Purificação, caracterização e análise da atividade bioinseticida, de um inibidor de tripsina em sementes de catanduva (Piptadenia moniliformis)

One Kunitz-type trypsin inhibitors (PmTI) was purified from Piptadenia moniliformis seeds, a tree of the sub-family Mimosoideae, by TCA precipitation, affinity chromatography on immobilized trypsin-Sepharose, DEAE cellulose (ion exchange) and Superose 12 (molecular exclusion) column FPLC/AKTA. The inhibitor has Mr of 25 kDa by SDS-PAGE and chromatography molecular exclusion. The N-terminal sequence of this inhibitor showed high homology with other family Kunitz inhibitors. This also stable variations in temperature and pH and showed a small decrease in its activity when incubated with DDT in the concentration of 100mM for 120 minutes. The inhibition of trypsin by PmTI was competitive, with Ki of 1.57 x10-11 M. The activity of trypsin was effectively inhibited by percentage of inhibition of 100%, among enzymes tested, was not detected inhibition for the bromelain, was weak inhibitor of pancreatic elastase (3.17% of inhibition) and inhibited by 76.42% elastase of neutrophils, and inhibited in a moderate, chymotrypsin and papain with percentage of inhibition of 42.96% and 23.10% respectively. In vitro assays against digestive proteinases from Lepidoptera, Diptera and Coleoptera pests were carried out. Several degrees of inhibition were found. For Anthonomus grandis and Ceratitis capitata the inhibition was 89.93% and 70.52%, respectively, and the enzymes of Zabrotes subfasciatus and Callosobruchus maculatus were inhibited by 5.96% and 9.41%, respectively, and the enzymes of Plodia. interpunctella and Castnia licus were inhibited by 59.94% and 23.67, respectively. In vivo assays, was observed reduction in the development of larvae in 4rd instar of C. capitata, when PmTI was added to the artificial diet, getting WD50 and LD50 of 0.30% and 0.33%, respectively. These results suggest that this inhibitor could be a strong candidate to plant management programs cross transgenic

Efeito inseticida de vicilinas isoladas de sementes de erythrina velutina em condições de semi-campo para moscas das frutas (ceratitis capitata)

Chitin-binding vicilins from legume seeds (Erythrina velutina. Canavalia ensiformes and Phaseolus vulgares) were isolated by ammonium sulfate followed by affinity chromatography on a chitin column. Effect of these vicilins on female adults of Ceratitis capitata was examined by bioassay and in a semi-field assay model. Mechanism of action of the vicilins was determined by in vivo digestibility and chitin affinity. Among the tested vicilins, E. velutina when added to diet caused strong effect on mortality at 10% dose. This insecticidal property was tested in a semi-field assay which showed the same effect observed in laboratory conditions, where doses of 10% and 15% were lethal to female adults of C. capitata. These deleterious effects were not only associated to the binding to chitin structures present in peritrophic membrane, but principally to its low digestibility in the C. capitata digestive tract. This fact was confirmed because chiting binding proteins as WGA and the other tested vicilins were not toxic to female adults of C. capitata due susceptibility of these proteins to digestive enzymes of the insects. By other side EvV was more resistant to digestive enzymes, causing deleterious effects on female adults of C. capitata. These results showed that EvV may be part of the pest management programs or an alternative in plant improvement program in the population control of this fruticulture pest

Avaliação das atividades anti-inflamatória, anticoagulante e antiproliferativa do inibidor de quimotripsina das sementes de erythrina velutina (EvCI)

Studies indicate that several components were isolated from medicinal plants, which have antibacterial, antifungal, antitumor and anti-inflammatory properties. Sepsis is characterized by a systemic inflammation which leads to the production of inflammatory mediators exacerbated by excessive activation of inflammatory cells and disseminated intravascular coagulation (DIC), in which the human neutrophil elastase plays an important role in its pathogenesis. Several epidemiological studies suggest that components of plants, especially legumes, can play a beneficial role in reducing the incidence of different cancers. A chymotrypsin inhibitor of Kunitz (Varela, 2010) was purified from seeds of Erythrina velutina (Mulungu) by fractionation with ammonium sulfate, affinity chromatography on Trypsin-Sepharose, Chymotrypsin-Sepharose and ion exchange chromatography on Resource Q 1 ml (GE Healthcare) in system FPLC / AKTA. The inhibitor, called EvCI, had a molecular mass of 17 kDa determined by SDS-PAGE. The purified protein was able to inhibit human neutrophil elastase (HNE), with an IC50 of 3.12 nM. The EvCI was able to inhibit both pathways of HNE release stimulated by PAF and fMLP (75.6% and 65% respectively). The inhibitor also inhibited leukocyte migration in septic mice about 87% and prolonged the time of coagulation and inhibition factor Xa. EvCI showed neither hemolytic activity nor cytotoxicity. EvCI showed a selective antiproliferative effect to HepG2 cell lines with IC50 of 0.5 micrograms per milliliter. These results suggest EvCI as a molecule antagonist of PAF / fMLP and a potential use in fighting inflammation related disorders, disseminated intravascular coagulation (DIC) and cancer

Um novo inibidor de tripsina multifuncional de sementes de Erythrina velutina: caracterizacao e propriedades farmacologicas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Vicilinas de sementes de leguminosas selvagens:purificação, caracterização, efeito de deletério e mecanismo de ação para bruquídeos e para fungos fitopatogêncios

Globulins fractions of legume seeds of Crotalaria pallida, Erytrina veluntina and Enterolobium contortisiliquum were isolated and submitted to assays against serine, cysteine and aspartic proteinases, as also amylase present in midgut of C. maculatus and Z. subfasciatus. Hemagglutination assays indicated presence of a lectin in E. veluntina globulin fractions. This lectin had affinity to human erythrocytes type A, B and O. Vicilins were purified by chromatography on Sephacryl S-300 followed of a chromatography on Sephacryl S-200, which was calibrated using protein markers. Vicilins from C. pallida (CpV) and E. veluntina (EvV) seeds had a molecular mass of 124.6 kDa and E. contortisiliquum a molecular mass of 151kDa. Eletrophoresis in presence of SDS showed that CpV was constituted by four subunities with apparent molecular mass of 66, 63, 57 and 45 kDa, EvV with three subunities with apparent molecular mass of 45kDa and EcV four subunities, two with 37.1 kDa and two with 25.8 kDa. Non denaturantig eletrophoresis displayed single bands with high homogeneity, where CpV had lower acidic behavior. All vicilins are glycoproteins with carbohydrate contents at 1 to1.5%. Bioassays were done to detect deleterious effects of vicilins against C. maculatus and Z. subfasciatus larvae. CpV, EvV and EcV exhibited a WD50 of 0.28, 0.19 and 1.03%; LD50 0.2, 0.26, and 1.11% respectively to C. maculatus. The dose responses of CpV, EvV and EcV to Z. subfasciatus were: WD50 of 0.12, 0.14, 0.65% and LD50 of 0.09, 0.1, and 0.43% respectively. The mechanism of action of these proteins to bruchids should be based on their properties of bind to chitin present in mid gut of larvae associated with the low digestibility of vicilin. In assays against phytopatogenous fungus, only EcV was capable of inhibit F. solani growth at concentrations of 10 and 20 µg and its action mechanism should be also based in the affinity of EcV to chitin present in the fungi wall

Vicilina de sementes da leguminosa selvagem Anadenanthera macrocarpa (AmV): purificação, caracterização, efeito deletério e mecanismo de ação para bruquídeo callosobruchus maculatus

Grains and legume seeds are foods that form the basis of the diets of many cultures around the world, winch contritbute to the daily nutrient requirements of humans. Vicilins (7S globulin) are storage proteins found in legume seeds, and may have an additional function constitutive defense of the embryo against pests and pathogens. In this work the vicilin from Anadenanthera macrocarpa - AmV (red-angico), was purified and partially characterized, its effect on development and larval survival and adult emergence of Callosobruchus maculatus was evaluated by determination of LD50, WD50 and ED50 in system bioassay. Purification of vicilin was initiated by the chitin affinity chromatography and then gel filtration (Superdex 75 Tricorn 10x300 mm) FPLC system followed by reverse phase chromatography (C8 phenomenex) on HPLC system. Bioassays WD50 and LD50 for larvae were 0.32% and 0.33% (w:w) respectively, since the ED50 for adults was 0.096%. The probable mechanism of action was evaluated by testing digestibility of AmV in vitro, and observed for the involvement of two fragments vicilins immunoreactive against polyclonal Anti-vicilin from Erythrina velutina (Anti-EvV) about of 22 and 13 kDa chitin binding. The AmV in its native form has been recognized by the anti-EvV, indicating that there is a conserved region in the vicilin and is probably corresponding to the chitin binding domains. These results point to a new vicilin chitin binding that can subsequently be used as a possible biopesticide protein source, in order to control insect pest C. maculatus and confirm literature findings that demonstrate vicilin in the presence of different kinds of ligands to conserved regions chitin not yet characterized

Germinação e armazenamento de sementes de COCA (Erythroxylum ligustrinum DC. - Erythroxylaceae)

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da temperatura sobre a germinação e o armazenamento de sementes de Erythroxylum ligustrinum DC. As sementes foram colocadas germinar caixas de plásticas sobre duas folhas de papel, umedecidas com Nistatina 0, 2%, mantidas em germinadores nas temperaturas constantes de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 e 45ºC e com fotoperíodo de 12 horas. Para o armazenamento, as sementes foram colocadas em sacos de papel, mantidos à temperatura ambiente e em geladeira. em seguida, mensalmente, foi avaliada a germinação das sementes. A temperatura mínima, a faixa de temperatura ideal e a temperatura máxima para germinação de sementes de coca estão entre 10 e 15ºC, 25 e 30ºC e 40 e 45ºC, respectivamente. O armazenamento de sementes coca por longo período é inviável em embalagens de papel na geladeira (10ºC ± 2) e em temperatura ambiente (27ºC ± 5).

Extrações de óleos de sementes de citros e suas atividades sobre a formiga cortadeira Atta sexdens e seu fungo simbionte

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Aspectos morfológicos de frutos e sementes e caracterização citogenética de Crotalaria lanceolata E. Mey. (Papilionoideae - Fabaceae)

Frutos, sementes e plântulas de Crotalaria lanceolata, conhecida popularmente como guizo-de-cascavel, chocalho-de-cobra, xique-xique ou feijão-de-guizo, planta tóxica infestante que ocorre no Estado de São Paulo, foram estudadas morfologicamente e citogeneticamente. Os frutos são secos, deiscentes, polispérmicos e do tipo legume. As sementes são reniformes e o embrião é constituído de eixo embrionário e dois cotilédones. A testa pode apresentar variadas tonalidades de castanhos. A germinação é epígea e fanerocotiledonar. A espécie apresenta número cromossômico diplóide 2n = 16 com formulação cariotípica 12M + 4SM e comprimento cromossômico médio geral de 3,340 ± 0,689.

Banco de sementes de plantas daninhas e sua correlação com a flora estabelecida no agroecossistema cana-crua

O conhecimento da composição específica do banco de sementes de plantas daninhas e a sua correlação com a flora estabelecida são importantes para nortear o manejo a ser adotado e a escolha dos herbicidas. A colheita mecanizada de cana-de-açúcar acarretou mudanças significativas na composição da flora infestante, quando proporcionou a manutenção de uma camada de palha, reduziu a movimentação do solo e dispensou a prática da queimada. Foram realizados levantamentos do banco de sementes e da flora de plantas daninhas que se estabeleceu em 28 talhões colhidos mecanicamente, sem queima prévia da palha. Com base nos dados de banco de sementes, efetuaram-se estudos fitossociológicos e de correlação entre a composição do banco de sementes e a flora emergida. As principais espécies presentes no banco de sementes foram as pertencentes à classe das dicotiledôneas anuais, com destaque para Amaranthus spp. e diversas espécies de Euphorbiaceae e Convolvulaceae. As sementes de gramíneas tradicionais da cultura tiveram pouca participação. O banco de sementes apresentou correlação não-significativa com a flora emergente, independentemente da época de colheita do talhão, da metodologia de quantificação do banco de sementes e das espécies de plantas daninhas.

Produção e qualidade fisiológica de sementes de soja avaliadas na semeadura de inverno

O cultivo da soja fora da época convencional pode ser uma alternativa de rotação de cultura além de proporcionar sementes de melhor qualidade fisiológica, que podem ser utilizadas na semeadura da próxima safra diminuindo o período de armazenamento. O trabalho de pesquisa teve por objetivo avaliar o comportamento de sete cultivares de soja, em três densidades populacionais, quanto ao porte e altura de inserção da primeira vagem, assim como quanto à produção e qualidade fisiológica das sementes, semeadas no período de inverno, na região de Selvíria-MS. O delineamento experimental foi em blocos casualizados, com quatro repetições, dispostos em esquema fatorial 7 ×3. Os tratamentos constaram de sete cultivares (IAC-16, IAC-Foscarin 31, FT-2, IAC-17, IAC-8, Doko e FT-Cristalina) e três densidades de plantas (300, 400 e 500 mil plantas ha-1). O ciclo da soja foi reduzido no cultivo de inverno, principalmente nos cultivares considerados tardios. O fotoperíodo no cultivo de inverno reduziu o período entre o florescimento e a maturação. O cultivar IAC-8 foi o menos sensível ao fotoperíodo, possuindo maturação em época semelhante aos cultivares tardios, e apresentou as melhores características agronômicas para o cultivo no período de inverno. É aconselhável o aumento de densidade de semeadura quando do uso de cultivares precoces em cultivos de inverno. Não é aconselhável armazenar sementes em condições ambientes, principalmente com valores de germinação próximo ao limite inferior desejável (80%).

Adequação do teste de condutividade elétrica para determinar a qualidade fisiológica de sementes de jacarandá-da-bahia (Dalbergia nigra (Vell.) Fr.All. ex Benth.)

Para testar o efeito da temperatura e do tempo de embebição nos valores de condutividade elétrica e verificar sua aplicabilidade para determinar a qualidade fisiológica de sementes de Dalbergia nigra (jacarandá-da-bahia), foram utilizadas sementes colhidos em três anos (lote I _ 1998; lote II _ 1997 e lote III - 1994). Inicialmente determinou-se o teor de água e depois conduziu-se os testes de germinação em laboratório e viveiro, utilizando-se quatro repetições de 25 sementes. Para estudar a condutividade elétrica (CE) foram utilizadas quatro repetições de 50 sementes. Cada subamostra foi colocada em recipiente contendo 75ml de água deionizada, embebidas por 6, 12, 18, 24, 30 e 36 horas, a 20, 25 e 30ºC. Sementes do lote II apresentaram maiores valores na primeira contagem da germinação, diferindo significativamente dos demais lotes. O lote III apresentou qualidade inferior. Com o aumento do período e da temperatura de embebição ocorreu aumento nos valores de CE das sementes dos três lotes. O lote III mostrou qualidade fisiológica inferior a dos lotes I e II, que apresentaram valores mais elevados de CE. Não houve diferenciação entre os lotes I e II. Concluiu-se que o teste de CE foi eficiente para diferenciar os lotes de sementes de Dalbergia nigra, com alto grau de associação com o teste de germinação.

Efeito do número de sementes e do volume de água na condutividade elétrica de sementes de Dalbergia nigra (Vell.) Fr.All. ex Benth.

O presente trabalho teve como objetivos verificar o efeito do número de sementes e do volume de água utilizada no teste de condutividade elétrica (CE) para avaliar o vigor de três lotes de sementes de Dalbergia nigra (jacarandá-da-bahia) e correlacionar esses resultados com os dados de germinação em laboratório e em viveiro. Os testes de germinação em laboratório e viveiro foram conduzidos com quatro repetições de 25 sementes. O teste de CE foi realizado com 25, 50 e 75 sementes embebidas a 75, 100 e 125ml de água, por diferentes períodos. A porcentagem de germinação e de plântulas normais em laboratório, indicaram o lote III como de qualidade inferior aos lotes I e II. A primeira contagem da germinação e o índice de velocidade de germinação em laboratório e a emergência, índice de velocidade de emergência e porcentagem de plântulas normais em viveiro identificaram o lote II como superior ao lote I e o III como inferior. A CE diminui com o aumento do volume de água e aumentou com o período de embebição. A diferenciação dos lotes foi mais eficiente, quando se utilizou 75ml de água deionizada e amostras de 50 sementes com pelo menos 36 horas de embebição, com valores de CE menores nos lotes I e II do que no lote II. Os coeficientes de correlação simples entre a CE e as demais características avaliadas, em laboratório e viveiro, foram elevados e significativos, evidenciando alta associação entre os mesmos. Assim, pode-se recomendar que o teste de CE seja conduzido a 25ºC, com amostras de 50 sementes embebidas em 75ml de água deionizada, por períodos iguais ou superiores a 36 horas de embebição, para determinar a qualidade fisiológica de lotes de sementes de jacarandá-da-bahia.

Germinação de sementes de Sida rhombifolia e Brachiaria decumbens influenciada por vinhaça, flegmaça e óleo de fúsel

Este trabalho objetivou avaliar, em condições de laboratório, a germinação de sementes de Sida rhombifolia e Brachiaria decumbens submetidas à aplicação de vinhaça, flegmaça e óleo de fúsel. Esses subprodutos, nas concentrações de 12,5; 25,0; 50,0; e 100,0% (v/v), e as testemunhas (água com pH e osmolalidade corrigidos, em função da caracterização realizada nos subprodutos e em suas diluições) foram aplicados diretamente em 100 sementes acondicionadas em caixas de plástico, utilizando papel como substrato. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, e as médias obtidas foram submetidas ao teste de Tukey. As sementes de Sida rhombifolia submetidas ao óleo de fúsel não germinaram e apresentaram redução na viabilidade, principalmente nas maiores concentrações de aplicação. As sementes de Brachiaria decumbens submetidas à maior concentração de flegmaça apresentaram tendência de redução da viabilidade e do índice de velocidade de germinação (IVG). Na presença do óleo de fúsel as sementes de Brachiaria decumbens não germinaram e apresentaram-se totalmente inviáveis.

Morfologia de frutos, sementes e plântulas de castanheira (Terminalia catappa L. - COMBRETACEAE)

O trabalho foi realizado com o objetivo de descrever morfologicamente os frutos, sementes e plântulas de castanheira. Foi feita a biometria dos frutos e das sementes e sua caracterização quanto à forma, por meio de mensurações com paquímetro e observações realizadas em estereomicroscópio com câmara clara. Os frutos de castanheira são carnosos, indeiscentes, do tipo nucóide, glabros, de coloração verde a vinácea, projeção das nervuras carpelares externamente evidentes, com epicarpo delgado, mesocarpo carnoso e esponjoso de coloração vinácea, com feixes vasculares conspícuos em corte transversal. Geralmente, cada fruto contém apenas uma semente. As sementes são exalbuminosas, de formas alongadas e cilíndricas, recobertas por endocarpo rígido de coloração marrom; possuem cerca de 2,5cm, 0,7cm e 0,7cm, de comprimento, largura e espessura, respectivamente. A germinação das sementes de castanheira é epígea, e a plantula é fanerocotiledonar.