Interações moleculares no mecanismo de ação da galectina-4 humana

A galectina-4 humana (HGal-4), pertencente à família das galectinas, possui dois domínios de reconhecimento de carboidratos (CRDs) com alta afinidade para β-galactosídeos e se encontra amplamente distribuída em células normais e neoplásicas de diferentes organismos. Suas funções snglobam uma grande variedade de eventos celulares, tais como processos inflamatórios, neoplásicos, progressão tumoral e metástase. Entretanto, muitas perguntas sobre suas interações com diferentes carboidratos, a especificidade destas interações e o papel específico das galectinas permanecem ainda sem resposta. No presente trabalho, propomos a investigação das interações galectina-glicano da galectina-4 humana e de seus domínios CRDs independentes (CRD-I e CRD-II) através de um conjunto de métodos biofísicos. Através do método de dicroísmo circular (CD), usando várias regiões espectrais, e fluorescência fomos capazes de entender mudanças ocorrentes na estrutura secundária e terciária das protéinas quando da interação com lactose/sacarose. Estes dados, juntamente com testes de hemaglutinação, mostraram que a glectina-4 e os CRDs respondem de forma distinta à ligação com açúcar. Por diferentes técnicas (fluorescência, ITC e MST) determinamos as constantes de dissociação para os domínios CRDs (Kd ~0,5 mM) e para HGal-4 e, de forma qualitativa, os valores obtidos indicaram possíveis estados oligoméricos dessas proteínas. A investigação da interação proteína-membrana da HGal-4 foi feita, primeiramente, com miméticos de membranas e monitorada pela técnica de RPE em crescente complexidade de composição de tais miméticos, indo desde composições mais simples, passando por lipid rafts na presença de diferentes glicolipídeos (GM1, LPS) e chegando-se à interação com células tumorais (U87MG, T98G e HT-29). Tais experimentos mostraram que galectina-4 reconhece e se liga naqueles modelos onde existem glicanos complexos na superfície. Investigamos também a participação de HGal-4 endógena e exógena no tratamento quimioterápico de células tumorais e verificamos um papel importante de HGal-4 para células HT-29. Finalizando esta tese, apresentamos o trabalho realizado em um ano de estágio na University of Oxford, durante o qual, investigamos a estrutura da região C-terminal de um receptor da família GPCR, qual seja o receptor de neurotensina NTS1. Aqui, mais uma vez, foi empregada a técnica de RPE que aliada à produção/marcação de mutantes do receptor, permitiu determinar que a hélice H8 se estabiliza quando em proteolipossomos.

Análise funcional das proteínas HrcA, GroES/GroEL e DnaK/DnaJ em Caulobacter crescentus

O operon groESL de C. crescentus apresenta dupla regulação. A indução deste operon por choque térmico é dependente do fator sigma de choque térmico σ32. A temperaturas fisiológicas, a expressão de groESL apresenta regulação temporal durante o ciclo celular da bactéria e o controle envolve a proteína repressora HrcA e o elemento CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin expression). Para estudar a atividade da proteína repressora in vitro, produzimos e purificamos de E. coli a HrcA de C. creseentus contendo uma cauda de histidinas e a ligação especifica ao elemento CIRCE foi analisada em ensaios de migração retardada em gel de poliacrilamida (EMRGP). A quantidade de DNA retardada pela ligação a HrcA aumentou significativamente na presença de GroES/GroEL, sugerindo que estas proteínas modulam a atividade de HrcA. Corroboração desta modulação foi obtida analisando fusões de transcrição da região regulatória de groESL com o gene lacZ, em células de C. crescentus produzindo diferentes quantidades de GroES/EL. HrcA contendo as substituições Pro81 AJa e Arg87Ala, aminoácidos que se localizam no domínio putativo de ligação ao DNA da proteína, mostraram ser deficientes na ligação a CIRCE, tanto in vitro como in vivo. Em adição, HrcA Ser56Ala expressa na mesma célula juntamente com a proteína selvagem produziu um fenótipo dominante-negativo, indicando que a HrcA de C. crescentus liga-se a CIRCE como um oligômero, provavelmente um dímero. As tentativas de obtenção de mutantes nulos para os genes groESL ou dnaKJ falharam, indicando que as proteínas GroES/GroEL e DnaK/DnaJ são essenciais em C. crescentus, mesmo a temperaturas normais. Foram então construídas no laboratório as linhagens mutantes condicionais SG300 e SG400 de C. crescentus, onde a expressão de groESL e de dnaKJ, respectivamente, está sob controle de um promotor induzido por xilose (PxyIX). Estas linhagens foram caracterizadas quanto á sua morfologia em condições permissivas ou restritivas, assim como quanto à capacidade de sobrevivência frente a vários tipos de estresse. As células da linhagem SG300, exauridas de GroES/GroEL, são resistentes ao choque térmico a 42°C e são capazes de adquirir alguma termotolerância. Entretanto, estas células são sensíveis aos estresses oxidativo, salino e osmótico. As células da linhagem SG400, exauridas de DnaKlJ, são sensíveis ao choque térmico, à exposição a etanol e ao congelamento, e são incapazes de adquirir termotolerância. Além disso, tanto as células exauridas de GroES/GroEL quanto as exauridas de DnaK/DnaJ apresentam problemas na sua morfologia. As células de SG300 exauridas de GroES/GroEL formam filamentos longos que possuem constrições fundas e irregulares. As células de SG400 exauridas de DnaK/DnaJ são apenas um pouco mais alongadas que as células pré-divisionais selvagens e a maioria das células não possuem septo. Estas observações indicam bloqueio da divisão celular, que deve ocorrer em diferentes estágios em cada linhagem.

Análise do papel da via miR156/SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like (SPL) na organogênese in vitro a partir de raízes de Arabidopsis thaliana

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs endógenos não codantes de 21-24 nucleotídeos (nt) que regulam a expressão gênica de genes-alvos. Eles estão envolvidos em diversos aspectos de desenvolvimento da planta, tanto na parte aérea, quanto no sistema radicular. Entre os miRNAs, o miRNA156 (miR156) regula a família de fatores de transcrição SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like (SPL) afetando diferentes processos do desenvolvimento vegetal. Estudos recentes mostram que a via gênica miR156/SPL apresenta efeito positivo tanto no aumento da formação de raízes laterais, quanto no aumento de regeneração de brotos in vitro a partir de folhas e hipocótilos em Arabidopsis thaliana. Devido ao fato de que a origem da formação de raiz lateral e a regeneração in vitro de brotos a partir de raiz principal compartilham semelhanças anatômicas e moleculares, avaliou-se no presente estudo se a via miR156/SPL, da mesma forma que a partir de explantes aéreos, também é capaz de influenciar na regeneração de brotos in vitro a partir de explantes radiculares. Para tanto foram comparados taxa de regeneração, padrão de distribuição de auxina e citocinina, análises histológicas e histoquímicas das estruturas regeneradas em plantas com via miR156/SPL alterada, incluindo planta mutante hyl1, na qual a produção desse miRNA é severamente reduzida. Além disso, foi avaliado o padrão de expressão do miR156 e específicos genes SPL durante a regeneração de brotos in vitro a partir da raiz principal de Arabidopsis thaliana. No presente trabalho observou-se que a alteração da via gênica miR156/SPL é capaz de modular a capacidade de regeneração de brotos in vitro a partir de raiz principal de Arabidopsis thaliana e a distribuição de auxina e citocinina presente nas células e tecidos envolvidos no processo de regeneração. Plantas superexpressando o miR156 apresentaram redução no número de brotos regenerados, além de ter o plastochron reduzido quando comparado com plantas controle. Adicionalmente, plantas contento o gene SPL9 resistente à clivagem pelo miR156 (rSPL9) apresentaram severa redução na quantidade de brotos, além de terem o plastochron alongado. Interessantemente, plantas mutantes hyl1-2 e plantas rSPL10 não apresentaram regeneração de brotos ao longo da raiz principal, mas sim intensa formação de raízes laterais e protuberâncias, respectivamente, tendo essa última apresentado indícios de diferenciação celular precoce. Tomados em conjunto os dados sugerem que o miR156 apresenta importante papel no controle do processo de regeneração de brotos in vitro. Entretanto, esse efeito é mais complexo em regeneração in vitro a partir de raízes do que a partir de cotilédones ou hipocótilos.

Estudo da função de keaA no controle do crescimento, desenvolvimento e resposta a estresses em Dictyostelium discoideum

O ciclo de vida de Dictyostelium discoideum é composto de duas fases independentes. Durante o crescimento vegetativo, as amebas crescem isoladas até que a fonte de nutrientes seja esgotada. A carência nutricional induz sua entrada num processo de desenvolvimento, que inclui a parada do crescimento, a agregação das células e a formação de um organismo multicelular onde as células se diferenciam em esporos que sobrevivem as condições desfavoráveis. A proteína quinase YakA é requerida para a transição entre o crescimento e o desenvolvimento. YakA regula os níveis da PKA. Mutantes yakA- apresentam o crescimento acelerado, são deficientes no processo de agregação e são hiper-sensíveis a estresse oxidativo e nitrosoativo. Uma mutação em um segundo sítio em keaA, suprime a morte induzida por SNP (um gerador de óxido nítrico) no mutante yakA-. O papel de keaA foi determinado em resposta a estresse oxidativo, nitrosoativo e carênica nutricional. O gene keaA é necessário para o crescimento e desenvolvimento. Uma mutação em keaA confere resistência a estresse nitrosoativoloxidativo confirmando que uma mutação em keaA confere resistência a estresse. Um segundo supressor da morte induzida por SNP no mutante yakA- foi isolado pela mesma técnica de REMI e identificado como pkaC um regulador da resposta a estresse. YakA e PKA integradam a resposta a vários estresse em Dictyostelium. Os resultados indicam que a yakA regula a parada do ciclo celular em resposta a estresses através da modulação de keaA. keaA regula, por sua vez, a expressão da pkaC, um regulador chave da produção de cAMP e do processo de desenvolvimento. A interação gênica entre estes elementos é complexa e deve ser ajustada para permitir que as células sobrevivam a mudanças ambientais encontradas durante o seu ciclo de vida.

CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE ZEB1 EN CÉLULAS EN DIFERENCIACIÓN Y METASTÁSICAS

IDENTIFICACIÓN ZEB1 (Zinc Finger E-box Binding Homeobox) es un factor de transcripción funcionalmente asociado con la diferenciación de células como miocitos, neuronas, células de sostén y linfocitos T, además de estar involucrado en la Transición Epitelial-Mesenquimatosa (EMT) de los tumores sólidos epiteliales. Aún no se ha revelado en profundidad la participación de ZEB1 en los procesos de proliferación y diferenciación en los que participa. Estamos interesados en los mecanismos de regulación de ZEB1 y los factores que intervienen en los procesos de diferenciación y transformación celular. HIPÓTESIS 1. Las vías de señalamiento regulan el estado de fosforilación y la función de ZEB1 en la célula normal, el cual se desregularía en la célula neoplásica llevando a cambios en la función normal de ZEB1 y consecuentemente a metástasis. 2. IGF-1 es la señal que, en asociación con el supresor de tumores CCN6, juega un rol causal en la regulación de ZEB1 y esto a su vez en la metástasis del cáncer de mama. OBJETIVO GENERAL: establecer el rol funcional de ZEB1, su interrelación con otros factores y su regulación en los procesos de diferenciación y transformación celular. OBJETIVOS ESPECIFICOS (incluye Materiales y Métodos) 1. Estudiar la participación de vías de señalización sobre la función biológica de ZEB1 en células normales y neoplásicas. Analizaremos la participación de señales intracelulares en la fosforilación de ZEB1 por experimentos de ganancia/pérdida de función de la vía (por uso de inhibidores farmacologicos, mutantes silenciadoras y siRNAs), lo cual sera evaluado en EMSAs, ChIP, transfecciones, inmunofluoresc, etc. 2. Estudiar el rol de IGF-1 y CCN6 sobre la expresión y el estado de fosforilación de ZEB1 en tumores mamarios benignos, no invasivos e invasivos y metastatizantes. A) Se estudiará la expresión y localización subcelular de ZEB1 en líneas celulares de cáncer mamario y en xenotransplantes de ratón con variada expresión de CCN6. B) Investigar la relevancia de la fosforilación de ZEB1 mediada por IGF-1 en el EMT por experimentos con ganancia/pérdida de función. RESULTADOS ESPERADOS Esperamos poder delinear la/s vía/s de señalización intracelular que fosforilan ZEB1 y así conocer sobre la regulación del mismo. Podremos establecer algunas bases para entender la biología básica del cáncer de mama e identificar blancos terapéuticos. IMPORTANCIA Un amplio conocimiento de los factores de transcripción y sus vías de señalamiento es necesario para el desarrollo tanto de pruebas diagnósticas como para la identificación de nuevos blancos terapéuticos para neoplasias. De modo que resulta de gran importancia clínica determinar el rol de ZEB1, sus proteínas y vías reguladoras en el proceso de oncogénesis. El desarrollo del proyecto prevé la formación de dos tesistas. Se continuaran colaboraciones con dos grupos extranjeros y se iniciara una tercera.

Contribution différentielle de Neuroligine‐1 et d’EphA4 à la régulation du sommeil

Le sommeil est un besoin vital et le bon fonctionnement de l’organisme dépend de la quantité et de la qualité du sommeil. Le sommeil est régulé par deux processus : un processus circadien qui dépend de l’activité des noyaux suprachiasmatiques de l’hypothalamus et qui régule le moment durant lequel nous allons dormir, et un processus homéostatique qui dépend de l’activité neuronale et se reflète dans l’intensité du sommeil. En effet, le sommeil dépend de l’éveil qui le précède et plus l’éveil dure longtemps, plus le sommeil est profond tel que mesuré par des marqueurs électroencéphalographiques (EEG). Des études ont montré que le bon fonctionnement de ces deux processus régulateurs du sommeil dépend de la plasticité synaptique. Ainsi, les éléments synaptiques régulant la communication et la force synaptique sont d’importants candidats pour agir sur la physiologie de la régulation du sommeil. Les molécules d’adhésion cellulaire sont des acteurs clés dans les mécanismes de plasticité synaptique. Elles régulent l’activité et la maturation des synapses. Des études ont montré que leur absence engendre des conséquences similaires au manque de sommeil. Le but de ce projet de thèse est d’explorer l’effet de l’absence de deux familles de molécule d’adhésion cellulaire, les neuroligines et la famille des récepteur Eph et leur ligand les éphrines dans les processus régulateurs du sommeil. Notre hypothèse est que l’absence d’un des membres de ces deux familles de molécule affecte les mécanismes impliqués dans le processus homéostatique de régulation du sommeil. Afin de répondre à notre hypothèse, nous avons étudié d’une part l’activité EEG chez des souris mutantes n’exprimant pas Neuroligine‐1 (Nlgn1) ou le récepteur EphA4 en condition normale et après une privation de sommeil. D’autre part, nous avons mesuré les changements moléculaires ayant lieu dans ces deux modèles après privation de sommeil. Au niveau de l’activité EEG, nos résultats montrent que l’absence de Nlgn1 augmente la densité des ondes lentes en condition normale et augment l’amplitude et la pente des ondes lentes après privation de sommeil. Nlgn1 est nécessaire au fonctionnement normal de la synchronie corticale, notamment après une privation de sommeil, lui attribuant ainsi un rôle clé dans l’homéostasie du sommeil. Concernant le récepteur EphA4, son absence affecte la durée du sommeil paradoxal ainsi que l’activité sigma qui dépendent du processus circadien. Nos résultats suggèrent donc que ce récepteur est un élément important dans la régulation circadienne du sommeil. Les changements transcriptionnels en réponse à la privation de sommeil des souris n’exprimant pas Nlgn1 et EphA4 ne sont pas différents des souris sauvages. Toutefois, nous avons montré que la privation de sommeil affectait la distribution des marques épigénétiques sur le génome, tels que la méthylation et l’hydroxyméthylation, et que l’expression des molécules régulant ces changements est modifiée chez les souris mutantes pour le récepteur EphA4. Nos observations mettent en évidence que les molécules d’adhésion cellulaire, Nlgn1 et le récepteur EphA4, possèdent un rôle important dans les processus homéostatique et circadien du sommeil et contribuent de manière différente à la régulation du sommeil.

The role of protein convertases in bigdynorphin and dynorphin A metabolic pathway

Les dynorphines sont des neuropeptides importants avec un rôle central dans la nociception et l’atténuation de la douleur. De nombreux mécanismes régulent les concentrations de dynorphine endogènes, y compris la protéolyse. Les Proprotéines convertases (PC) sont largement exprimées dans le système nerveux central et clivent spécifiquement le C-terminale de couple acides aminés basiques, ou un résidu basique unique. Le contrôle protéolytique des concentrations endogènes de Big Dynorphine (BDyn) et dynorphine A (Dyn A) a un effet important sur la perception de la douleur et le rôle de PC reste à être déterminée. L'objectif de cette étude était de décrypter le rôle de PC1 et PC2 dans le contrôle protéolytique de BDyn et Dyn A avec l'aide de fractions cellulaires de la moelle épinière de type sauvage (WT), PC1 -/+ et PC2 -/+ de souris et par la spectrométrie de masse. Nos résultats démontrent clairement que PC1 et PC2 sont impliquées dans la protéolyse de BDyn et Dyn A avec un rôle plus significatif pour PC1. Le traitement en C-terminal de BDyn génère des fragments peptidiques spécifiques incluant dynorphine 1-19, dynorphine 1-13, dynorphine 1-11 et dynorphine 1-7 et Dyn A génère les fragments dynorphine 1-13, dynorphine 1-11 et dynorphine 1-7. Ils sont tous des fragments de peptides associés à PC1 ou PC2. En plus, la protéolyse de BDyn conduit à la formation de Dyn A et Leu-Enk, deux peptides opioïdes importants. La vitesse de formation des deux est réduite de manière significative dans les fractions cellulaires de la moelle épinière de souris mutantes. En conséquence, l'inhibition même partielle de PC1 ou PC2 peut altérer le système opioïde endogène.

The role of mechanistic target of rapamycin (mTOR) pathway and synaptic protein GABAA-R in cortical GABAergic cell connectivity

Quelque 30 % de la population neuronale du cortex mammalien est composée d’une population très hétérogène d’interneurones GABAergiques. Ces interneurones diffèrent quant à leur morphologie, leur expression génique, leurs propriétés électrophysiologiques et leurs cibles subcellulaires, formant une riche diversité. Après leur naissance dans les éminences ganglioniques, ces cellules migrent vers les différentes couches corticales. Les interneurones GABAergiques corticaux exprimant la parvalbumin (PV), lesquels constituent le sous-type majeur des interneurones GABAergiques, ciblent spécifiquement le soma et les dendrites proximales des neurones principaux et des neurones PV+. Ces interneurones sont nommés cellules à panier (Basket Cells –BCs) en raison de la complexité morphologique de leur axone. La maturation de la connectivité distincte des BCs PV+, caractérisée par une augmentation de la complexité de l’axone et de la densité synaptique, se déroule graduellement chez la souris juvénile. Des travaux précédents ont commencé à élucider les mécanismes contrôlant ce processus de maturation, identifiant des facteurs génétiques, l’activité neuronale ainsi que l’expérience sensorielle. Cette augmentation marquante de la complexité axonale et de la synaptogénèse durant cette phase de maturation suggère la nécessité d’une synthèse de protéines élevée. La voie de signalisation de la cible mécanistique de la rapamycine (Mechanistic Target Of Rapamycin -mTOR) a été impliquée dans le contrôle de plusieurs aspects neurodéveloppementaux en régulant la synthèse de protéines. Des mutations des régulateurs Tsc1 et Tsc2 du complexe mTOR1 causent la sclérose tubéreuse (TSC) chez l’humain. La majorité des patients TSC développent des problèmes neurologiques incluant des crises épileptiques, des retards mentaux et l’autisme. D’études récentes ont investigué le rôle de la dérégulation de la voie de signalisation de mTOR dans les neurones corticaux excitateurs. Toutefois, son rôle dans le développement des interneurones GABAergiques corticaux et la contribution spécifique de ces interneurones GABAergiques altérés dans les manifestations de la maladie demeurent largement inconnus. Ici, nous avons investigué si et comment l’ablation du gène Tsc1 perturbe le développement de la connectivité GABAergique, autant in vitro que in vivo. Pour investiguer le rôle de l’activation de mTORC1 dans le développement d’une BC unique, nous avons délété le gène Tsc1 en transfectant CRE-GFP dirigé par un promoteur spécifique aux BCs dans des cultures organotypiques provenant de souris Tsc1lox. Le knockdown in vitro de Tsc1 a causé une augmentation précoce de la densité des boutons et des embranchements terminaux formés par les BCs mutantes, augmentation renversée par le traitement à la rapamycine. Ces données suggèrent que l’hyperactivation de la voie de signalisation de mTOR affecte le rythme de la maturation des synapses des BCs. Pour investiguer le rôle de mTORC1 dans les interneurones GABAergiques in vivo, nous avons croisé les souris Tsc1lox avec les souris Nkx2.1-Cre et PV-Cre. À P18, les souris Tg(Nkx2.1-Cre);Tsc1flox/flox ont montré une hyperactivation de mTORC1 et une hypertrophie somatique des BCs de même qu’une augmentation de l’expression de PV dans la région périsomatique des neurones pyramidaux. Au contraire, à P45 nous avons découvert une réduction de la densité des punctas périsomatiques PV-gephyrin (un marqueur post-synaptique GABAergique). L’étude de la morphologie des BCs en cultures organotypiques provenant du knock-out conditionnel Nkx2.1-Cre a confirmé l’augmentation initiale du rythme de maturation, lequel s’effondre ensuite aux étapes développementales tardives. De plus, les souris Tg(Nkx2.1Cre);Tsc1flox/flox montrent des déficits dans la mémoire de travail et le comportement social et ce d’une façon dose-dépendante. En somme, ces résultats suggèrent que l’activation contrôlée de mTOR régule le déroulement de la maturation et la maintenance des synapses des BCs. Des dysfonctions de la neurotransmission GABAergique ont été impliquées dans des maladies telles que l’épilepsie et chez certains patients, elles sont associées avec des mutations du récepteur GABAA. De quelle façon ces mutations affectent le processus de maturation des BCs demeuret toutefois inconnu. Pour adresser cette question, nous avons utilisé la stratégie Cre-lox pour déléter le gène GABRA1, codant pour la sous-unité alpha-1 du récepteur GABAA dans une unique BC en culture organotypique. La perte de GABRA1 réduit l’étendue du champ d’innervation des BCs, suggérant que des variations dans les entrées inhibitrices en raison de l’absence de la sous-unité GABAAR α1 peuvent affecter le développement des BCs. La surexpression des sous-unités GABAAR α1 contenant des mutations identifiées chez des patients épileptiques ont montré des effets similaires en termes d’étendue du champ d’innervation des BCs. Pour approfondir, nous avons investigué les effets de ces mutations identifiées chez l’humain dans le développement des épines des neurones pyramidaux, lesquelles sont l’endroit privilégié pour la formation des synapses excitatrices. Somme toute, ces données montrent pour la première fois que différentes mutations de GABRA1 associées à des syndromes épileptiques peuvent affecter les épines dendritiques et la formation des boutons GABAergiques d’une façon mutation-spécifique.

The role of mechanistic target of rapamycin (mTOR) pathway and synaptic protein GABAA-R in cortical GABAergic cell connectivity

Quelque 30 % de la population neuronale du cortex mammalien est composée d’une population très hétérogène d’interneurones GABAergiques. Ces interneurones diffèrent quant à leur morphologie, leur expression génique, leurs propriétés électrophysiologiques et leurs cibles subcellulaires, formant une riche diversité. Après leur naissance dans les éminences ganglioniques, ces cellules migrent vers les différentes couches corticales. Les interneurones GABAergiques corticaux exprimant la parvalbumin (PV), lesquels constituent le sous-type majeur des interneurones GABAergiques, ciblent spécifiquement le soma et les dendrites proximales des neurones principaux et des neurones PV+. Ces interneurones sont nommés cellules à panier (Basket Cells –BCs) en raison de la complexité morphologique de leur axone. La maturation de la connectivité distincte des BCs PV+, caractérisée par une augmentation de la complexité de l’axone et de la densité synaptique, se déroule graduellement chez la souris juvénile. Des travaux précédents ont commencé à élucider les mécanismes contrôlant ce processus de maturation, identifiant des facteurs génétiques, l’activité neuronale ainsi que l’expérience sensorielle. Cette augmentation marquante de la complexité axonale et de la synaptogénèse durant cette phase de maturation suggère la nécessité d’une synthèse de protéines élevée. La voie de signalisation de la cible mécanistique de la rapamycine (Mechanistic Target Of Rapamycin -mTOR) a été impliquée dans le contrôle de plusieurs aspects neurodéveloppementaux en régulant la synthèse de protéines. Des mutations des régulateurs Tsc1 et Tsc2 du complexe mTOR1 causent la sclérose tubéreuse (TSC) chez l’humain. La majorité des patients TSC développent des problèmes neurologiques incluant des crises épileptiques, des retards mentaux et l’autisme. D’études récentes ont investigué le rôle de la dérégulation de la voie de signalisation de mTOR dans les neurones corticaux excitateurs. Toutefois, son rôle dans le développement des interneurones GABAergiques corticaux et la contribution spécifique de ces interneurones GABAergiques altérés dans les manifestations de la maladie demeurent largement inconnus. Ici, nous avons investigué si et comment l’ablation du gène Tsc1 perturbe le développement de la connectivité GABAergique, autant in vitro que in vivo. Pour investiguer le rôle de l’activation de mTORC1 dans le développement d’une BC unique, nous avons délété le gène Tsc1 en transfectant CRE-GFP dirigé par un promoteur spécifique aux BCs dans des cultures organotypiques provenant de souris Tsc1lox. Le knockdown in vitro de Tsc1 a causé une augmentation précoce de la densité des boutons et des embranchements terminaux formés par les BCs mutantes, augmentation renversée par le traitement à la rapamycine. Ces données suggèrent que l’hyperactivation de la voie de signalisation de mTOR affecte le rythme de la maturation des synapses des BCs. Pour investiguer le rôle de mTORC1 dans les interneurones GABAergiques in vivo, nous avons croisé les souris Tsc1lox avec les souris Nkx2.1-Cre et PV-Cre. À P18, les souris Tg(Nkx2.1-Cre);Tsc1flox/flox ont montré une hyperactivation de mTORC1 et une hypertrophie somatique des BCs de même qu’une augmentation de l’expression de PV dans la région périsomatique des neurones pyramidaux. Au contraire, à P45 nous avons découvert une réduction de la densité des punctas périsomatiques PV-gephyrin (un marqueur post-synaptique GABAergique). L’étude de la morphologie des BCs en cultures organotypiques provenant du knock-out conditionnel Nkx2.1-Cre a confirmé l’augmentation initiale du rythme de maturation, lequel s’effondre ensuite aux étapes développementales tardives. De plus, les souris Tg(Nkx2.1Cre);Tsc1flox/flox montrent des déficits dans la mémoire de travail et le comportement social et ce d’une façon dose-dépendante. En somme, ces résultats suggèrent que l’activation contrôlée de mTOR régule le déroulement de la maturation et la maintenance des synapses des BCs. Des dysfonctions de la neurotransmission GABAergique ont été impliquées dans des maladies telles que l’épilepsie et chez certains patients, elles sont associées avec des mutations du récepteur GABAA. De quelle façon ces mutations affectent le processus de maturation des BCs demeuret toutefois inconnu. Pour adresser cette question, nous avons utilisé la stratégie Cre-lox pour déléter le gène GABRA1, codant pour la sous-unité alpha-1 du récepteur GABAA dans une unique BC en culture organotypique. La perte de GABRA1 réduit l’étendue du champ d’innervation des BCs, suggérant que des variations dans les entrées inhibitrices en raison de l’absence de la sous-unité GABAAR α1 peuvent affecter le développement des BCs. La surexpression des sous-unités GABAAR α1 contenant des mutations identifiées chez des patients épileptiques ont montré des effets similaires en termes d’étendue du champ d’innervation des BCs. Pour approfondir, nous avons investigué les effets de ces mutations identifiées chez l’humain dans le développement des épines des neurones pyramidaux, lesquelles sont l’endroit privilégié pour la formation des synapses excitatrices. Somme toute, ces données montrent pour la première fois que différentes mutations de GABRA1 associées à des syndromes épileptiques peuvent affecter les épines dendritiques et la formation des boutons GABAergiques d’une façon mutation-spécifique.

Caracterização de uma nova exonuclease identificada em uma biblioteca metagenômica

A abordagem metagenômica tem permitido o acesso ao material genético de microrganismos não cultivados e tem sido usada para identificação de novos genes. Apesar da importância dos mecanismos de reparo de DNA para a manutenção da integridade genômica nosso conhecimento sobre mecanismos de reparo de DNA é baseado em organismos modelo como E. coli e pouco é conhecido sobre os organismos de vida livre e não cultivados. Neste trabalho, a abordagem metagenômica foi aplicada para descobrir novos genes envolvidos com a manutenção da integridade genômica. Um clone positivo foi identificado por replicar a biblioteca metagenômica em meio seletivo contendo H2O2. O clone metagenômico foi capaz de complementar parcialmente a deficiência em reparo de DNA de cepas simples e duplo-mutantes de E.coli (recA e xthA nfo, respectivamente) submetidas ao estresse gerado por H2O2 e MMS.A análise de sequência mostrou uma ORF codificando para uma proteína hipotética membro da superfamília Exo_Endo_Phos (PF03372) e, a filogenia indicou que a mesma não está inclusa em nenhuma das subfamílias EEP. Assim, uma nova nuclease foi identificada e experimentalmente caracterizada in vivo e in vitro. Ensaios específicos utilizando a nuclease purificada e oligonucleotideos fluorescentemente marcados revelaram sua atividade 3´-5´exonuclease, em substratos simples e dupla-fita, dependente de Magnésio e sensível a EDTA. Uma vez que este é o primeiro relato e caracterização de uma enzima obtida a partir de abordagem metagenômica mostrando uma atividade exonuclease, foi nomeada EXOMEG1

Produção enzimática de biodiesel a partir de resíduos agro-industriais usando a lipase imobilizada de origem microbiana

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Biológica

Association between common lipid metabolism genes polymorphisms and sporadic colorectal adenocarcinoma risk

Lipids can modulate the risk of developing sporadic colorectal adenocarcinoma (SCA), since alterations into lipid metabolism and transport pathways influence directly cholesterol and lipids absorption by colonic cells and indirectly reactive oxygen species (ROS) synthesis in rectum cells due to lipid accumulation. Lipid metabolism is regulated by several proteins APOA1, APOB, APOC3, APOE, CETP, NPY, PON1 and PPARG that could influence both metabolism and transport processes. Is been reported that several common single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in these genes could influence their function and/or expression, changing lipid metabolism balance. Thus, genetic changes in those genes can influence SCA development, once the majority of them were never studied in this disease. Furthermore, there are contradictory results between some studied polymorphisms and SCA risk. Thus, the aim of this study was to explore and describe lipid metabolism-associated genes common polymorphisms (APOA1 -75 G>A; APOB R3500Q; APOC3 C3175G, APOC3 T3206G; APOE Cys112/158Arg; CETP G279A, CETP R451Q; NPY Leu7Pro; PON1 Q192R; PPARG Pro12Ala) status among SCA, and their relationship with SCA risk. Genotyping of common lipid metabolism genes polymorphisms (APOA1 75 G>A; APOB R3500Q; APOC3 C3175G, APOC3 T3206G; APOE Cys112/158Arg; CETP G279A, CETP R451Q; NPY Leu7Pro; PON1 Q192R; PPARG Pro12Ala) were done by PCR-SSP techniques, from formalin-fixed and paraffin-embedded biopsies of 100 healthy individuals and 68 SCA subjects. Mutant genotypes of APOA1 -75AA (32% vs 12%; p=0.001; OR=3.51; 95% CI 1.59-7.72); APOB 3500AA (7% vs 0%; p=0.01); APOC3 3175GG (19% vs 2%; p=0.0002; OR=11.58; 95% CI 2.52-53.22), APOC3 3206GG (19% vs 0%; p<0.0001); CETP 279AA (12% vs 1%; p=0.003; OR=13.20; 95% CI 1.61-108.17), CETP 451AA (16% vs 0%; p<0.0001); NPY 7CC (15% vs 0%; p<0.0001); PPARG 12GG (10% vs 0%; p=0.001); and heterozygote genotype PON1 192AG (56% vs 22%; p<0.0001; OR=4.49; 95% CI 2.298.80) were found associated with SCA prevalence. While, APOE E4/E4 (0% vs 8%; p=0.02) mutant haplotype seemed to have a protective effect on SCA. Moreover, it also been founded differences between APOB 3500GA, APOC3 3206TG, CETP 279AA genotypes and PPARG 12Ala allele prevalence and tissue localization (colon vs rectum). These findings suggest a positive association between most of common lipid metabolism genes polymorphisms studied and SCA prevalence. Dysregulation of APOA1, APOB, APOC3, CETP, NPY, PON1 and PPARG genes could be associated with lower cholesterol plasma levels and increase ROS among colon and rectum mucosa. Furthermore, these results also support the hypothesis that CRC is related with intestinal lipid absorption decrease and secondary bile acids production increase. Moreover, the polymorphisms studied may play an important role as biomarkers to SCA susceptibility.

Association between common lipid metabolism genes polymorphisms and sporadic colorectal adenocarcinoma risk

Lipids can modulate the risk of developing sporadic colorectal adenocarcinoma (SCA), since alterations into lipid metabolism and transport pathways influence directly cholesterol and lipids absorption by colonic cells and indirectly reactive oxygen species (ROS) synthesis in rectum cells due to lipid accumulation. Lipid metabolism is regulated by several proteins APOA1, APOB, APOC3, APOE, CETP, NPY, PON1 and PPARG that could influence both metabolism and transport processes. Is been reported that several common single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in these genes could influence their function and/or expression, changing lipid metabolism balance. Thus, genetic changes in those genes can influence SCA development, once the majority of them were never studied in this disease. Furthermore, there are contradictory results between some studied polymorphisms and SCA risk. Thus, the aim of this study was to explore and describe lipid metabolism-associated genes common polymorphisms (APOA1 -75 G>A; APOB R3500Q; APOC3 C3175G, APOC3 T3206G; APOE Cys112/158Arg; CETP G279A, CETP R451Q; NPY Leu7Pro; PON1 Q192R; PPARG Pro12Ala) status among SCA, and their relationship with SCA risk. Genotyping of common lipid metabolism genes polymorphisms (APOA1 75 G>A; APOB R3500Q; APOC3 C3175G, APOC3 T3206G; APOE Cys112/158Arg; CETP G279A, CETP R451Q; NPY Leu7Pro; PON1 Q192R; PPARG Pro12Ala) were done by PCR-SSP techniques, from formalin-fixed and paraffin-embedded biopsies of 100 healthy individuals and 68 SCA subjects. Mutant genotypes of APOA1 -75AA (32% vs 12%; p=0.001; OR=3.51; 95% CI 1.59-7.72); APOB 3500AA (7% vs 0%; p=0.01); APOC3 3175GG (19% vs 2%; p=0.0002; OR=11.58; 95% CI 2.52-53.22), APOC3 3206GG (19% vs 0%; p<0.0001); CETP 279AA (12% vs 1%; p=0.003; OR=13.20; 95% CI 1.61-108.17), CETP 451AA (16% vs 0%; p<0.0001); NPY 7CC (15% vs 0%; p<0.0001); PPARG 12GG (10% vs 0%; p=0.001); and heterozygote genotype PON1 192AG (56% vs 22%; p<0.0001; OR=4.49; 95% CI 2.298.80) were found associated with SCA prevalence. While, APOE E4/E4 (0% vs 8%; p=0.02) mutant haplotype seemed to have a protective effect on SCA. Moreover, it also been founded differences between APOB 3500GA, APOC3 3206TG, CETP 279AA genotypes and PPARG 12Ala allele prevalence and tissue localization (colon vs rectum). These findings suggest a positive association between most of common lipid metabolism genes polymorphisms studied and SCA prevalence. Dysregulation of APOA1, APOB, APOC3, CETP, NPY, PON1 and PPARG genes could be associated with lower cholesterol plasma levels and increase ROS among colon and rectum mucosa. Furthermore, these results also support the hypothesis that CRC is related with intestinal lipid absorption decrease and secondary bile acids production increase. Moreover, the polymorphisms studied may play an important role as biomarkers to SCA susceptibility.

Degradación bacteriana de cianuro y compuestos nitrogenados tóxicos

La ruta de asimilación de cianuro en P. pseudoalcaligenes CECT5344 transcurre a través de un nitrilo formado por la reacción química del cianuro con el oxalacetato, siendo este último acumulado como consecuencia de la acción conjunta de una malato:quinona oxidoreductasa (MQO) y la oxidasa terminal resistente a cianuro (CioAB) (Luque-Almagro et al., 2011b). Los nitrilos pueden ser convertidos en amonio por la acción de una nitrilasa o un sistema nitrilo hidratasa/amidasa. Con el objetivo de elucidar la ruta de asimilación de cianuro en P. pseudoalcalígenes CECT5344, se ha analizado el proteoma de este microorganismo en condiciones cianotróficas frente a nitrato como fuente de nitrógeno como control. En este estudio se identificaron proteínas relacionadas con la ruta de asimilación de cianuro en la estirpe CECT5344, que aparecían inducidas por cianuro, como NitB y NitG, cuyos genes se encuentran localizados en la agrupación génica nit1C. Además de NitB y NitG, de función desconocida, la agrupación génica nit1C codifica un regulador transcripcional del tipo Fis dependiente de σ54 (NitA), una nitrilasa (NitC), una proteína que pertenece a la superfamilia S-adenosilmetionina (NitD), un miembro de la superfamilia N-aciltransferasa (NitE), un polipéptido de la familia AIRS/GARS (NitF) y una oxidorreductasa dependiente de NADH (NitH). Un análisis transcripcional mediante RT-PCR determinó que los genes nitBCDEFGH se cotranscriben, mientras que el gen regulador nitA se transcribe de forma divergente. Además, resultados obtenidos por RT-PCR confirman que la expresión de los genes nitBCDEFGH está inducida por cianuro y reprimida por amonio. La relación entre el cianuro y el grupo de genes nit1C queda patente por el fenotipo de los mutantes deficientes nitA, nitB y nitC, incapaces de usar complejos cianuro-metálicos o 2-hidroxinitrilos como única fuente de nitrógeno. Todos estos datos indican que la nitrilasa NitC, junto con la proteína NitB, utilizan de forma específica determinados nitrilos alifáticos como sustrato, entre los que se encuentran el formado durante la asimilación de cianuro (Estepa et al., 2012). Además, entre las proteínas inducidas por cianuro se identificaron una dihidropicolinato sintasa (DapA), una fosfoserina transaminasa (SerC) y una proteína de función desconocida (Orf1), las tres codificadas por genes del operón cio, una cianasa (CynS), la proteína S6 de la subunidad ribosomal 30S (RpsF), una superóxido dismutasa (SodB), la ferritina (Dps), una oxidorreductasa (Fpr) y un factor de elongación P (EF-P). Una vez identificadas, estas proteínas se han analizado funcionalmente y se han localizado en el genoma de P. pseudoalcaligenes CECT5344 los genes correspondientes, así como los genes adyacentes. La inducción de estas proteínas en condiciones cianotróficas sugiere que el metabolismo del cianuro incluye, además de la resistencia y asimilación de este tóxico, otros procesos biológicos relacionados con el metabolismo del cianato y de algunos aminoácidos, el estrés oxidativo y la homeostasis de hierro, entre otros. Por otra parte, el conocimiento en profundidad y la interpretación de la secuencia génica de P. pseudoalcaligenes CECT5344, así como el análisis comparativo frente a organismos no cianotrofos ha permitido entender algunos de los mecanismos implicados en la resistencia y asimilación de cianuro, lo que permitiría conducir a la posterior mejora del proceso de biodegradación de cianuro. Además, el estudio del genoma de la estirpe CECT5344 permitirá explorar la capacidad de este organismo para ser utilizado en procesos de biorremediación de residuos cianurados en los que se encuentran metales y otros tóxicos (Luque-Almagro et al., 2013; Wibberg et al., 2014). En este trabajo se muestran y discuten los resultados de la secuenciación del genoma de P. pseudoalcaligenes, así como el estudio del análisis filogenético y evolutivo de la cepa, estableciéndose de esta manera relaciones con otras especies en base a los genomas secuenciados de las mismas, entre las que destaca P. mendocina ymp relacionada con P. pseudoalcaligenes CECT5344. El estudio de las características del genoma de P. pseudoalcaligenes CECT5344 ha sido completado con un análisis comparativo frente a los genomas de otras especies de Pseudomonas, encontrándose así semejanzas y diferencias en cuanto a la distribución génica funcional. Por último, se muestra un análisis del genoma de P. pseudoalcaligenes CECT5344 en relación con los genes implicados probablemente en los procesos de asimilación de cianuro y residuos cianurados, tales como los codificantes de nitrilasas y aquellos implicados en la resistencia a cianuro como los constituyentes del operón cio que codifican la oxidasa terminal insensible a cianuro. Finalmente, se discute la presencia de genes implicados posiblemente en otros procesos con una alto potencial biotecnológico, tales como la producción de bioplásticos y la biodegradación de diversos contaminantes.

Defining the role of NatC dependent N-terminal acetylation in Drosophila fertility

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2014