Plasmonic nanoparticles as sensors : a novel approach to quantify adsorption and diffusion kinetics

Biosensors find wide application in clinical diagnostics, bioprocess control and environmental monitoring. They should not only show high specificity and reproducibility but also a high sensitivity and stability of the signal. Therefore, I introduce a novel sensor technology based on plasmonic nanoparticles which overcomes both of these limitations. Plasmonic nanoparticles exhibit strong absorption and scattering in the visible and near-infrared spectral range. The plasmon resonance, the collective coherent oscillation mode of the conduction band electrons against the positively charged ionic lattice, is sensitive to the local environment of the particle. I monitor these changes in the resonance wavelength by a new dark-field spectroscopy technique. Due to a strong light source and a highly sensitive detector a temporal resolution in the microsecond regime is possible in combination with a high spectral stability. This opens a window to investigate dynamics on the molecular level and to gain knowledge about fundamental biological processes.rnFirst, I investigate adsorption at the non-equilibrium as well as at the equilibrium state. I show the temporal evolution of single adsorption events of fibrinogen on the surface of the sensor on a millisecond timescale. Fibrinogen is a blood plasma protein with a unique shape that plays a central role in blood coagulation and is always involved in cell-biomaterial interactions. Further, I monitor equilibrium coverage fluctuations of sodium dodecyl sulfate and demonstrate a new approach to quantify the characteristic rate constants which is independent of mass transfer interference and long term drifts of the measured signal. This method has been investigated theoretically by Monte-Carlo simulations but so far there has been no sensor technology with a sufficient signal-to-noise ratio.rnSecond, I apply plasmonic nanoparticles as sensors for the determination of diffusion coefficients. Thereby, the sensing volume of a single, immobilized nanorod is used as detection volume. When a diffusing particle enters the detection volume a shift in the resonance wavelength is introduced. As no labeling of the analyte is necessary the hydrodynamic radius and thus the diffusion properties are not altered and can be studied in their natural form. In comparison to the conventional Fluorescence Correlation Spectroscopy technique a volume reduction by a factor of 5000-10000 is reached.

Bio-inspired polymer-supported nitrido molybdenum(VI) complexes for ammonia synthesis − reactivity towards protons and electrons : EPR investigations on paramagnetic molybdenum(V) and copper(II) complexes

Die biologische Stickstofffixierung durch Molybdän-haltige Nitrogenasen sowie die Erforschung des zugrundeliegenden komplexen Mechanismus (N2-Aktivierung an Metall-Zentren, 6-fache Protonierung und Reduktion, N–N Bindungsspaltung unter Bildung von Ammoniak) ist von erheblichem Interesse. Insbesondere Molybdän-Komplexe wurden bereits erfolgreich als Modellverbindungen für die Untersuchung elementarer Einzelschritte der N2-Aktivierung eingesetzt. Durch die Verwendung von Triamidoamin-Liganden ist es Schrock et al. sogar gelungen mehrere Katalysezyklen zu durchlaufen und einen Mechanismus zu formulieren. Trotz der sterisch anspruchsvollen Substituenten in den Schrock-Komplexen ist die Umsatzrate dieses homogenen Katalysators, aufgrund Komplex-Deaktivierung infolge intermolekularer Reaktionen wie Dimerisierung und Disproportionierung, limitiert. In der vorliegenden Arbeit wurden einige dieser Herausforderungen angegangen und die aktiven Spezies auf einer Festphase immobilisiert, um intermolekulare Reaktionen durch räumliche Isolierung der Komplexe zu unterdrücken.rnEin Polymer-verankertes Analogon des Schrock Nitrido-Molybdän(VI)-Komplexes wurde auf einem neuen Reaktionsweg synthetisiert. Dieser beinhaltet nur einen einzigen Reaktionsschritt, um die funktionelle Gruppe „MoN“ einzuführen. Protonierung des immobilisierten Nitrido-Molybdän(VI)-Komplexes LMoVIN (L = Polymer-verankerter Triamidoamin-Ligand) mit 2,6-Lutidinium liefert den entsprechenden Imido-Molybdän(VI)-Komplex. Durch anschließende Ein-Elektronen-Reduktion mit Cobaltocen wird der Polymer-angebundene Imido-Molybdän(V)-Komplex erhalten, bewiesen durch EPR-Spektroskopie (g1,2,3 = 1.989, 1.929, 1.902). Durch die Immobilisierung und die effektive räumliche Separation der Reaktionszentren auf der Festphase werden bimolekulare Nebenreaktionen, die oft in homogenen Systemen auftreten, unterdrückt. Dies ermöglicht zum ersten Mal die Darstellung des Imido-Molybdän(V)-Intermediates des Schrock-Zyklus.rnEPR-Spektren des als Spin-Label eingeführten immobilisierten Nitrato-Kupfer(II)-Komplexes wurden unter verschiedenen Bedingungen (Lösungsmittel, Temperatur) aufgenommen, wobei sich eine starke Abhängigkeit zwischen der Zugänglichkeit und Reaktivität der immobilisierten Reaktionszentren und der Art des Lösungsmittels zeigte. Somit wurde die Reaktivität von LMoVIN gegenüber Protonen und Elektronen, welches zur Bildung von NH3 führt, unter Verwendung verschiedener Lösungsmittel untersucht und optimiert. Innerhalb des kugelförmigen Polymers verläuft die Protonierung und Reduktion von LMoVIN stufenweise. Aktive Zentren, die sich an der „äußeren Schale“ des Polymers befinden, sind gut zugänglich und reagieren schnell nach H+/e− Zugabe. Aktive Zentren im „Inneren des Polymers“ hingegen sind schlechter zugänglich und zeigen langsame diffusions-kontrollierte Reaktionen, wobei drei H+/e− Schritte gefolgt von einer Ligandenaustausch-Reaktion erforderlich sind, um NH3 freizusetzen: LMoVIN  LMoVNH  LMoIVNH2  LMoIIINH3 und anschließender Ligandenaustausch führt zur Freisetzung von NH3.rnIn einem weiteren Projekt wurde der Bis(ddpd)-Kupfer(II)-Komplex EPR-spektroskopisch in Hinblick auf Jahn−Teller-Verzerrung und -Dynamik untersucht. Dabei wurden die EPR-Spektren bei variabler Temperatur (70−293 K) aufgenommen. Im Festkörperspektrum bei T < 100 K erscheint der Kupfer(II)-Komplex als gestreckter Oktaeder, wohingegen das EPR-Spektrum bei höheren Temperaturen g-Werte aufzeigt, die einer pseudo-gestauchten oktaedrischen Kupfer(II)-Spezies zuzuordnen sind. Diese Tatsache wird einem intramolekularen dynamischen Jahn−Teller Phänomen zugeschrieben, welcher bei 100 K eingefroren wird.

Untersuchungen zur Lokalisation und Expression des respiratorischen Proteins Neuroglobin bei Säugetieren

In der vorliegenden Arbeit wurde Neuroglobin (Ngb), ein evolutiv altes und in Metazoen konserviertes respiratorisches Protein, funktionell untersucht. Mittels des induzierbaren Tet on / Tet off Systems wurde Ngb ektopisch in der murinen Leber und im Gehirn überexprimiert. Die Transkriptome von Leber und Gehirnregionen Ngb-transgener Mäuse wurden mittels Microarrays und RNA-Seq im Vergleich zum Wildtyp analysiert, um Auswirkungen der Ngb-Überexpression zu ermitteln. Die Transkriptom-Analyse in Leber und Gehirn zeigte eine nur geringe Anzahl differenziell regulierter Gene und Stoffwechselwege nach Ngb-Überexpression. Ngb transgene Mäuse wurden CCl4-induziertem ROS-Stress ausgesetzt und die Leberfunktion untersucht. Zudem wurden primäre Hepatozyten-Kulturen etabliert und in diesen in vitro die extrinsische Apoptose induziert. Die Stressversuche zeigten: (i) Die Ngb-Überexpression hat keine protektive Wirkung in der Leber in vivo. (ii) In Leberzellen in vitro hingegen verminderte eine Ngb-Überexpression effizient die Aktivierung der apoptotischen Kaskade. Eine protektive Wirkung von Ngb ist vermutlich von betrachtetem Gewebe und dem verwendeten Stressor abhängig und keine generelle, selektierte Funktion des Proteins.rnWeiterhin wurde eine Ngb-KnockOut-Mauslinie mit einem LacZ-KnockIn-Genotyp etabliert. Hierbei zeigten die KO-Mäuse keinen offensichtlichen Phänotyp in ihrer Entwicklung, Fortpflanzung und Retina-Funktion. Unter Verwendung des LacZ-Knockin-Konstrukts konnten kontrovers diskutierte Ngb-Expressionsorte im adulten Mausgehirn (Hippocampus, Cortex und Cerebellum) sowie in Testes experimentell bestätigt werden. Parallel wurden öffentlich verfügbare RNA-Seq Datensätze ausgewertet, um die regionale Ngb-Expression systematisch ohne Antikörper-assoziierte Spezifitätsprobleme zu charakterisieren. Eine basale Ngb-Expression (RPKM: ~1-5) wurde im Hippocampus, Cortex und Cerebellum, sowie in Retina und Testes ermittelt. Eine 20-40fach höhere, starke Expression (RPKM: ~160) wurde im Hypothalamus bzw. im Hirnstamm nachgewiesen. Die „digitale“ Expressionsuntersuchung wurde mittels qRT-PCR und Western Blot bestätigt. Dieses Expressionsprofil von Ngb in der Maus weist auf eine besondere funktionelle Bedeutung von Ngb im Hypothalamus hin. Eine Funktion von Ngb in der Sauerstoffversorgung der Retina und eine generelle Funktion von Ngb in der Protektion von Neuronen sind mit dem beobachteten Expressionsspektrum weniger gut vereinbar.

Untersuchungen zur Esca-Erkrankung von Weinpflanzen : Pilz-Pflanze und antagonistische Interaktionen

Ziel dieser Arbeit war es, ein besseres Verständnis für die molekularen und biochemischen Grundlagen der Esca-Krankheit an Reben zu erarbeiten. Hierzu wurden sechs Teilprojekte durchgeführt. Die beiden Pilze Pm. chlamydospora und Pa. aleophilum wurden submers kultiviert um die gewonnenen Extrakte auf phytotoxische Substanzen zu untersuchten. Dabei wurden Metabolite isoliert, die zum ersten mal mit der Esca-Krankheit assoziiert werden konnten, wie Siderophoren und Kaempferol-3-O-Glukosid. Diese können das Verständnis der Pilz-Pflanze-Interaktion um neue Aspekte ergänzen. Die Glykosylierung von Kaempferol durch Pm wurde erstmals nachgewiesen und die hier dargelegten Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Pilz in der Lage ist, die von der Pflanze als Abwehrantwort produzierte Substanz, seinerseits zu nutzen. Dies bedeutet, dass Pm einen pflanzlichen Abwehrstoff durch Glykosylierung umwandelt und für die Wirtspflanze toxifiziert. Die durchgeführten Injektionstests in vivo in Weinpflanzen zeigten zudem, dass Esca-ähnliche Symptome durch K3G hervorgerufen werden können. Abseits dieser neuen Erkenntnisse konnten auch literaturbekannte Phytotoxine in den Extrakten identifiziert werden.rnIm zweiten Teilprojekt dieser Arbeit wurden Polyketidsynthase-Gene der beiden Pilze Pm und Pa inaktiviert. Zusätzlich wurde der veränderte Sekundärstoffwechsel bzw. die Reaktion der Insertionsmutanten auf abiotischen Stress und Infektionsfähigkeit von Vitis-Pflanzen untersucht. Damit ist es in dieser Arbeit erstmals gelungen selektiv Gene der Esca-assoziierten Pathogene zu inaktivieren. Es zeigte sich, dass die Mutanten sensitiver als die Wildtyp-Stämme bezüglich Salz-, Trocken- und oxidativen Stress reagieren. Die Infektionsfähigkeit bleibt jedoch unverändert.rnDie Analyse der Infektionsmechanismen sollte auch bei der Transformation der Pilze mit Fluoreszenzgenen im Fokus stehen. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es GFP-Mutanten der Pilze Pm, Pa und El zu generieren um das Wachstum nach Infektion von Weinpflanzen zu erfassen. Mit Hilfe der Fluoreszenzmutanten war es möglich ein neues Verfahren zur Suche nach potentiellen Antagonisten zu erstellen. Mit dem Vitis Shoot Assay konnten die Esca-assoziierten Pilze und Fungizide, endophytische Pilze, Trichoderma spp. und Bakterien-Stämme in einem Testverfahren auf Schnittwunden untersucht werden. Dabei konnten erste biologische Wundschutzmittel auf Basis ganzer Organismen identifiziert werden. Es zeigte sich, dass der durchgeführte Antagonistentest und das hier beschriebene innovative Vitis Shoot Assay nicht immer äquivalente Ergebnisse generierten und dass sich die beiden Verfahren ergänzen.rnDes Weiteren wurde eine Interaktionsstudie der vier Esca-assoziierten Pilze unter Stressbedingungen und verschiedenen Temperaturen durchgeführt um den Einfluss äußere biotischer und abiotischer Faktoren auf das Zusammenwirken dieser Erreger zu untersuchen. Die Pilze reagieren sehr unterschiedlich in den durchgeführten Stresstests und die Dominanz einzelner Erreger hängt stark von der Temperatur und den osmotischen Verhältnissen ab. Es konnte gezeigt werden, dass veränderte klimatische Bedingungen zur veränderten Zusammensetzung des Erregerspektrums führen kann.rnDie in dieser Arbeit generierten Ergebnisse geben neue Einblicke in die Esca Erkrankung von Weinreben und ermöglichen die weitere Forschung einiger weiterer Aspekte.

Expanding the scope of poly(ethylene glycol)s for bioconjugation to squaric acid-mediated PEGylation and pH-sensitivity

Poly(ethylene glycol) (PEG) is used in a broad range of applications due to its unique combination of properties and is approved use in formulations for body-care products, edibles and medicine. This thesis aims at the synthesis and characterization of novel heterofunctional PEG structures and the establishment of diethyl squarate as a suitable linker for the covalent attachment to proteins. Chapter 1 is an introduction on the properties and applications of PEG as well as the fascinating chemistry of squaric acid derivatives. In Chapter 1.1, the synthesis and properties of PEG are described, and the versatile applications of PEG derivatives in everyday products are emphasized with a focus on PEG-based pharmaceuticals and nonionic surfactants. This chapter is written in German, as it was published in the German Journal Chemie in unserer Zeit. Chapter 1.2 deals with PEGs major drawbacks, its non-biodegradability, which impedes parenteral administration of PEG conjugates with polyethers exceeding the renal excretion limit, although these would improve blood circulation times and passive tumor targeting. This section gives a comprehensive overview of the cleavable groups that have been implemented in the polyether backbone to tackle this issue as well as the synthetic strategies employed to accomplish this task. Chapter 1.3 briefly summarizes the chemical properties of alkyl squarates and the advantages in protein conjugation chemistry that can be taken from its use as a coupling agent. In Chapter 2, the application of diethyl squarate as a coupling agent in the PEGylation of proteins is illustrated. Chapter 2.1 describes the straightforward synthesis and characterization of squaric acid ethyl ester amido PEGs with terminal hydroxyl functions or methoxy groups. The reactivity and selectivity of theses activated PEGs are explored in kinetic studies on the reactions with different lysine and other amino acid derivatives, followed by 1H NMR spectroscopy. Further, the efficient attachment of the novel PEGs to a model protein, i.e., bovine serum albumin (BSA), demonstrates the usefulness of the new linker for the PEGylation with heterofunctional PEGs. In Chapter 2.3 initial studies on the biocompatibility of polyether/BSA conjugates synthesized by the squaric acid mediated PEGylation are presented. No cytotoxic effects on human umbilical vein endothelial cells exposed to various concentrations of the conjugates were observed in a WST-1 assay. A cell adhesion molecule - enzyme immunosorbent assay did not reveal the expression of E-selectin or ICAM-1, cell adhesion molecules involved in inflammation processes. The focus of Chapter 3 lies on the syntheses of novel heterofunctional PEG structures which are suitable candidates for the squaric acid mediated PEGylation and exhibit superior features compared to established PEGs applied in bioconjugation. Chapter 3.1 describes the synthetic route to well-defined, linear heterobifunctional PEGs carrying a single acid-sensitive moiety either at the initiation site or at a tunable position in the polyether backbone. A universal concept for the implementation of acetal moieties into initiators for the anionic ring-opening polymerization (AROP) of epoxides is presented and proven to grant access to the degradable PEG structures aimed at. The hydrolysis of the heterofunctional PEG with the acetal moiety at the initiating site is followed by 1H NMR spectroscopy in deuterium oxide at different pH. In an exploratory study, the same polymer is attached to BSA via the squarate acid coupling and subsequently cleaved from the conjugate under acidic conditions. Furthermore, the concept for the generation of acetal-modified AROP initiators is demonstrated to be suitable for cholesterol, and the respective amphiphilic cholesteryl-PEG is cleaved at lowered pH. In Chapter 3.2, the straightforward synthesis of α-amino ω2-dihydroxyl star-shaped three-arm PEGs is described. To assure a symmetric length of the hydroxyl-terminated PEG arms, a novel AROP initiator is presented, who’s primary and secondary hydroxyl groups are separated by an acetal moiety. Upon polymerization of ethylene oxide for these functionalities and subsequent cleavage of the acid-labile unit no difference in the degree of polymerization is seen for both polyether fragments.

Synthese und Evaluierung von (Radio)Liganden für den Free Fatty Acid Rezeptor 1

Der Free Fatty Acid Receptor 1 (FFAR1) ist ein G-Protein gekoppelter Rezeptor, welcher neben einer hohen Expression im Gehirn auch eine verstärkte Expressionsrate auf den β-Zellen des Pankreas aufweist. Diese Expressionsmuster machen ihn zu einem idealen Target für die Visualisierung der sogenannten β-Zell-Masse mittels molekularer bildgebender Verfahren wie der PET. Eine Entwicklung geeigneter Radiotracer für die β-Zell-Bildgebung würde sowohl für die Diagnostik als auch für die Therapie von Typ-1- und Typ-2-Diabetes ein wertvolles Hilfsmittel darstellen.rnAufbauend auf einem von Sasaki et al. publiziertem Agonisten mit einem vielversprechendem EC50-Wert von 5,7 nM wurden dieser Agonist und zwei weitere darauf basierende 19F-substituierte Moleküle als Referenzverbindungen synthetisiert (DZ 1-3). Für die 18F-Markierung der Moleküle DZ 2 und DZ 3 wurden die entsprechenden Markierungsvorläufer (MV 1-3) synthetisiert und anschließend die Reaktionsparameter hinsichtlich Temperatur, Lösungsmittel, Basensystem und Reaktionszeit für die nukleophile n.c.a. 18F-Fluorierung optimiert. Die abschließende Entschützung zum fertigen Radiotracer wurde mit NaOH-Lösung durchgeführt und die Tracer injektionsfertig in isotonischer NaCl-Lösung mit radiochemischen Ausbeuten von 26,9 % ([18F]DZ 2) und 39 % ([18F]DZ 3) erhalten.rnZusätzlich wurde ein Chelator zur 68Ga-Markierung an den Liganden gekoppelt (Verb. 46) und die Markierungsparameter optimiert. Nach erfolgter Markierung mit 95 % radiochemischer Ausbeute, wurde der Tracer abgetrennt und in vitro Stabilitätsstudien durchgeführt. Diese zeigten eine Stabilität von mehr als 90 % über 120 min in sowohl humanem Serum (37 °C) als auch isotonischer NaCl-Lösung.rnMit einem ebenfalls synthetisierten fluoreszenzmarkierten Derivat des Liganden (Verb. 43) wurden erste LSM-Bilder an sowohl Langerhansschen Inseln als auch FFAR1-tragenden RIN-M Zellen durchgeführt, welche einen vielversprechenden Uptake des neuen Liganden in die Zellen zeigen. Weitere Untersuchungen und biologische Evaluierungen stehen noch aus. Mit den Referenzsubstanzen wurden zusätzlich Vitalitätsstudien an Langerhansschen Inseln durchgeführt, um einen negativen toxischen Einfluss auszuschließen.rn

Diversity of baculoviruses isolated from cutworms (Agrotis spp.)

Larven der Eulenfalter, Gattung Agrotis (Lepidoptera: Noctuidae), sind Schädlinge in der Landwirtschaft, welche gravierende Fraßschäden an bodennahen Pflanzenteilen verursachen. Häufig kommt es zum Absterben der noch jungen Pflanzen oder zu Beschädigungen der pflanzlichen Produkte, was zu finanziellen Ertragsverlusten führt. Zwei der wichtigsten landwirtschaftlichen Schädlinge der Gattung Agrotis sind die Larven der Saateule (Agrotis segetum) und der Ypsiloneule (Agrotis ipsilon), welche bisher überwiegend mittels chemischer Pestizide bekämpft werden. Als eine umweltfreundliche, nachhaltige und vielversprechende Alternative in der Bekämpfung wird der Einsatz von Baculoviren berücksichtigt. Baculoviren zeichnen sich durch eine hohe Virulenz und einem sehr engen Wirtsbereich aus. Häufig werden nur wenige nah verwandte Arten der gleichen Gattung infiziert. Aus der Gattung Agrotis wurden bisher mindestens vier Baculoviren isoliert und charakterisiert, welche als potentielle biologische Pflanzenschutzmittel in Frage kommen; sie gehören zu zwei Gattungen der Baculoviren: rnAlphabaculovirusrn(i) Agrotis segetum nucleopolyhedrovirus A (AgseNPV-A)rn(ii) Agrotis segetum nucleopolyhedrovirus B (AgseNPV-B)rn(iii) Agrotis ipsilon nucleopolyhedrovirus (AgipNPV)rnBetabaculovirusrn(i) Agrotis segetum granulovirus (AgseGV).rnDie Genome der AgseNPV-A, AgipNPV sowie des AgseGV wurden in vorherigen Studien bereits vollständig sequenziert und publiziert. In der vorgelegten Dissertation wurde das AgseNPV-B sequenziert und umfassend mit AgseNPV-A und AgipNPV verglichen. Das Genom von AgseNPV-B ist 148981 Kbp groß und kodiert ….. offene Leseraster. Phylogenetische Analysen zeigen eine enge Verwandtschaft dieser drei Viren und klassifizieren AgseNPV-B als eine neue Art innerhalb der Gattung Alphabaculovirus. Auf Basis der vorhandenen Genomsequenzen konnte eine PCR-basierende Methode zur Detektion und Quantifizierung on AgseNPV-A, AgseNPV-B, AgipNPV und AgseGV etabliert werden. Dises Verfahren ermöglichte die Quantifizierung von AgseNPV-B und AgseGV in Larven von A. segetum, die von beiden Viren zeitgleichinfiziert waren. Durch das gemeinsame Auftreten dieser beiden Wiren innerhalb eines Wirtsindividuums stellte sich die Frage, welche Art der Interaktion bei einer Ko-Infektion vorliegt. Durch Mischinfektionsversuche von AgseNPV-B und AgseGV konnte gezeigt werden, dass beide Viren um die Ressourcen der Larven konkurrieren. Eine für landwirtschaftliche Zwecke vorteilige Interaktion, wie das vorzeitige Verenden der Larven, das bereits für andere interagierende Baculoviren nachgewiesen wurde, konnte ausgeschlossen werden. Neben den Mischinfektionsversuchen wurden auch AgseGV und AgseNPV-B einzeln auf ihre Eignung als biologisches Pflanzenschutzmittel getestet. AgseGV zeigte in den Laborversuchen eine relativ langsame Wirkung, während AgseNPV-B durchaus Potential für ein rasche Abtötung besitzt. rnDie durchgeführten Aktivitätsstudien und die Charakterisierung von AgseNPV-B als neue Art erlauben ein vertieftes biologisches und molekulares Verständnis des Virus legen den Grundstein für und eine mögliche spätere Zulassung als Pflanzenschutzmittel. Die Methode zur Identifizierung und Quantifizierung der Agrotis-Baculoviren stellt ein wichtiges Instrument in der Qualitätskontrolle für Produzenten dar und ermöglicht zudem weitere Untersuchungen von Agrotis-Baculoviren in Mischinfektionen.

Einsatz eines Aerosolmassenspektrometers während der CYPHEX-Kampagne und zur Methodenentwicklung einer Echtzeitquantifizierung gasförmiger Amine

Atmosphärische Aerosole haben einen starken Einfluss auf das Klima, der bisher nur grundlegend verstanden ist und weiterer Forschung bedarf. Das atmosphärische Verhalten der Aerosolpartikel hängt maßgeblich von ihrer Größe und chemischen Zusammensetzung ab. Durch Reflexion, Absorption und Streuung des Sonnenlichtes verändern sie den Strahlungshaushalt der Erde direkt und durch ihre Einflussnahme auf die Wolkenbildung indirekt. Besonders gealterte, stark oxidierte organische Aerosole mit großem Sauerstoff-zu-Kohlenstoff-Verhältnis wirken als effektive Wolkenkondensationskeime. Neben primären Aerosolpartikeln, die direkt partikelförmig in die Atmosphäre gelangen, spielen sekundäre Aerosolpartikel eine große Rolle, die aus Vorläufergasen in der Atmosphäre entstehen. Aktuelle Forschungsergebnisse legen nahe, dass kurzkettige aliphatische Amine bei Nukleationsprozessen beteiligt sind und somit die Partikelneubildung vielerorts mitsteuern. Um die Rolle von Aminen in der Atmosphäre besser erforschen und industrielle Emissionen kontrollieren zu können, bedarf es einer zuverlässigen Methode zur Echtzeitquantifizierung gasförmiger Amine mit hoher Zeitauflösung und niedriger Nachweisgrenze.rnDas hochauflösende Flugzeit-Aerosolmassenspektrometer (HR-ToF-AMS) bietet die Möglichkeit, atmosphärische Partikel in Echtzeit zu analysieren. Dabei werden Größe, Menge und grundlegende chemische Zusammensetzung erfasst. Anorganische Aerosolbestandteile können eindeutig zugeordnet werden. Es ist jedoch kaum möglich, einzelne organische Verbindungen in den komplizierten Massenspektren atmosphärischer Aerosole zu identifizieren und quantifizieren.rnIn dieser Arbeit wird atmosphärisches Aerosol untersucht, das im Westen Zyperns während der CYPHEX-Kampagne mit einem HR-ToF-AMS gemessen wurde. An diesem Standort ist vor allem stark gealtertes Aerosol vorzufinden, das aus Zentral- und Westeuropa stammt. Lokale Einflüsse spielen fast keine Rolle. Es wurde eine durchschnittliche Massenkonzentration von 10,98 μg/m3 gefunden, zusammengesetzt aus 57 % Sulfat, 30 % organischen Bestandteilen, 12 % Ammonium, < 1 % Nitrat und < 1 % Chlorid, bezogen auf das Gewicht. Der Median des vakuum-aerodynamischen Durchmessers betrug 446,25 nm. Es wurde sehr acides Aerosol gefunden, dessen anorganische Bestandteile weitgehend der Zusammensetzung von Ammoniumhydrogensulfat entsprachen. Tag-Nacht-Schwankungen in der Zusammensetzung wurden beobachtet. Die Sulfatkonzentration und die Acidität zeigten tagsüber Maxima und nachts Minima. Konzentrationsschwankungen an Nitrat und Chlorid zeigten einen weniger ausgeprägten Rhythmus, Maxima fallen aber immer mit Minima der Sulfatkonzentration, Aerosolacidität und Umgebungstemperatur zusammen. Organische Aerosolbestandteile entsprachen stark gealtertem, schwerflüchtigem oxidiertem organischem Aerosol. Es wurde eine interne Mischung der Partikel beobachtet, die ebenfalls meist bei alten Aerosolen auftritt.rnUm mit dem HR-ToF-AMS auch einzelne organische Verbindungen identifizieren und quantifizieren zu können, wurde eine Methode entwickelt, mit der man Amine der Gasphase selektiv in künstlich erzeugte Phosphorsäurepartikel aufnimmt und so für die HR-ToF-AMS-Messung zugänglich macht. Dadurch kombiniert man die Vorteile der Online-Messung des HR-ToF-AMS mit den Vorteilen klassischer Offline-Probenahmen. So können in Echtzeit sehr einfache Massenspektren gemessen werden, in denen störende Komponenten abgetrennt sind, während die Analyten eindeutig identifiziert werden können. Systeme dieser Art wurden GTRAP-AMS (Gaseous compound TRapping in Artificially-generated Particles – Aerosol Mass Spectrometry) genannt. Kalibrierungen für (Mono)Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin, Diethylamin und Triethylamin ergaben Nachweisgrenzen im ppt-Bereich bei einer Zeitauflösung von 3 min. Kammerexperimente zur Aminemission von Pflanzen zeigten eine gute Übereinstimmung des neu entwickelten Systems mit einer Gasdiffusionsabscheider-Offline-Probenahme und anschließender ionenchromatographischer Analyse. Beide Methoden zeigten Reaktionen der Pflanzen auf eine Veränderung der Lichtverhältnisse, während erhöhte Ozonkonzentrationen die Aminemission nicht veränderten. Die GTRAP-AMS-Methode eignet sich bereits für die Messung von Umgebungsluftkonzentrationen an einigen Orten, für die meisten Orte reicht die Nachweisgrenze allerdings noch nicht aus. Die Technik könnte bereits zur Echtzeitkontrolle industrieller Abgasemissionen eingesetzt werden.

Compliance- und Lebensqualitätsmessung bei Patienten vor einer Nieren- oder Lebertransplantation

Die Arzneimittelcompliance hat eine hohe Vorhersagekraft für den Ausgang einer Organtransplantation. Allerdings wurden soweit keine Studien zur Arzneimittelcompliance mittels eletronischen Compliancemessung bei Dialyse- und Leberzirrhosepatienten durchgeführt. Das primäre Ziel dieser Studie war die Arzneimittelcompliance dieser beiden Patientenkollektive zu evaluieren und als sekundäres Ziel wurden die Einflussfaktoren von Non-Compliance untersucht. rnLeberzirrhosepatinten, die Propranolol und Dialysepatienten, die Phosphatbinder, jeweils 3 x tgl. einnahmen, konnten in der Studie teilnehmen. Die Arzneimittelcompliance wurde mittels MEMSTM über einen Zeitraum von jeweils 6 Monaten bestimmt. Des Weiteren wurde nach Einflussfaktoren wie die demopraphischen Daten, Depression, Lebensqualität und der Gesundheitszustand, bei den Dialysepatienten zusätzlich die Formulierung der Phosphatbinder und die Anzahl evaluiert. Zwischen den organinsuffizienten Patientenkollektiven war ein signifikanter Unterschied in der Dosing Compliancerate auszumachen (p<0,023). Die mittlere DC Rate war bei 61%±6% für Leberzirrhosepatienten im Vergleich zu 43%±5% in Dialysepatienten. Nur 10 Leberzirrhosepatienten (30%) and 6 Dialysepatienten (17%) konnten als compliant eingestuft werden. Je höher die Phosphatbinderdosen waren, umso niedrigere Dosing Complianceraten wurden erzielt. Bei 1,5-3 Tabletten pro Tag betrug die Compliancerate 55%±8% (n=16), bei 4-6 Tabletten pro Tag nur noch 37%±7% (n=15) und bei mehr als 7 Tabletten lediglich 21%±10% (n=5) (p<0,036). Bei den Dialysepatienten war jedoch auffällig, dass die Dosing Compliancerate in Abhängigkeit von der Anzahl der dokumentierten Erkrankungen inkl. Grunderkrankung stieg (Dosing Compliancerate 34%±9% für ≤1 Grunderkrankung, 42%±6% für 1-4 Komorbiditäten, 83%±3% für ≥5 Komorbiditäten; p<0,036).Das geringe Patientenwissen über die Arzneimittel und die Erkrankung und die niedrige Compliancerate bedürfen weitere Untersuchungen um die Aspekte zu verbessern. Diese Studie zeigte das eine pharmazeutische Betreuung schon vor einer Transplantation benötigt wird. Aber eine pharmazeutische Betreuung ist sehr kosten- und zeitintensiv. Vielleicht müssen neue Modelle der pharmazeutische Betreuung untersucht werden oder non-compliante Patienten müssen noch besser identifiziert werden für eine selektive pharmazeutische Betreuung.

Chemische und physikalische Charakterisierung von Aerosolpartikeln aus besonderen anthropogenen Emissionsquellen : ein integrativer Ansatz mittels online (HR-ToF-AMS)- und komplementärer offline (ATR-FTIR-Spektroskopie)-Analytik

Die Gesundheitseffekte von Aerosolpartikeln werden stark von ihren chemischen und physikalischen Eigenschaften und somit den jeweiligen Bildungsprozessen und Quellencharakteristika beeinflusst. Während die Hauptquellen der anthropogenen Partikelemissionen gut untersucht sind, stellen die spezifischen Emissionsmuster zahlreicher kleiner Aerosolquellen, welche lokal und temporär zu einer signifikanten Verschlechterung der Luftqualität beitragen können, ein Forschungsdesiderat dar.rnIn der vorliegenden Arbeit werden in kombinierten Labor- und Feldmessungen durch ein integratives Analysekonzept mittels online (HR-ToF-AMS ) und filterbasierter offline (ATR-FTIR-Spektroskopie ) Messverfahren die weitgehend unbekannten physikalischen und chemischen Eigenschaften der Emissionen besonderer anthropogener Aerosolquellen untersucht. Neben einem Fußballstadion als komplexe Mischung verschiedener Aerosolquellen wie Frittieren und Grillen, Zigarettenrauchen und Pyrotechnik werden die Emissionen durch Feuerwerkskörper, landwirtschaftliche Intensivtierhaltung (Legehennen), Tief- und Straßenbauarbeiten sowie abwasserbürtige Aerosolpartikel in die Studie mit eingebunden. Die primären Partikelemissionen der untersuchten Quellen sind vorrangig durch kleine Partikelgrößen (dp < 1 µm) und somit eine hohe Lungengängigkeit gekennzeichnet. Dagegen zeigen die Aerosolpartikel im Stall der landwirtschaftlichen Intensivtierhaltung sowie die Emissionen durch die Tiefbauarbeiten einen hohen Masseanteil von Partikeln dp > 1 µm. Der Fokus der Untersuchung liegt auf der chemischen Charakterisierung der organischen Partikelbestandteile, welche für viele Quellen die NR-PM1-Emissionen dominieren. Dabei zeigen sich wichtige quellenspezifische Unterschiede in der Zusammensetzung der organischen Aerosolfraktion. Die beim Abbrand von pyrotechnischen Gegenständen freigesetzten sowie die abwasserbürtigen Aerosolpartikel enthalten dagegen hohe relative Gehalte anorganischer Substanzen. Auch können in einigen spezifischen Emissionen Metallverbindungen in den AMS-Massenspektren nachgewiesen werden. Über die Charakterisierung der Emissionsmuster und -dynamiken hinaus werden für einige verschiedenfarbige Rauchpatronen sowie die Emissionen im Stall der Intensivtierhaltung Emissionsfaktoren bestimmt, die zur quantitativen Bilanzierung herangezogen werden können. In einem weiteren Schritt werden anhand der empirischen Daten die analytischen Limitierungen der Aerosolmassenspektrometrie wie die Interferenz organischer Fragmentionen durch (Hydrogen-)Carbonate und mögliche Auswertestrategien zur Überwindung dieser Grenzen vorgestellt und diskutiert.rnEine umfangreiche Methodenentwicklung zur Verbesserung der analytischen Aussagekraft von organischen AMS-Massenspektren zeigt, dass für bestimmte Partikeltypen einzelne Fragmentionen in den AMS-Massenspektren signifikant mit ausgewählten funktionellen Molekülgruppen der FTIR-Absorptionsspektren korrelieren. Bedingt durch ihre fehlende Spezifität ist eine allgemeingültige Interpretation von AMS-Fragmentionen als Marker für verschiedene funktionelle Gruppen nicht zulässig und häufig nur durch die Ergebnisse der komplementären FTIR-Spektroskopie möglich. Des Weiteren wurde die Verdampfung und Ionisation ausgewählter Metallverbindungen im AMS analysiert. Die Arbeit verdeutlicht, dass eine qualitative und quantitative Auswertung dieser Substanzen nicht ohne Weiteres möglich ist. Die Gründe hierfür liegen in einer fehlenden Reproduzierbarkeit des Verdampfungs- und Ionisationsprozesses aufgrund von Matrixeffekten sowie der in Abhängigkeit vorangegangener Analysen (Verdampferhistorie) in der Ionisationskammer und auf dem Verdampfer statt-findenden chemischen Reaktionen.rnDie Erkenntnisse der Arbeit erlauben eine Priorisierung der untersuchten anthropogenen Quellen nach bestimmten Messparametern und stellen für deren Partikelemissionen den Ausgangpunkt einer Risikobewertung von atmosphärischen Folgeprozessen sowie potentiell negativen Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit dar. rn

Blood-CNS barriers in neurodegenerative diseases

The blood-brain barrier (BBB) and the blood-spinal cord barrier (BSCB) separate the brain and the spinal cord from the circulating blood and are important for the maintenance of the CNS homeostasis. They build a physical barrier thereby protecting the CNS from pathogens and toxic agents, and their disruption plays a crucial role in the pathogenesis of several CNS disorders. In this thesis, the blood-CNS-barriers were studied via in vitro models in two case studies for neurodegenerative disorders, in particular Alzheimer’s disease (AD) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The first model evaluates treatment possibilities of AD using nanotechnology-based strategies. Since the toxic amyloid-β42 (Aβ42) peptide plays a crucial role in the pathogenesis of AD, reduced generation or enhanced clearance of Aβ42 peptides are expected to modify the disease course in AD. Therefore, several Aβ42-lowering drugs like flurbiprofen had been tested in clinical trials, but most of them failed due to their low brain penetration. Here, flurbiprofen was embedded in polylactide (PLA) nanoparticles and its transport was examined in an in vitro BBB model. The embedding of flurbiprofen into the nanoparticles disguised its cytotoxic potential and enabled the administration of higher drug concentrations which resulted in a sufficient transport of the drug across an endothelial cell monolayer. These results demonstrate that non-permeable drugs can be transported efficiently via nanoparticles and that these nanotechnology-based strategies are a promising tool to generate novel therapeutic options for AD and other CNS diseases. rnThe focus of the second project was to investigate the impaired integrity of the BSCB in a mouse model for ALS. About 20% of all familial ALS cases are associated with missense mutations or small deletions in the gene that encodes Cu/Zn-superoxide dismutase 1 (SOD1). To date, the molecular mechanisms resulting in ALS are still unknown, but there is evidence that the disruption of the BSCB is one of the primary pathological events. In both familial and sporadic ALS patients, loss of endothelial integrity and endothelial cell damage was observed, and studies with SOD1 transgenic mice demonstrated that the BSCB disruption was found prior to motor neuron degeneration and neurovascular inflammation. Thus, an in vitro model for ALS endothelial cells was generated which exhibited comparable integrity characteristics and tight junction (TJ) protein expression profiles as isolated primary endothelial cells of the BSCB of SOD1 transgenic mice. In this, an alteration of the βcat/AKT/FoxO1 pathway, which regulates the expression of the TJ protein claudin-5, could be observed. These data furthermore indicate that ALS is a neurovascular disease, and understanding of the primary events in ALS pathogenesis will hopefully provide ideas for the development of new therapeutic strategies. rn

Evolutionäre Veränderungen in der Nutzung redox-aktiver Aminosäuren und ihre Ursachen

Gewebe, Zellen und speziell Zellkompartimente unterscheiden sich in ihrer Sauerstoffkonzentration, Stoffwechselrate und in der Konzentration an gebildeten reaktiven Sauerstoffspezies. Um eine mögliche Änderung in der Aminosäurennutzung durch den Einfluss von Sauerstoff und seinen reaktiven Spezies untersuchen zu können wurden, Bereiche bzw. Kompartimente der menschlichen Zelle definiert, die einen Referenzrahmen bildeten und bekannt dafür sind, einen relativ hohen Grad an reaktiven Sauerstoffspezies aufzuweisen. Aus dem Vergleich wurde deutlich, dass vor allem die beiden redox-aktiven und schwefeltragenden Aminosäuren Cystein und Methionin durch eine besondere Verteilung und Nutzung charakterisiert sind. Cystein ist hierbei diejenige Aminosäure mit den deutlichsten Änderungen in den fünf untersuchten Modellen der oxidativen Belastung. In all diesen Modellen war die Nutzung von Cystein deutlich reduziert, wohingegen Methionin in Proteinen des Mitochondriums und der Elektronentransportkette angereichert war. Dieser auf den ersten Blick paradoxe Unterschied zwischen Cystein und Methionin wurde näher untersucht, indem die differenzierte Methioninnutzung in verschiedenen Zellkompartimenten von Homo sapiens charakterisiert wurde.rnDie sehr leicht zu oxidierende Aminosäure Methionin zeigt ein ungewöhnliches Verteilungsmuster in ihrer Nutzungshäufigkeit. Entgegen mancher Erwartung wird Methionin in zellulären Bereichen hoher oxidativer Belastung und starker Radikalproduktion intensiv verwendet. Dieses Verteilungsmuster findet man sowohl im intrazellulären Vergleich, als auch im Vergleich verschiedener Spezies untereinander, was daraufhin deutet, dass es einen lokalen Bedarf an redox-aktiven Aminosäuren gibt, der einen sehr starken Effekt auf die Nutzungshäufigkeit von Methionin ausübt. Eine hohe Stoffwechselrate, die im Allgemeinen mit einer erhöhten Produktion von Oxidantien assoziiert wird, scheint ein maßgeblicher Faktor der Akkumulation von Methionin in Proteinen der Atmungskette zu sein. Die Notwendigkeit, oxidiertes Antioxidans wieder zu reduzieren, findet auch bei Methionin Anwendung, denn zu Methioninsulfoxid oxidiertes Methionin wird durch die Methioninsulfoxidreduktase wieder zu Methionin reduziert. Daher kann die spezifische Akkumulation von Methionin in Proteinen, die verstärkt reaktiven Sauerstoffspezies ausgesetzt sind, als eine systematische Strategie angesehen werden, um andere labile Strukturen vor ungewollter Oxidation zu schützen. rnDa Cystein in allen untersuchten Modellen der oxidativen Belastung und im Besonderen in Membranproteinen der inneren Mitochondrienmembran lebensspannenabhängig depletiert war, wurde dieses Merkmal näher untersucht. Deshalb wurde die Hypothese getestet, ob ein besonderer Redox-Mechanismus der Thiolfunktion für diese selektive Depletion einer im Allgemeinen als harmlos oder antioxidativ geltenden Aminosäure verantwortlich ist. Um den Effekt von Cysteinresten in Membranen nachzustellen, wurden primäre humane Lungenfibroblasten (IMR90) mit diversen Modellsubstanzen behandelt. Geringe Konzentrationen der lipophilen Substanz Dodecanthiol verursachten eine signifikante Toxizität in IMR90-Zellen, die von einer schnellen Zunahme an polyubiquitinierten Proteinen und anderen Indikatoren des proteotoxischen Stresses, wie Sequestosom 1 (P62), HSP70 und HSP90 begleitet wurde. Dieser Effekt konnte spezifisch der Chemie der Thiolfunktion in Membranen zugeordnet werden, da Dodecanol (DOH), Dodecylmethylsulfid (DMS), Butanthiol oder wasserlösliche Thiole weder eine cytotoxische Wirkung noch eine Polyubiquitinierung von Proteinen verursachten. Die Ergebnisse stimmen mit der Hypothese überein, dass Thiole innerhalb von biologischen Membranen als radikalische Kettentransferagentien wirken. Diese Eigenschaft wird in der Polymerchemie durch Nutzung von lipophilen Thiolen in hydrophoben Milieus technisch für die Produktion von Polymeren benutzt. Da die Thiylradikal-spezifische Reaktion von cis-Fettsäuren zu trans-Fettsäuren in 12SH behandelten Zellen verstärkt ablief, kann gefolgert werden, dass 12SH zellulär radikalisiert wurde. In lebenden Organismen kann demnach die Oxidation von Cystein die Schädigung von Membranen beschleunigen und damit Einfallstore für die laterale Radikalisierung von integralen Membranproteinen schaffen, welche möglicherweise der Langlebigkeit abträglich ist, zumindest, wenn sie in der inneren Mitochondrienmembran auftritt.

Optisch detektierte Magnetresonanz an NV-Zentren in Diamant

Die rasante Entwicklung der Computerindustrie durch die stetige Verkleinerung der Transistoren führt immer schneller zum Erreichen der Grenze der Si-Technologie, ab der die Tunnelprozesse in den Transistoren ihre weitere Verkleinerung und Erhöhung ihrer Dichte in den Prozessoren nicht mehr zulassen. Die Zukunft der Computertechnologie liegt in der Verarbeitung der Quanteninformation. Für die Entwicklung von Quantencomputern ist die Detektion und gezielte Manipulation einzelner Spins in Festkörpern von größter Bedeutung. Die Standardmethoden der Spindetektion, wie ESR, erlauben jedoch nur die Detektion von Spinensembles. Die Idee, die das Auslesen von einzelnen Spins ermöglich sollte, besteht darin, die Manipulation getrennt von der Detektion auszuführen.rn Bei dem NV−-Zentrum handelt es sich um eine spezielle Gitterfehlstelle im Diamant, die sich als einen atomaren, optisch auslesbaren Magnetfeldsensor benutzen lässt. Durch die Messung seiner Fluoreszenz sollte es möglich sein die Manipulation anderer, optisch nicht detektierbaren, “Dunkelspins“ in unmittelbarer Nähe des NV-Zentrums mittels der Spin-Spin-Kopplung zu detektieren. Das vorgeschlagene Modell des Quantencomputers basiert auf dem in SWCNT eingeschlossenen N@C60.Die Peapods, wie die Einheiten aus den in Kohlenstoffnanoröhre gepackten Fullerenen mit eingefangenem Stickstoff genannt werden, sollen die Grundlage für die Recheneinheiten eines wahren skalierbaren Quantencomputers bilden. Die in ihnen mit dem Stickstoff-Elektronenspin durchgeführten Rechnungen sollen mit den oberflächennahen NV-Zentren (von Diamantplatten), über denen sie positioniert sein sollen, optisch ausgelesen werden.rnrnDie vorliegende Arbeit hatte das primäre Ziel, die Kopplung der oberflächennahen NV-Einzelzentren an die optisch nicht detektierbaren Spins der Radikal-Moleküle auf der Diamantoberfläche mittels der ODMR-Kopplungsexperimente optisch zu detektieren und damit entscheidende Schritte auf dem Wege der Realisierung eines Quantenregisters zu tun.rn Es wurde ein sich im Entwicklungsstadium befindende ODMR-Setup wieder aufgebaut und seine bisherige Funktionsweise wurde an kommerziellen NV-Zentrum-reichen Nanodiamanten verifiziert. Im nächsten Schritt wurde die Effektivität und Weise der Messung an die Detektion und Manipulation der oberflächennah (< 7 nm Tiefe) implantieren NV-Einzelzenten in Diamantplatten angepasst.Ein sehr großer Teil der Arbeit, der hier nur bedingt beschrieben werden kann, bestand aus derrnAnpassung der existierenden Steuersoftware an die Problematik der praktischen Messung. Anschließend wurde die korrekte Funktion aller implementierten Pulssequenzen und anderer Software-Verbesserungen durch die Messung an oberflächennah implantierten NV-Einzelzentren verifiziert. Auch wurde der Messplatz um die zur Messung der Doppelresonanz notwendigen Komponenten wie einen steuerbaren Elektromagneten und RF-Signalquelle erweitert. Unter der Berücksichtigung der thermischen Stabilität von N@C60 wurde für zukünftige Experimente auch ein optischer Kryostat geplant, gebaut, in das Setup integriert und charakterisiert.rn Die Spin-Spin-Kopplungsexperimente wurden mit dem sauerstoffstabilen Galvinoxyl-Radikalals einem Modell-System für Kopplung durchgeführt. Dabei wurde über die Kopplung mit einem NVZentrum das RF-Spektrum des gekoppelten Radikal-Spins beobachtet. Auch konnte von dem gekoppelten Spin eine Rabi-Nutation aufgenommen werden.rn Es wurden auch weitere Aspekte der Peapod Messung und Oberflächenimplantation betrachtet.Es wurde untersucht, ob sich die NV-Detektion durch die SWCNTs, Peapods oder Fullerene stören lässt. Es zeigte sich, dass die Komponenten des geplanten Quantencomputers, bis auf die C60-Cluster, für eine ODMR-Messanordnung nicht detektierbar sind und die NV-Messung nicht stören werden. Es wurde auch betrachtet, welche Arten von kommerziellen Diamantplatten für die Oberflächenimplantation geeignet sind, für die Kopplungsmessungen geeignete Dichte der implantierten NV-Zentren abgeschätzt und eine Implantation mit abgeschätzter Dichte betrachtet.

Funktionelle Analyse der onkologisch relevanten Protease Threonin-Aspartase 1

Krebs stellt eine der häufigsten Todesursachen in Europa dar. Grundlage für eine langfristige Verbesserung des Behandlungserfolgs ist ein molekulares Verständnis der Mechanismen, welche zur Krankheitsentstehung beitragen. In diesem Zusammenhang spielen Proteasen nicht nur eine wichtige Rolle, sondern stellen auch bei vielerlei Erkrankungen bereits anerkannte Zielstrukturen derzeitiger Behandlungsstrategien dar. Die Protease Threonin Aspartase 1 (Taspase1) spielt eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung von Mixed Lineage Leukemia (MLL)-Fusionsproteinen und somit bei der Entstehung aggressiver Leukämien. Aktuelle Arbeiten unterstreichen zudem die onkologische Relevanz von Taspase1 auch für solide Tumore. Die Kenntnisse über die molekularen Mechanismen und Signalnetzwerke, welche für die (patho)biologischen Funktionen von Taspase1 verantwortlich sind, stellen sich allerdings noch immer als bruchstückhaft dar. Um diese bestehenden Wissenslücken zu schließen, sollten im Rahmen der Arbeit neue Strategien zur Inhibition von Taspase1 erarbeitet und bewertet werden. Zusätzlich sollten neue Einsichten in evolutionären Funktionsmechanismen sowie eine weitergehende Feinregulation von Taspase1 erlangt werden. Zum einen erlaubte die Etablierung und Anwendung eines zellbasierten Taspase1-Testsystem, chemische Verbindungen auf deren inhibitorische Aktivität zu testen. Überraschenderweise belegten solch zelluläre Analysen in Kombination mit in silico-Modellierungen eindeutig, dass ein in der Literatur postulierter Inhibitor in lebenden Tumorzellen keine spezifische Wirksamkeit gegenüber Taspase1 zeigte. Als mögliche Alternative wurden darüber hinaus Ansätze zur genetischen Inhibition evaluiert. Obwohl publizierte Studien Taspase1 als ααββ-Heterodimer beschreiben, konnte durch Überexpression katalytisch inaktiver Mutanten kein trans-dominant negativer Effekt und damit auch keine Inhibition des wildtypischen Enzyms beobachtet werden. Weiterführende zellbiologische und biochemische Analysen belegten erstmalig, dass Taspase1 in lebenden Zellen in der Tat hauptsächlich als Monomer und nicht als Dimer vorliegt. Die Identifizierung evolutionär konservierter bzw. divergenter Funktionsmechanismen lieferte bereits in der Vergangenheit wichtige Hinweise zur Inhibition verschiedenster krebsrelevanter Proteine. Da in Drosophila melanogaster die Existenz und funktionelle Konservierung eines Taspase1-Homologs postuliert wurde, wurde in einem weiteren Teil der vorliegenden Arbeit die evolutionäre Entwicklung der Drosophila Taspase1 (dTaspase1) untersucht. Obwohl Taspase1 als eine evolutionär stark konservierte Protease gilt, konnten wichtige Unterschiede zwischen beiden Orthologen festgestellt werden. Neben einem konservierten autokatalytischen Aktivierungsmechanismus besitzt dTaspase1 verglichen mit dem humanen Enzym eine flexiblere Substraterkennungs-sequenz, was zu einer Vergrößerung des Drosophila-spezifischen Degradoms führt. Diese Ergebnisse zeigen des Weiteren, dass zur Definition und Vorhersage des Degradoms nicht nur proteomische sondern auch zellbiologische und bioinformatische Untersuchungen geeignet und notwendig sind. Interessanterweise ist die differentielle Regulation der dTaspase1-Aktivität zudem auf eine veränderte intrazelluläre Lokalisation zurückzuführen. Das Fehlen von in Vertebraten hochkonservierten aktiven Kernimport- und nukleolären Lokalisationssignalen erklärt, weshalb dTaspase1 weniger effizient nukleäre Substrate prozessiert. Somit scheint die für die humane Taspase1 beschriebene Regulation von Lokalisation und Aktivität über eine Importin-α/NPM1-Achse erst im Laufe der Entwicklung der Vertebraten entstanden zu sein. Es konnte also ein bislang unbekanntes evolutionäres Prinzip identifiziert werden, über welches eine Protease einen Transport- bzw. Lokalisations-basierten Mechanismus zur Feinregulation ihrer Aktivität „von der Fliege zum Menschen“ nutzt. Eine weitere Möglichkeit zur dynamischen Funktionsmodulation bieten post-translationale Modifikationen (PTMs) der Proteinsequenz, zu welcher Phosphorylierung und Acetylierung zählen. Interessanterweise konnte für die humane Taspase1 über den Einsatz unabhängiger Methoden einschließlich massenspektrometrischer Analysen eine Acetylierung durch verschiedene Histon-Acetyltransferasen (HATs) nachgewiesen werden. Diese Modifikation erfolgt reversibel, wobei vor allem die Histon-Deacetylase HDAC1 durch Interaktion mit Taspase1 die Deacetylierung der Protease katalysiert. Während Taspase1 in ihrer aktiven Konformation acetyliert vorliegt, kommt es nach Deacetylierung zu einer Reduktion ihrer enzymatischen Aktivität. Somit scheint die Modulation der Taspase1-Aktivität nicht allein über intra-proteolytische Autoaktivierung, Transport- und Interaktionsmechanismen, sondern zudem durch post-translationale Modifikationen gesteuert zu werden. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit entscheidende neue Einblicke in die (patho)biologische Funktion und Feinregulation der Taspase1 gewonnen werden. Diese Ergebnisse stellen nicht nur einen wichtigen Schritt in Richtung eines verbesserten Verständnis der „Taspase1-Biologie“, sondern auch zur erfolgreichen Inhibition und Bewertung der krebsrelevanten Funktion dieser Protease dar.

Three-dimensional electron microscopy of myriapod hemocyanin, planorbid snail acetylcholine-binding protein and cyanobacterial Vipp1

Three-dimensional electron microscopy (3-D EM) provides a framework for the analysis of large protein quaternary structures. The advantage over the generally higher resolving meth- od of X-ray crystallography is the embedding of the proteins in their physiological environ- ment. However, results of the two methods can be combined to obtain superior structural information. In this work, three different protein types – (i) Myriapod hemocyanin, (ii) vesi- cle-inducing protein in plastids 1 (Vipp1) and (iii) acetylcholine-binding protein (AChBP) – were structurally analyzed by 2-D and 3-D EM and, where possible, functionally interpreted.rnMyriapod hemocyanins have been previously shown to be 6x6-meric assemblies that, in case of Scutigera coleoptrata hemocyanin (ScoHc), show two 3x6-mer planes whith a stag- gering angle of approximately 60°. Here, previously observed structural differences between oxy- and deoxy-ScoHc could be substantiated. A 4° rotation between hexamers of two dif- ferent 3x6-mer planes was measured, which originates at the most central inter-hexamer in- terface. Further information about allosteric behaviour in myriapod hemocyanin was gained by analyzing Polydesmus angustus hemocyanin (PanHc), which shows a stable 3x6-mer and divergent histidine patterns in the inter-hexamer interfaces when compared to ScoHc. Both findings would conclusively explain the very different oxygen binding properties of chilopod and diplopod hemocyanin.rnVipp1 is a protein found in cyanobacteria and higher plants which is essential for thyla- koid membrane function and forms highly variable ring-shaped structures. In the course of this study, the first 3-D analysis of Vipp1 was conducted and yielded reconstructions of six differently sized Vipp1 rings from negatively stained images at resolutions between 20 to 30 Å. Furthermore, mutational analyses identified specific N-terminal amino acids that are essential for ring formation. On the basis of these analyses and previously published results, a hypothetical model of the Vipp1 tertiary and quaternary structure was generated.rnAChBP is a water-soluble protein in the hemolymph of mollusks. It is a structural and functional homologue of the ligand-binding domain of nicotinic acetylcholine receptors. For the freshwater snail Biomphalaria glabrata, we previously described two types of AChBP (BgAChBP1 and BgAChBP2). In this work, a 6 Å 3-D reconstruction of native BgAChBP is presented, which shows a dodecahedral assembly that is unprecedented for an AChBP. Single particle analysis of recombinantely expressed BgAChBP types led to preliminary results show- ing a dodecahedral assembly of BgAChBP1 and a dipentameric assembly of BgAChBP2. This indicates divergent biological functions of the two types.