势提供理论依据。 基于2001年7～8月第3次中国东北样带考察资料，采用高精度Olympus显微镜及C同位素分析技术（δ13C判别值），结合在野外取样过程中测定的样地土壤含水量和海拔高度，以及近十年各样地年降水量和年均温度气象资料，分析了羊草茎、叶显微结构和水分利用变化与环境因子的关系，以及以羊草为建群种或共建种的无牧和放牧样地群落生物量、物种多样性和植物功能型组成变化与环境因子的关系。 结果表明：羊草叶片表面及内部主要显微结构特征参数各样地间有不同程度的差异，其中气孔密度与降水量呈线性正相关。代表气孔开张程度的气孔长度和宽度变化与土壤含水量呈线性相关。叶表面角质层厚度与海拔高度变化关系较大，并以上表面角质层厚度变化最为明显，主要受海拔高度升高引起的紫外线照射增强的影响。运动细胞带宽度占叶面积比虽然与各环境因子关系不很密切，但温度变化的影响较突出，这一显微结构调整与气孔变化构成干旱——高温调节机制。叶片表面毛茸的变化也是非常显著的，但与各环境因子关系密切程度均不大，可以肯定的是在土壤水分状况较好的生境下羊草叶片表面毛茸密度及长度明显增加，而一些干旱生境中常表现为毛茸较少、较短，个别样地基本没有发育较好的毛茸。总体上看，羊草叶片对干旱化的形态结构调整以气孔密度和开张程度的变化最大，是羊草叶片调节水分利用效率的重要适应性生态可塑性调整。 与叶片相比，羊草茎横切面结构特征的变化与各环境因子关系的显著性不是很强，但各样地间的差异是比较显著的，许多结构调整可能与土壤养分条件的变化有一定关系，如茎秆粗度变化、基本薄壁组织厚度和中央空腔（髓腔）直径的变化等，但本研究未能涉及这方面内容，有待于进一步研究。 羊草水分利用效率与降水量和土壤含水量呈显著的负相关关系，即随降水量和土壤含水量增大羊草水分利用效率明显降低，蒸腾耗水增大，这一生理变化与显微结构的调整关系密切，特别是气孔密度与气孔宽度在水分较差生境中明显减小，从而有利于适应干旱环境，减少耗水量。表现比较突出的是非地带性林西样地，其降水量处于10个样地的中等偏低水平，但其δ13C判别值较低，达-26.063‰，与降水量较大的长岭、双辽样地几乎相当，并比相邻的林东和克旗样地明显低，其气孔密度、开张程度及叶脉后生导管直径均较高（大），但其土壤水分状况是最好的样地之一，尽管取样时不幸遇到雨天，但从其群落类型——羊草杂类草草甸，并伴生许多中、湿生种类上看，其生境的湿润程度是毋庸置疑的。这一非地带性样地中羊草结构的变化从另一侧面反映了羊草显微结构调整对水分环境的适应。δ13C判别值是一个非常敏感的参数，在分析植物水分利用效率及其相关领域的研究中应深入利用。 群落植物功能群组成与环境因子及群落初级生产力关系研究结果表明，丛生禾草生长型功能群、旱生和中旱生植物水分生态类型功能群具有明显的地带性变化规律，并与群落生物量变化关系密切，变异性较低，占群落生物量比例较大，可考虑作为植物功能型组合对无牧样地植被变化进行评估和预测。在放牧影响下，C4植物光合类型功能群呈现明显的地带性变化，并在群落中所起的作用明显增强，亦可考虑作为评估和预测植被变化的植物功能型组合。无牧样地与放牧样地研究结果均表明，按Raunkiaer划分的地面芽、地下芽、地上芽和一年生植物生活型功能群，其地带性变化不明显，或变异率高，或占群落生物量比例小，不宜作植物功能群组合对植被变化进行评估和预测。

半干旱区典型植物对气候变化与C02浓度升高的响应与适应

1.羊草对土壤水分的响应与适应 羊草生物量随着土壤水分含量的降低逐渐降低，后期的降低幅度远远大于前期。干旱促进鞘分配增加，增加了在处理初期的根的分配，但到后期则使之减少，表明羊草在经历较长期的持续干旱后通过增加根部的比重来提高抗旱性的能力逐渐降低。轻度(LD)、中度干旱(MD)对羊草叶片相对含水量(RWC)、气孔密度、光合参数、荧光猝灭参数和群体日交换速率无显著影响，但严重土壤干旱使它们显著降低。 羊草叶片的可溶性蛋白质以中度干旱的最高，严重干旱(SD)特别是极严重干旱(VD)使之显著降低，游离氨基酸含量(FAA)的变化与之相似。随着土壤水分含量的降低硝酸还原酶(NR)活性逐渐下降，而谷氨酰胺酶合成酶(GS)的活性变化则是LD和MD使之分别增加了25.75%和12.22%，SD和VD则分别减少了8.21%和28.72%，说明了NR的活性变化对土壤干旱较敏感，而GS的活性则对适度的干旱有一定程度的适应性。LD处理没有增加天冬酰胺酶(AE)和内肽酶(EP)两种酶的活性，但MD、SD和VD使两种水解酶的活性显著增加，说明轻度土壤干旱对蛋白质和氨基酸的分解作用有稍降低作用，但随着土壤干旱程度的加剧，又极大地促进了这个分解过程。严重和极严重土壤干旱显著降低了叶片的总核酸含量和RNA的含量，暗示严重程度的土壤水分胁追限制了核酸的合成代谢，加强了其分解代谢，严重土壤干旱还显著增加了丙二醛(MDA)的含量，说明提高了羊草叶片叶肉细胞的膜质过氧化水平。 2.羊草对土壤干旱和复水的响应与适应 羊草受到适当的干旱驯化可促进生长，但过长时间的干旱处理，复水后未能补偿损失的生物量和叶面积。羊草叶片的气孔密度以中度干旱持续期(Mtd)处理的最高，其次是短期干旱持续期( Std)，二者分别比没有经过土壤干旱的处理（对照）增加了14.90%和3.61%，但长期干旱持续期(Ltd)却使之减少了27.19%，气孔指数亦有类似的趋势。复水增加羊草叶片的光合速率、气孔导度、蒸腾速率，近期复水的激发效应明显大于前期，而对夜晚的呼吸作用影响不显著。水分利用率( WUE)的日变化动态呈“M”字型曲线，以Mtd的WUE值的峰值最大，以三次曲线拟合WUE的24小时日进程最佳。叶绿素荧光动力学的分析结果表明，复水，特别是最近的复水可显著改善羊草叶片的PS II性能，增加叶绿素a，b的含量及其比值，提高碳酸酐酶的活性。 羊草含氮量以叶片的最高(4.40%)，根部的最低(1.99%)，枯叶、茎鞘和根茎的含量差异较小(2.26～4.40%)。所有器官的含氨量对土壤水分处理的响应基本一致，以对照处理的最低，Std的最高。各器官的碳氮比都是以对照的最高，而其它土壤水分处理相差不显著，给于一定时间的土壤干旱处理可使羊草获得较强的氨代谢能力。Std的氮素总拥有量最多，和对照相比，绿叶、枯叶、茎鞘、根茎和根分别提高了35.58、26.88、23.49、31.66、40.75%，而Ltd的含氨总量呈下降趋势，说明短时间的土壤水分干旱处理可明显促进羊草各器官和植株的氮素积累，而较长时间的土壤干旱则不利于氮素的积累。羊草各器官氮素绝对量占整株的百分比从大到小依次为：绿叶(42.42-44.00%)、根茎(20.13—23.69%)、根(15.43～17.18%)、枯叶(10.07～11.30%)和茎鞘(7.27～8.67%)，表明叶片的氮素存量占植株的一半以上。Mtd处理增加了叶片的氮素贡献率，减少了茎鞘和根茎的贡献率，有利于加强叶片的光合性能。 以中度干旱持续期(Mtd)处理的叶片可溶性蛋白质含量、谷氨酰胺合成酶(GS)活性、RNA含量为最高，但中长期的土壤干旱处理再复水后则显著降低了羊草叶片内肽酶(EP)的活性和MDA的含量，说明给于一定时间的土壤干旱处理可使羊草叶片保持较高的蛋白质代谢水平，降低膜脂过氧化水平。 3.羊草对昼夜温差与土壤水分交互作用响应与适应 昼夜温差减少使单株羊草的生物量降低21.3%，分蘖和根的生物量减少，而鞘的生物量稍增加，显著降低了严重和极严重条件下的生物量。温差缩小降低了分蘖和根的投资比例，减少植株的地下部分生物量，而增加新叶、鞘和分蘖光合产物的比例，表明温差的减少将抑制光台产物向地下部分的转移。温差减少对充足土壤水分和轻度干旱处理的放射性比强影响较小，但减少了其它3种干旱处理的放射性比强。其原因主要是减少了植株鞘、根和根茎的放射性比强，显著增加了饲喂叶和心叶的放射性比强，表明温差的缩小阻止了“源”的光合产物向“库”的转移，降低对分蘖和根的投资，不利于羊草对干旱逆境的适应。 昼夜温差缩小使羊草叶片的气孔密度降低4.01%，而且减少了土壤干旱对气孔密度的影响。较高的昼夜温差和较低的昼夜温差相比，羊草叶片的光合速率和WUE分别增加了7.37%和20.09%;而气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率分别降低了14.03%、2.57%和10.80%。昼夜温差减少降低了土壤干旱的δ13C值，说明可能减少处在干旱条件下的植株WUE，暗示减小昼夜温差不利于增大羊草叶片对土壤水分亏缺的耐性。昼夜温差的缩小主要影响了下午羊草群体的CO2交换速率，增加了对照、LD和MD处理的夜间呼吸速率，降低了尤其是显著降低了在土壤缺水条件下的CO2昼夜净交换量，而在两个昼夜温差条件下都是以LD的最高。 昼夜温差缩小影响氮素含量在羊草各器官中的氮素分配，降低了叶片和茎鞘中的氮素百分比含量，但增加了根茎和根中的氮素含量。在较小的昼夜温差条件下，LD显著增加了叶片的氮素含量，但其它土壤水分处理影响不显著，在较大的昼夜温差条件下，亦是LD显著增加了叶片的氮素含量，但MD也使其显著增加。昼夜温差缩小增加了叶片和茎鞘的碳氮比，降低了根茎和根的碳氮比，使叶片在中度和严重土壤水分胁迫时无变化，降低了响应于土壤水分变化的调节弹性。 昼夜温差缩小使羊草叶片可溶性蛋白质降低了16.14%。LD和MD显著促进叶片可溶性蛋白质含量增加，SD和VD都显著地降低了羊草叶片的可溶性蛋白质含量。昼夜温差缩小有使羊草叶片游离氨基酸降低的趋势，主要是降低土壤干旱条件下的游离氨基酸含量，虽然昼夜温差缩小稍增加了可溶性耱的含量(4.68%)，但使土壤干旱激发效应变得不显著，表明温差的缩小降低了叶片中渗透调节物质的积累，不利于羊草抗旱性的提高。昼夜温差缩小显著降低了羊草叶片的NR、GS和谷氨酸脱氢酶(GDH)的活性，在较小昼夜温差条件下几乎看不出土壤水分降低的激发效应，而在高温差下则明显看出LD的激发效应。昼夜温差减少加强土壤干旱对天冬酰胺酶和内肽酶活性的影响，加强了蛋白质和关键氨基酸的分解作用，提高了叶片的膜脂过氧化水平，不利于羊草对干旱的适应性响应。 在土壤水分充足条件下，昼夜温差缩减对羊草叶片气孔形态的影响不明显，但可以看出温差较大时有较多的星状蜡质覆于气孔表面及其周围，这可能是由于夜间温度升高后植物为了减少水分的散失而采取的一种适应性策略。在本实验条件下，中度和严重土壤水分胁迫使气孔变得更加凹陷，气孔更加坚挺，体现了对土壤干旱的适应性反应。对羊草叶片叶肉细胞超微结构的观察表明，昼夜温差对土壤水分充足时的超微结构影响不显著，但在严重土壤干旱条件下，昼夜温差缩减似乎减少了叶绿体中的淀粉粒，加速了叶绿体和线粒体膜的裂解，表明昼夜温差缩减加大了严重土壤干旱对羊草叶片叶肉细胞超微结构的负面影响。 4.羊草对温度和土壤水分交互作用的响应与适应 温度升高使羊草叶片气孔导度和蒸腾速率增加，使光合速率(A)和水分利用率( WUE)降低。土壤干旱和高温均导致最大光化学效率、量子产额和光化学荧光猝灭系数降低，使非光化学荧光猝灭系数升高。土壤干旱减少了羊草幼苗的生物量，却显著增加了根的贡献率和根冠比，而高温使二者显著地降低。在本实验条件下，直到极端干旱才显著降低了羊草叶片的A和WUE，而其他的水分处理影响不显著。土壤干旱使得叶片中的含氮量显著降低：温度对叶片氮含量无显著影响，但却显著地降低了根中的氮含量，尤其显著增加根与叶片氮含量的比率。高温加强了干旱对光合性能的影响，表明高温降低了羊草对干旱的适应能力。 温度过低或过高都对叶片保持高水平的可溶性蛋白质不利，温度过高还削弱了土壤水分亏缺对叶片中游离氨基酸的激发作用。水分梯度对20℃时的GS活性无显著影响，但LD促使26℃和29'C下的GS活性增加，MD以上强度的土壤干旱都显著降低了23℃以上温度尤其是29℃和32℃时的GS活性，表明高温和干旱的协同效应对谷氨酰胺的合成不利。高温增加了AE和EP的活性，加强了土壤干旱对羊草叶片蛋白质和氨基酸分解的促进作用，在一定的土壤水分条件下，高温对RNA的合成作用增强，认为这是对高温胁迫的一种适应性响应。 随着温度的升高羊草叶片中的可溶性糖含量逐渐增加，土壤干旱亦增加了其可溶性糖的含量，但至极端干旱时则使之降低。在20℃下，土壤水分对羊草叶片的可溶性糖的含量无显著影响，在23—32℃温度条件下则是土壤干旱增加了其值，但至VD时则使之显著降低。不同温度条件下，土壤水分对羊草叶片的MDA影响不同，在20℃下，无显著影响，在23和26℃下，SD和VD使MDA稍升高，但在29和32℃条件下使之显著增加，说明温度升高加强了土壤干旱所引发的增加叶片膜质过氧化水平的负面影响。 5.柠条和杨柴对CO2浓度倍增和土壤水分交互作用的响应与适应 土壤干旱使拧条和杨柴的生物量在倍增CO2浓度条件下比在正常浓度条件下降低幅度更大。CO2浓度倍增较大地促进了充足水分条件下的植物生长，而对干旱条件下的生长促进作用则较小。无论在中度条件下还是在严重干旱条件下，两种优势植物均是在倍增CO2浓度条件下增加的根冠比幅度较大;无论在中度条件下还是在严重干旱条件下，且无论正常CO2浓度条件下还是在倍增CO2浓度条件下均是杨柴增加的幅度大。CO2浓度倍增主要增加了水分充足和MD的单位叶面积质量(LMA)，但反而降低了严重干旱的LMA。 CO2倍增使δ13C降低，但土壤干旱使之增加。用“库”（根）中的δ13C值对“源”（叶片）中的δ13C作图，可以用以评价碳分配以及“库”中新增生物量，两种沙生灌木叶片与根部的δ13C值呈极显著线性关系，杨柴的斜率大于柠条的，表明前者叶片与根部在光合产物分配上具有较高的可塑性，这和干旱条件下杨柴的根冠比增加相关联。杨柴的“源库”调节特性反映了对逆境具有较高的耐性。 CO2倍增使柠条和杨柴叶片含氮量分别降低了10.40%和5.06%，土壤干旱有使柠条叶片含氮量增加的趋势，但中度干旱没有增加羊柴叶片的含氮量。CO2倍增使叶片的碳氮比显著增加，而干旱使之降低。CO2浓度倍增降低叶肉细胞质膜的过氧化产物MDA的含量，干旱亦使叶片的MDA含量增加。叶片含氮量与MDA呈显著正相关，表明CO2倍增有保护叶片免受土壤干旱的作用，但干旱的负面影响是CO2倍增效应所难以弥补的。 CO2倍增降低了柠条叶片的可溶性蛋白质的含量，但在干旱条件下降低幅度较小，说明CO2浓度升高条件下可减轻干旱影响叶片中可溶性蛋白质的强度，体现了CO2浓度倍增对植物的抗旱性有利的一面。CO2浓度倍增使土壤水分充足条件下的柠条叶片中游离氨基酸含量降低17.24%，却使SD条件下增加10.78%，表明土壤干旱导致的叶片游离氨基酸含量的增加平衡了CO2升高造成的降低。在充足土壤水分和MD条件下，CO2浓度倍增对核酸总含量和RNA含量有稀释效应，但严重干旱条件下，CO2倍增提高了核酸总含量和RNA的含量。