Residue specific contributions to stability and activity inferred from saturation mutagenesis and deep sequencing

Multiple methods currently exist for rapid construction and screening of single-site saturation mutagenesis (SSM) libraries in which every codon or nucleotide in a DNA fragment is individually randomized. Nucleotide sequences of each library member before and after screening or selection can be obtained through deep sequencing. The relative enrichment of each mutant at each position provides information on its contribution to protein activity or ligand-binding under the conditions of the screen. Such saturation scans have been applied to diverse proteins to delineate hot-spot residues, stability determinants, and for comprehensive fitness estimates. The data have been used to design proteins with enhanced stability, activity and altered specificity relative to wild-type, to test computational predictions of binding affinity, and for protein model discrimination. Future improvements in deep sequencing read lengths and accuracy should allow comprehensive studies of epistatic effects, of combinational variation at multiple sites, and identification of spatially proximate residues.

Sparsely populated residue conformations in protein structures: Revisiting ``experimental'' Ramachandran maps

The Ramachandran map clearly delineates the regions of accessible conformational (phi-) space for amino acid residues in proteins. Experimental distributions of phi, values in high-resolution protein structures, reveal sparsely populated zones within fully allowed regions and distinct clusters in apparently disallowed regions. Conformational space has been divided into 14 distinct bins. Residues adopting these relatively rare conformations are presented and amino acid propensities for these regions are estimated. Inspection of specific examples in a completely arid, fully allowed region in the top left quadrant establishes that side-chain and backbone interactions may provide the energetic compensation necessary for populating this region of phi- space. Asn, Asp, and His residues showed the highest propensities in this region. The two distinct clusters in the bottom right quadrant which are formally disallowed on strict steric considerations correspond to the gamma turn (C7 axial) conformation (Bin 12) and the i + 1 position of Type II turns (Bin 13). Of the 516 non-Gly residues in Bin 13, 384 occupied the i + 1 position of Type II turns. Further examination of these turn segments revealed a high propensity to occur at the N-terminus of helices and as a tight turn in hairpins. The strand-helix motif with the Type II turn as a connecting element was also found in as many as 57 examples. Proteins 2014; 82:1101-1112. (c) 2013 Wiley Periodicals, Inc.

C-11/C-9 Helices in Crystals of alpha beta Hybrid Peptides and Switching Structures between Helix Types by Variation in the alpha-Residue

Close-packed helices with mixed hydrogen bond directionality are unprecedented in the structural chemistry of alpha-polypeptides. While NMR studies in solution state provide strong evidence for the occurrence of mixed helices in (beta beta)(n) and (alpha beta)(n) sequences, limited information is currently available in crystals. The peptide structures presented show the occurrence of C-11/C-9 helices in (alpha beta)(n) peptides. Transitions between C-11 and C-11/C-9 helices are observed upon varying the alpha-amino acid residue.

Directing peptide conformation with centrally positioned pre-organized dipeptide segments: studies of a 12-residue helix and beta-hairpin

Secondary structure formation in oligopeptides can be induced by short nucleating segments with a high propensity to form hydrogen bonded turn conformations. Type I/III turns facilitate helical folding while type II'/I' turns favour hairpin formation. This principle is experimentally verified by studies of two designed dodecapeptides, Boc-Val-Phe-Leu-Phe-Val-Aib-Aib-Val-Phe-Leu-Phe-Val-OMe 1 and Boc-Val-Phe-Leu-Phe-Val- (D) Pro- (L) Pro-Val-Phe-Leu-Phe-Val-OMe 2. The N- and C-terminal flanking pentapeptide sequences in both cases are identical. Peptide 1 adopts a largely alpha-helical conformation in crystals, with a small 3(10) helical segment at the N-terminus. The overall helical fold is maintained in methanol solution as evidenced by NMR studies. Peptide 2 adopts an antiparallel beta-hairpin conformation stabilized by 6 interstrand hydrogen bonds. Key nuclear Overhauser effects (NOEs) provide evidence for the antiparallel beta-hairpin structure. Aromatic proton chemical shifts provide a clear distinction between the conformation of peptides 1 (helical) and 2 (beta-hairpin). The proximity of facing aromatic residues positioned at non-hydrogen bonding positions in the hairpin results in extensively ring current shifted proton resonances in peptide 2.

Biodiesel Exhaust Treatment with Dielectric Barrier Discharges Coupled with Industrial Waste Byproducts

Biodiesel run engines are gaining popularity since the last few years as a viable alternative to conventional petro-diesel based engines. In biodiesel exhaust the content of volatile organic compounds, oil mist, and mass of particulate matter is considerably lower. However, the concentration of oxides of nitrogen (NOx) is relatively higher. In this paper the biodiesel exhaust from a stationary engine is treated under controlled laboratory conditions for removal of NOx using dielectric barrier discharge plasma in cascade with adsorbents prepared from abundantly available industrial waste byproducts like red mud and copper slag. Results were compared with gamma-alumina, a commercial adsorbent. Two different dielectric barrier discharge (DBD) reactors were tested for their effectiveness under Repetitive pulses /AC energization. NOx removal as high as 80% was achieved with pulse energized reactors when cascaded with red mud as adsorbent.

Ab Initio MD Simulations of the Bronsted Acidity of Glutathione in Aqueous Solutions: Predicting pK(a) Shifts of the Cysteine Residue

The tripeptide glutathione (GSH) is one of the most abundant peptides and the major repository for nonprotein sulfur in both animal and plant cells. It plays a critical role in intracellular oxidative stress management by the reversible formation of glutathione disulfide with the thiol-disulfide pair acting as a redox buffer. The state of charge of the ionizable groups of GSH can influence the redox couple, and hence the pK(a) value of the cysteine residue of GSH is critical to its functioning. Here we report ab initio Car-Parrinello molecular dynamics simulations of glutathione solvated by 200 water molecules, all of which are considered in the simulation. We show that the free-energy landscape for the protonation-deprotonation reaction of the cysteine residue of GSH computed using metadynamics sampling provides shift in the dissociation constant values as compared with the isolated accurate estimates of the pK(a) and correctly predicts the cysteine amino acid.

Luffa acutangula agglutinin: Primary structure determination and identification of a tryptophan residue involved in its carbohydrate-binding activity using mass spectrometry

A lectin from phloem exudates of Luffa acutangula (ridge gourd) was purified on chitin affinity chromatography and characterized for its amino acid sequence and to study the role of tryptophan in its activity. The purified lectin was subjected to various proteolytic digestions, and the resulting peptides were analyzed by liquid chromatography coupled electrospray ionization ion trap mass spectrometer. The peptide precursor ions were fragmented by collision-induced dissociation or electron transfer dissociation experiments, and a manual interpretation of MS/MS was performed to deduce amino acid sequence. This gave rise to almost complete sequence coverage of the lectin which showed high-sequence similarity with deduced sequences of phloem lectins present in the database. Chemical modification of lysine, tyrosine, histidine, arginine, aspartic acid, and glutamic acid residues did not inhibit the hemagglutinating activity. However, the modification of tryptophan residues using N-bromosuccinimide showed the loss of hemagglutinating activity. Additionally, the mapping of tryptophan residues was performed to determine the extent and number of residues modified, which revealed that six residues per molecule were oxidized suggesting their accessibility. The retention of the lectin activity was seen when the modifications were performed in the presence of chitooligosaccharides due to protection of a tryptophan residue (W-102) in the protein. These studies taken together have led to the identification of a particular tryptophan residue (W-102) in the activity of the lectin. (c) 2015 IUBMB Life, 67(12):943-953, 2015

Ischaemic concentrations of lactate increase TREK1 channel activity by interacting with a single histidine residue in the carboxy terminal domain

Key points The physiological metabolite, lactate and the two-pore domain leak potassium channel, TREK1 are known neuroprotectants against cerebral ischaemia. However, it is not known whether lactate interacts with TREK1 channel to provide neuroprotection. In this study we show that lactate increases TREK1 channel activity and hyperpolarizes CA1 stratum radiatum astrocytes in hippocampal slices. Lactate increases open probability and decreases longer close time of the human (h)TREK1 channel in a concentration dependent manner. Lactate interacts with histidine 328 (H328) in the carboxy terminal domain of hTREK1 channel to decrease its dwell time in the longer closed state. This interaction was dependent on the charge on H328. Lactate-insensitive mutant H328A hTREK1 showed pH sensitivity similar to wild-type hTREK1, indicating that the effect of lactate on hTREK1 is independent of pH change. AbstractA rise in lactate concentration and the leak potassium channel TREK1 have been independently associated with cerebral ischaemia. Recent literature suggests lactate to be neuroprotective and TREK1 knockout mice show an increased sensitivity to brain and spinal cord ischaemia; however, the connecting link between the two is missing. Therefore we hypothesized that lactate might interact with TREK1 channels. In the present study, we show that lactate at ischaemic concentrations (15-30mm) at pH7.4 increases TREK1 current in CA1 stratum radiatum astrocytes and causes membrane hyperpolarization. We confirm the intracellular action of lactate on TREK1 in hippocampal slices using monocarboxylate transporter blockers and at single channel level in cell-free inside-out membrane patches. The intracellular effect of lactate on TREK1 is specific since other monocarboxylates such as pyruvate and acetate at pH7.4 failed to increase TREK1 current. Deletion and point mutation experiments suggest that lactate decreases the longer close dwell time incrementally with increase in lactate concentration by interacting with the histidine residue at position 328 (H328) in the carboxy terminal domain of the TREK1 channel. The interaction of lactate with H328 is dependent on the charge on the histidine residue since isosteric mutation of H328 to glutamine did not show an increase in TREK1 channel activity with lactate. This is the first demonstration of a direct effect of lactate on ion channel activity. The action of lactate on the TREK1 channel signifies a separate neuroprotective mechanism in ischaemia since it was found to be independent of the effect of acidic pH on channel activity. Key points The physiological metabolite, lactate and the two-pore domain leak potassium channel, TREK1 are known neuroprotectants against cerebral ischaemia. However, it is not known whether lactate interacts with TREK1 channel to provide neuroprotection. In this study we show that lactate increases TREK1 channel activity and hyperpolarizes CA1 stratum radiatum astrocytes in hippocampal slices. Lactate increases open probability and decreases longer close time of the human (h)TREK1 channel in a concentration dependent manner. Lactate interacts with histidine 328 (H328) in the carboxy terminal domain of hTREK1 channel to decrease its dwell time in the longer closed state. This interaction was dependent on the charge on H328. Lactate-insensitive mutant H328A hTREK1 showed pH sensitivity similar to wild-type hTREK1, indicating that the effect of lactate on hTREK1 is independent of pH change.

Residue proximity information and protein model discrimination using saturation-suppressor mutagenesis

Identification of residue-residue contacts from primary sequence can be used to guide protein structure prediction. Using Escherichia coli CcdB as the test case, we describe an experimental method termed saturation-suppressor mutagenesis to acquire residue contact information. In this methodology, for each of five inactive CcdB mutants, exhaustive screens for suppressors were performed. Proximal suppressors were accurately discriminated from distal suppressors based on their phenotypes when present as single mutants. Experimentally identified putative proximal pairs formed spatial constraints to recover >98% of native-like models of CcdB from a decoy dataset. Suppressor methodology was also applied to the integral membrane protein, diacylglycerol kinase A where the structures determined by X-ray crystallography and NMR were significantly different. Suppressor as well as sequence co-variation data clearly point to the Xray structure being the functional one adopted in vivo. The methodology is applicable to any macromolecular system for which a convenient phenotypic assay exists.

Incidencia de Cysticercus bovis en la matanza industrial de Nicaragua

En este trabajo, se analizó la situación existente con respecto a la Cysticercosis bovina, en la Empresa Julio Moneada Tercero, ubicada en el Km 11 carretera Norte, departamento de Managua; Esta Empresa cubre el 33% de la matanza industrial en Nicaragua. Con los datos recabados se Evaluaron: Niveles de infestación de los años 1984, 1985, 1988 y 1989; se determinó la infestación por categorías; EL departamento de mayor incidencia; Y las pérdidas económicas. Para el análisis estadístico, el método utilizado fue el de mínimos cuadrados generalizado, usando el procedimiento CATMOD del paquete statistical Analisis System. Los resultados obtenidos en el Análisis de varianza, demuestran que existen diferencias significativas entre años, con un nivel de significancia de P< 0.05 obteniéndose 1.24% de infestación global para los cuatro años, así como también existen diferencias significativas para las diferentes categorías (P< 0.05), siendo la categoría vaca (C2) la más afectada. Matagalpa resultó ser el departamento con el mayor número de animales parasitados seguido de Boaco, Managua y León. Las pérdidas económicas revelan cifras aproximadas de US$ 109,121.50 (ciento nueve mil ciento veinte y un dólares con cincuenta centavos) para el productor, adicionando a esto, las divisas no captadas por un monto aproximado de US$ 653,511.07 (seiscientos cincuenta y tres mil quinientos once dólares con siete centavos) por disminución de las exportaciones.

Residuos de plaguicidas en carne bovina de exportación en el Matadero Industrial Amerrisque

El presente trabajo se realizó en el matadero Amerrisque ubicado a la altura del km 128 carretera el Rama a 130 metros sobre e1 nivel del mar con el objetivo de evaluar los residuos de plaguicidas en carne bovina de exportación. Los datos fueron recopilados de la matanza diaria realizada en dicho matadero a partir del mes de enero de 1987 al mes de diciembre de 1992 a excepción de los meses de marzo, abril, agosto y noviembre del año 1989, de igual forma el año 1990, debido a que los registros ya para este año se encontraron incompletos. Las variables en estudio fueron: Niveles de contaminación aceptable y no aceptable para la exportación, procedencia de dichas carnes, plaguicidas que mayormente se acumulan en 1a carne y las pérdidas económicas. El procedimiento analítico se realizó por medio de una distribución de frecuencias, se hizo uso de medias como estadística descriptiva y también se determinó el rango. Como resultado del presente estudio observamos que la matanza industrial efectuada para los cinco años en estudio fue de 142,919 cabezas, de éstas 18,434 resultaron contaminada con un promedio de contaminación de 0.059 partes por millón, dejándose de percibir USA $ 10,497 dólares.

Efecto de tres periodos de suministro de alimento de retiro en broilers en la Empresa Tip-Top industrial, S.A.

En el presente estudio se evaluaron tres periodos de alimento de retiro o acabado en broilers (o, 3, 6 y 9 días antes de la matanza) el cual contiene 3,225 kcal EM/kg de alimento y 19% de proteína, ajustándose a los requerimientos nutricionales recomendados por Arbor Acres Farm Inc., (1992), en especial a la proporción energia-proteina. La evaluación tuvo lugar en la Granja Buenos Aires propiedad de la Empresa Tip-Top Industrial, S.A., con una duración de 42 días, en donde se utilizaron 800 pollos de engorde sin sexar (mixtos) de la línea Peterson-Arbor Acres de un día de edad, dichos pollos fueron distribuidos aleatoriamente en cuatro tratamientos: T1 suministro de alimento de retiro por nueve días), T2 suministro de alimento de retiro por seis días), T3, (Suministro de alimento de retiro por tres días) y T4 (testigo, con cero días de alimento de retiro), con cuatro repeticiones cada uno, distribuidos en un Diseño completamente al Azar sometidos a la prueba de rangos múltiples de Duncan. Las variables estudiadas fueron: consumo de alimento, peso vivo, ganancia de peso, conversión alimenticia, mortalidad vs viabilidad, rendimiento en la canal, análisis económico. No se encontraron diferencias significativas (P<0.05) entre los tratamientos al final del ensayo para el consumo de alimento, conversión alimenticia y costo de alimento, pero no así ara peso vivo y ganancia de peso. El porcentaje de mortalidad acumulada total fue de 2.5% y los rendimientos de la canal fueron: (90.74)T1 (88.98)T2, (85.86)T3,y (90.31)T4, Se corolo que el periodo de suministro de alimento de retiro que permitió los mejores pesos vivos, ganancias de pesos y conversiones alimenticias fue el periodo de tres días (T3), sin embargo, obtuvo el mayor consumo total para generar un peso promedio en la canal de 3.34 lbs, además, presentó el mayor costo alimenticio entre los tratamientos experimentales (T1, T2, T3) y bajo rendimiento en la canal, contrario al T1 que aunque los parámetros productivos fueron menores que el T3 obtuvo el mayor rendimiento en la canal con un menor costo alimenticio. El alimento de retiro no ejerció efecto sobre las variables estudiadas lo que demuestra que dicho alimento pueda ser una alternativa viable para disminuir costo alimenticio.

Determinación de presencia de residuos de antibióticos en carnes bovinas en el matadero industrial Nuevo Carnic, Managua

Los antibióticos imputan grandes beneficios por la eficacia antibacteriana que poseen para combatir las enfermedades que afectan a los vacunos, no obstante el uso irracional sin respetar las dosis recomendadas del producto indiscriminadamente puede tener graves consecuencias, como la resistencia bacteriana al producto que conlleva a una sobre dosificación. Tomando en cuenta la exigencia de los mercados Internacionales que cada día demandan de los productores y exportadores productos con mayor calidad de la carne en lo relacionado a los residuos de antibióticos se desarrolló el presente trabajo investigativo que se titula “Residuos de Antibióticos en carnes bovinas en el matadero Industrial Nuevo Carnic. Managua.” En el matadero se seleccionaron muestras al azar una vez por mes para determinación de residuos de antibióticos en la canal para ser realizadas en el laboratorio mediante la técnica LAST-FSIS. Mediante las cuales permitieron reconocer la ausencia de residuos de antibióticos en las canales de los años muestreados, así como también determinar la ausencia de residuos por procedencia, ya sea de departamentos o municipios de Nicaragua, que llevan animales a este matadero alcanzándose a determinar el porcentaje de animales analizándose por productores. Es saludable reconocer que a pesar de la limitada asistencia médica que reciben los productores y el alto número de productos químicos ofrecidos por las casas comerciales las canales encuentran libres de residuos de antibióticos.

Implementación de HyD [Hidroxicolecalciferol (25-OH-D3)] en la dieta de pollos de engorde como profilaxis de osteopatías, enfatizando en el sindrome del hueso negro, Granja Trinidad-1, Tip Top industrial

El objetivo del experimento fue evaluar el efecto del Hidroxicolecalciferol [HyD (25 –OH- D3)] en pollos de engorde, atraves de porcentajes de ceniza, calcio, fosforo y diagnostico de síndrome de hueso negro, se evaluaron dos tratamientos ( HyD y Testigo) con seis repeticiones para cada uno en dos tiempos a los 21 y 35 días de edad en análisis de ceniza, calcio y fosforo para lo cual se extrajo una tibia por pollo, dichos análisis resultaron con diferencias no significativas en ambas edades, las evaluaciones dieron como resultado que de los 21 día a los 35 días disminuyen su valor, ceniza baja de 43.8% a 36.8% en el testigo y de 42.4% a 37.7% en HyD, calcio de 15.6% a 13.4% para el testigo y de 16% a 14.5% para HyD de igual manera para los porcentaje de fosforo de 21 a 35 días con 7.6% a 6.5% para testigo y 7.5% a 6.7% para HyD. A los 35 días los resultados son mayores en el grupo HyD, 37.7% HyD,36.8% testigo en ceniza, calcio 14.5% HyD, testigo 13.4% y fosforo 6.7% HyD , 6.5% para testigo, las diferencias de 21 a 35 días son notorias y conservan la parte proporcional en que los porcentajes estan en ceniza calcio y fosforo, pero estas disminuyen para una misma variable de los 21 días de edad a los 35, sin encontrar diferencia significativas. A los 35 días se realizo análisis de síndrome de hueso negro con un total de 22 repeticiones por tratamiento, la extracción de dicha muestra (tibia) se realizo en planta de proceso, el análisis determino diferencias entre las aves muestreadas dando los mejores resultados aquellas que fueron alimentadas con Hidroxicolecalciferol [HyD (25 –OH- D3)], se observo en los resultados que en el grupo con HyD alcanzo un 91% de individuos sanos superando significativamente al testigo que solo llego a un 77% de individuos sanos, empleando un grado de libertad y 0.05 de significancia, lo que indica diminución de la presencia del síndrome de hueso negro, producto del HyD, empleando la línea genética Cobb 500, y alimentando los pollos del día cero al día 21 con diferencias de tratamiento e igual alimento del día 22 al día 35.

Influencia de diferentes períodos de enmalezamiento sobre el rendimiento del sorgo industrial (Sorghum bicolor L. Moench) var. pinolero-1

El ensayo se realizó en la época de postrera del año 1990, en la estación experimental la Compañía (San Marcos). Con el propósito de evaluar el efecto de diferentes períodos enmalezados sobre el crecimiento y rendimiento del cultivo del sorgo. El diseño empleado fue en Bloques Completos al Azar con cuatro repeticiones. Se establecieron en total ocho tratamientos, los cuales incluían diferentes periodos de enmalezantiento con intervalos de 7 días entre uno y otro tratamiento. Un tratamiento recibió control durante todo el ciclo y otro tratamiento permaneció enmalezado hasta la cosecha Algunas variables evaluadas no presentaron diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos, entre ellas podemos mencionar: número de panojas, longitud de la panoja, y peso de mil semillas, en cambio las variables altura de planta, número de ramillas por panícula, y diámetro del tallo, si presentaron diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos. El peso fresco de malezas presento un incremento progresivo a partir de los 14 dds, acumulando materia fresca en cada semana adicional de competencia hasta llegar a su mayor valor a los 56 días después de la siembra, logrando notarse mayor incremento en el peso fresco a partir de los 35 días después de la siembra. Los mayores rendimientos se obtuvieron cuando el cultivo permaneció enmalezado durante un período de 35 días y el tratamiento que presentó el menor rendimiento fue el que permaneció enmalezado durante todo el ciclo. Con los resultados obtenidos es posible indicar que el cultivo del sorgo bajo las condiciones en que se desarrolló el experimento puede soportar competencia con las malezas durante un período de 35 días después de la siembra, sin ver afectados sus rendimientos de manera significativa.