野生猕猴应激与抗应激的研究

：本文以野生猕猴为实验对象，以血清皮质 醇含量为指标，研究了野生猕猴 被捕获与给予氯丙嗪、Vc等药物后上述指标的变化。结果 表明：(1)野生猕猴在被捕获 后的1～2周内，血清皮质醇一直维持在一个高水平状态(24.7 8±0.20μg/dl，24.88 ±0.58μg/dl)；(2)氯丙嗪可使动物行为处于一种安静状态， 但 并不降低血清皮质醇水 平(28.73±6.16μg/dl)，(3)Vc可改善动物的精神状态，使血清 皮质醇略低(21.00 ±2.90μg/dl)(P＞0.05)，(4)氯丙嗪和Vc合用后，血清皮质 醇与单独使用氯丙嗪无明显 差异(28.07±4.45μg/dl)。

A COMPARATIVE-STUDY OF THE ELBOW JOINTS IN 5 SPECIES OF CHINESE MACAQUES

In this paper, we report the findings of a comparative study of the elbow joints of five species of macaque that inhabit China: Macaca assamensis, M. arctoides, M. mulatta, M. thibetana and M. nemestrina. Results of multivariate analyses of size-related variables and indices of the elbow joint suggested that the breadths of the ventral aspect of the trochlea and of the medial epicondyle of the humerus as well as indices describing the head of the radius are important factors for discriminating these species. The elbow joint of M. arctoides was most similar to that of M. thibetana, no doubt reflecting recency of common ancestry and similarity in terrestrial locomotion. The structures of the elbow joints in M. nemestrina and assamensis seemed more adapted to arboreal quadrupedalism. The elbow joint of M. mulatta, however, appears intermediate between the most terrestrial and the most arboreal forms.

MANDIBULAR MORPHOMETRICS AMONG MACAQUES - THE CASE OF MACACCA-THIBETANA

Recent field studies suggest that Macaca thibetana, a large endemic Chinese macaque, may be quite folivorous, distinguishing it from most other macaque species, which tend to be primarily frugivorous. To understand how this diet affects its masticatory system, we conducted a comparative morphometric study of mandibular dimensions. We took linear measurements from male and female mandibles of this species as well as four other macaques-M. fascicularis, M. nemestrina, M. arctoides, and M. assamensis-and four species of Presbytis-P. obscura, P. rubicunda, P. cristata, and P. phayrei-and subjected to them to a variety of analyses. Based on analyses of variances and discriminant analyses on each sex individually, the mandible of M. thibetana corresponds to expected patterns for folivorous primates with respect to its wide condyles and thick corpora: However, the height of the corpus and symphysis are lower, and the anteroposterior length of the condyle is longer than predicted for a folivore. In addition to interpretations specifically relating to M. thibetana, we also discuss the functional morphology of the other species in light of what is published about their diets.

HORMONAL-REGULATION OF TISSUE-TYPE PLASMINOGEN-ACTIVATOR AND PLASMINOGEN-ACTIVATOR INHIBITOR TYPE-1 IN CULTURED MONKEY SERTOLI CELLS

Sertoli cells play a central role in the control and maintenance of spermatogenesis. Isolated Sertoli cells of mouse and rat testes have been shown to secrete plasminogen activator (PA) and a plasminogen activator inhibitor type-1 (PAI-1) in culture. In this study, we have investigated the hormonal regulation of PA and PAI-1 activities in cultured monkey Sertoli cells. Sertoli cells (5x10(5) cells/well) isolated from infant rhesus monkey testes were preincubated at 35 degrees C for 16 h in 24-well plates precoated with poly(D-lysine) (5 mu g/cm(2)) in 0.5 mi McCoy's 5a medium containing 5% of fetal calf serum and further incubated for 48 h in 0.5 mi serum-free medium with or without various hormones or other compounds, PA as well as PAI-1 activities in the conditioned media were assayed by fibrin overlay and reverse fibrin autography techniques respectively. The Sertoli cells in vitro secreted only tissue-type PA (tPA), no detectable amount of urokinase-type PA (uPA) could be observed, Monkey Sertoli cells were also capable of secreting PAI-1, Immunocytochemical studies indicated that both tPA and PAI-1 positive staining localized in the Sertoli cells, spermatids and residual bodies of the seminiferous epithelium; Northern blot analysis further confirmed the presence of both tPA and PAI-1 mRNA in monkey Sertoli cells. Addition of follicle-stimulating hormone (FSH) or cyclic adenosine monophosphate (cAMP) derivatives or cAMP-generating agents and gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) agonist or phorbol ester (PMA) to the cell culture significantly increased tPA activity. PAI-1 activity in the culture was also enhanced by these reagents except 8-bromo-dibutyryl-cAMP, forskolin and 3-isobutyl-1-methylxanthin (MIX) which greatly stimulated tPA activity, whereas decreased PAI-1 activity, implying that neutralization of PAI-1 activity by tile high level of tPA in the conditioned media may occur. These data suggest that increased intracellular signals which activate protein kinase A (PKA), or protein kinase C (PKC) can modulate Sertoli cell tPA and PAI-1 activities, The concomitant induction of PA and PAI-1 by the same reagents in the Sertoli cells may reflect a finely tuned regulatory mechanism in which PAI-1 could limit the excession of the proteolysis.

Responses to seasonal changes in nutrient quality and patchiness of food in a multigroup community of Tibetan macaques at Mt. Emei

Provisioning along pedestrian trails by tourists much increased the nutrient quality and patchiness of food (NqPF)for Tibetan macaques (Macaca thibetana) at Mt Emei in spring and summer. In the habitat at a temperate-subtropical transition zone, the mncaque's NqPF could be ordered in a decreasing rank from spring summer to autumn to winter With the aid of a radio-tracking system, I collected ranging data on a multigroup community in three 70-day periods representing the different seasons in 1991-92, Rank-order correlation on the data show that with the decline of NqPF; the groups tended to increase days away from the trail, their effective range size (ERS) their exclusive area (EA) and the number of days spent in the EA, and reduced their group/community density and the ratio of the overlapped range to the seasonal range (ROR). In icy/snowy winter; the macaques searched for mature leaves slowly and carefully in the largest seasonal range with a considerable portion that was nor used in other seasons. Of the responses, the ROR decreased with the reduction in group/community density; and the ERS was the function of both group size (+) and intergroup rank (-) when favorite food was highly clumped. All above responses were clearly bound to maximize foraging effectiveness and minimize energy expenditure, and their integration in term of changes in time and space leads to better understanding macaque ecological adaptability. Based on this study and previous work on behavioral and physiological factors, I suggest a unifying theory of intergroup interactions. Ir! addition, as the rate of behavioral interactions,was also related to the group density, I Waser's (1976) gas model probably applies to behavioral, as well as spatial, data on intergroup interactions.

Mandibular variation among Chinese macaques

In order to clarify the degree to which mandibular variation among Chinese macaques results from functional adaptation and phylogenetic inertia, 13 mandibular variables were analyzed by bivariate and multivariate techniques. The results indicate, not surprisingly, that the main differences in the mandible are associated with size. The study further implies that the variation between species is not closely associated with differences in functional adaptation even though the dietary and related differences are large compared to the situation in other macaques. The great variety in diet and related factors among Chinese macaques may not have yet resulted in a significant variation in the mandible. This may be because their radiation in Asia, though involving considerably greater differences in habitat, climate, and so on, has occurred more recently than for other macaque species in Southeast Asia. Mandibular variation between these species, therefore, is likely to be more closely tied to their immediate prior phylogenetic history. For example, the two stump-tailed macaques are closely similar and are also closely similar to the Assam species. Function in the mandible in these species is quite different. The results, therefore, seem to support the hypothesis that these three macaque species should be placed in a single species-group (sinica) as proposed by Delson [1980], Pan [1998], and Pan et al. [1998]. (C) 2002 Wiley-Liss, Inc.

猕猴胚胎干细胞神经分化过程中ASPP家族变化的初步研究

为研究肿瘤细胞凋亡调控因子ASPP(Apoptosis-stimulating protein of p53)家族蛋白(ASPP1,ASPP2,iASPP)在猕猴神经系统细胞早期发育过程中是否存在变化,并初步研究其变化趋势,通过体外诱导猕猴胚胎干细胞定向分化为神经前体细胞模拟猕猴神经系统细胞早期发育过程,并对此过程中细胞内ASPP蛋白量进行检测,检测方法使用细胞免疫荧光和western blotting.实验初步检测出,肿瘤调控因子ASPP家族蛋白在猕猴神经系统细胞早期发育过程中在蛋白量和蛋白分子量上有变化,并且可以初步了解其变化趋势.该实验结果表明ASPP蛋白家族作为肿瘤细胞凋亡调控因子与猕猴神经系统早期发育过程有着密切的关系,这也许对将来治疗神经系统退行性疾病和肿瘤发生有一定帮助.

猕猴结肠镜下活检组织病理学观察

目的通过对猕猴结肠镜检及活检取材，对结肠镜检测方法应用于非人灵长类动物予以评价。方法 实验猴在麻醉状态下接受结肠镜检查和活检标本取材，对活检标本进行固定和病理切片观察，并对所检猴进行解 剖和组织学观察，比较各取材点的情况。结果结肠镜下及大体标本观察见猕猴肠壁厚度明显小于人体，活检取 材部位见黏膜破损、肠出血，个别部位见肠穿孔。病理切片HE 染色观察发现，与人体比较，猕猴大肠腺较小而表 浅，固有层内淋巴小结数量较少，肌层、黏膜下层明显较薄。结论对猕猴行结肠镜检查及镜下活检取材是可行 的，但因猕猴肠壁较人体薄而极易穿孔，故需尽量应用活检杯小的活检钳，并需要充分的肠道准备和有经验的肠镜 操作。

恒河猴TRIM5α 的组织分布及TRIMCyp 限制HIV-1 病毒颗粒产生的初步研究

三重基序蛋白TRIM5α(Tripartite motif protein 5 alpha)是哺乳动物细胞中一种重要的限制因子，广泛分布于各种哺乳动物细胞中。人类TRIM5α mRNA 广泛表达于人类各个组织中，并且I 型干扰素IFN-α/β/γ 均能与TRIM5α 基因启动子的ISRE 元件结合，上调TRIM5α mRNA 的表达。恒河猴(Macaca mulatta)TRIM5α 是恒河猴体内重要的限制因子。目前对恒河猴尤其是中国恒河猴TRIM5α 的组织分布以及在受到外界刺激时TRIM5α mRNA 表达量的变化研究还未见报道。本论文通过从中国恒河猴各组织中提取总RNA，以β-actin 基因作为内参照，通过逆转录PCR 检测各组织中TRIM5α mRNA 的表达。我们选择用HIV-GFP-VSVG 感染、用佛波脂(Phorbol myfismte acetate, PMA)+离子霉素(Ionomycin, Ion)，CD28 抗体+CD49d 抗体分别共刺激恒河猴PBMC，研究不同刺激对中国恒河猴TRIM5α mRNA 表达量的影响。研究发现：TRIM5α mRNA 广泛表达于恒河猴各组织中，在免疫系统和泌尿生殖系统各组织，如腹淋巴结、睾丸和附睾中表达量最高，而在神经系统各组织如大脑、脊髓中表达量比较少，在其他各组织中未见明显的表达差异。此外HIV-GFP-VSVG 感染、PMA+ Ion 与CD28 抗体+CD49d 抗体分别共刺激PBMC 均能促进PBMC TRIM5α mRNA 表达量的上调。 TRIM5α 作为恒河猴体内的最主要的限制HIV-1 感染的限制因子，除了可能通过促进HIV-1 的脱壳和阻止整合前复合物PIC(pre-integration complex)入核，恒河猴TRIM5α 还能限制HIV-1 病毒颗粒的产生。在这个过程中B30.2 结构域是非必需的，而B-box2 和Coiled-Coil 结构域起着决定性的作用。因为鹰猴(Aotes trivirgatus)TRIMCyp(omTRIMCyp) 蛋白和北平顶猴(Macaca leouina) TRIMCyp(npmTRIMCyp）蛋白的B-box2 和Coiled-Coil 结构域与恒河猴TRIM5α 的B-box2 和Coiled-Coil 具有很高的同源性，我们希望了解鹰猴TRIMCyp 蛋白和北平顶猴TRIMCyp 蛋白对HIV-1 病毒颗粒的产生是否有限制作用。本论文主要通过将质粒pNL4.3 分别与质粒pLPCX 、pLPCX-npmTRIMCyp-HA 、 pLPCX-omTRIMCyp-HA和pLPCX-rhTRIM5α-HA共转染293T细胞，通过western blot 检测细胞内Gag 蛋白和TRIM5 蛋白的表达情况，研究omTRIMCyp 蛋白和 npmTRIMCyp 蛋白对HIV-1 病毒颗粒产生的限制作用。结果表明：北平顶猴 TRIMCyp 蛋白、鹰猴TRIMCyp 蛋白都能不同程度的促进HIV-1 病毒Gag 蛋白的降解。

TRIM5-CypA融合基因与北平顶猴易感HIV-1的机制研究

天然免疫分子TRIM5α（tripartite motif protein 5α）是近年来发现的一种重要的宿主细胞内逆转录病毒限制因子。在灵长类动物细胞中，TRIM5α蛋白可以在病毒进入细胞后、逆转录前的阶段抑制HIV-1、N-MLV和EIAV等逆转录病毒的复制。由于TRIM5α分子的作用，绝大部分旧大陆猴（Old World monkey）都不能感染HIV-1。而在新大陆猴（New World monkey）中，鹰猴是唯一不感染HIV-1的灵长类动物。研究证明，鹰猴细胞中存在的TRIM5-CypA融合蛋白（owl monkey TRIM5-CypA，omTRIMCyp）介导了抗HIV-1的作用，从而使鹰猴不能感染HIV-1。研究证明，平顶猴是旧大陆猴中唯一报道可以感染HIV-1的灵长类动物，但是其感染HIV-1的机制并不清楚。根据现行的灵长类动物分类学，原属平顶猴群体（M. nemestrina group）的三个亚种分为猕猴属的三个不同种：巽他平顶猴（Sunda pig-tailed macaque，M. nemestrina），北平顶猴（Northern pig-tailed macaque，M. leonina）和明打威猴（Mentawai macaque，M. pagensis）。本论文对中国云南境内北平顶猴TRIM5基因座和感染HIV-1的相关性进行了研究。通过PCR和测序对北平顶猴基因组TRIM5基因座进行分析，发现一个CypA假基因的cDNA通过逆转座机制插入至TRIM5基因座的3’-UTR区域，形成了一个不同于鹰猴TRIM5-CypA的新型融合基因npmTRIMCyp（northern pig-tailed macaque TRIM5-CypA）。通过RT-PCR对npmTRIMCyp融合基因的转录本进行分析，我们鉴定出npmTRIMCyp共有3种不同的选择性剪接产物，分别为npmTRIMCypV1-V3。进一步克隆和测序这3种不同选择性剪接体，通过丰度和序列分析证实：npmTRIMCypV2是优势剪接体，可能在该融合基因产物的功能中发挥作用。研究发现北平顶猴npmTRIMCyp融合基因主要转录本中外显子7和8均被剪切掉。外显子7剪接丢失机制源于TRIM5第6内含子内 3’剪接位点的G/T突变。我们克隆了npmTRIMCyp融合基因cDNA的蛋白编码区ORF，并构建了重组表达npmTRIMCyp的载体，转染HeLa和HeLa-T4细胞并获得稳定表达的细胞株。通过感染HIV-1证实，npmTRIMCyp融合蛋白不能够限制HIV-1的感染和复制，这可能是北平顶猴作为旧大陆猴中唯一对HIV-1易感的灵长类动物的重要分子机制之一。通过HIV-1感染灵长类动物PBMCs实验证实，北平顶猴可以感染HIV-1。npmTRIMCyp可以有效地限制HIV-2ROD的复制，但对SIVmac239只有十分微弱的限制活性。通过构建鹰猴omTRIMCyp和北平顶猴npmTRIMCyp的置换剪接体（SWAP-1和SWAP-2），转染融合基因及其置换剪接体的CRFK细胞激光共聚焦实验证明，npmTRIMCyp、SWAP1和SWAP2在细胞内主要存在于胞浆中。稳定表达融合蛋白和置换剪接体的CRFK细胞感染HIV-1-GFP-VSVG分析表明，含omTRIMCyp外显子7的SWAP-1和SWAP-2均具有限制HIV-1活性，但SWAP-1的活性更强一些，这表明TRIM5结构域的外显子7可能在介导对HIV-1的限制活性中发挥了协同辅助作用。免疫共沉淀研究表明，npmTRIMCyp不能识别和结合HIV-1的衣壳蛋白。对北平顶猴中介导识别逆转录病毒区域的基因组部分进行了测序，共鉴定出46个多态性位点，表明在北平顶猴识别逆转录病毒衣壳区域存在较高的多态性。

调节性T细胞在SIVmac239感染中国恒河猴中的变化及其机制的初步研究

CD4+CD25+调节性T细胞是1995年才发现的一个具有免疫抑制功能的T细胞亚群，主要通过细胞与细胞间直接接触和分泌抑制性细胞因子发挥作用，在维持机体免疫自稳、防止自身免疫以及肿瘤免疫、移植免疫等方面起着重要作用。有关Treg HIV/SIV病毒感染及AIDS的进展关系密切，但却有两种不同的观点。一种认为Treg的数量和功能受到损伤，从而导致宿主免疫系统过度活化。另一种则认为Treg在早期抑制了针对HIV/SIV的特异性的免疫反应，从而导致机体无法清除感染的病毒。本文利用动物模型对CD4+CD25+调节性T细胞在SIV感染后的数量和功能做了动态的检测，并对其中的机制做了初步的探讨。我们首先建立了SIVmac239病毒株对中国起源的恒河猴感染的动物模型，建立了前病毒的检测方法、血浆病毒载量的测定方法、血浆病毒特异性抗体的测定方法，以及病毒的分离方法，并获得了早期感染的相关数据。在研究中我们发现，SIV感染后的1周后即可在恒河猴外周单个核细胞DNA中检测到前病毒。病毒血症也在1周后出现，并很快达到高峰。不同的个体对病毒感染的体液免疫不尽相同，血浆抗体很快出现，但是99003猴抗体下降很快，而99083猴则保持了一定数量的抗体。同时，伴随SIV的感染进程的还有T淋巴细胞的数量变化，CD4+T细胞数量持续下降，而CD8+T细胞数量则在增加，出现CD4/CD8倒置的现象。以上说明恒河猴被SIV所成功感染。在该动物模型的基础上，我们利用体内传代的SIVmac239病毒株，对4只健康恒河猴进行了感染，并对CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）亚群在数量上的变化进行了检测，并对其中的机制做了初步探讨。我们在研究中发现，外周血中的Treg在SIV感染后无论是绝对数量还是在占CD4+T细胞中的相对数量均有增加，而且Treg仍然保持了对靶细胞的抑制功能。对腹部淋巴结的分析显示，SIV感染后的一段时期内，该部位FoxP3 mRNA的表达水平也在上升，TGF-β、IL-10的转录也显著增加。前者可以通过抑制树突状细胞间接抑制效应细胞，而后者则是一个抑制性的细胞因子，可以直接作用于靶细胞。因此，我们推测SIV引起免疫系统的过度活化可能不是由于Treg功能的受损，其中的机制需要深入研究。 Treg表达CCR5表面分子（HIV辅助受体之一），同时也有CD4分子的表达，因此推测HIV/SIV可以感染Treg。但是国内外这方面的文献很少。我们对Treg中前病毒的检测发现，SIV可以感染Treg，而且对Treg的感染比例高于CD4+CD25－T细胞。这个结果与Treg绝对数量的上升的结果说明，SIV感染Treg但可能却没有杀伤Treg，因此Treg在数量上有所增加。不过，其中的机制仍有待于进一步的研究。在对SIV引起的体液免疫的研究中还发现，机体针对SIV不同抗原的抗体有不同的模式。部分抗原很快就产生了比较强的反应，但是却不能维持高水平的表达。而针对p27蛋白的抗体产生比较晚，但却长时间维持在比较高的水平。是否这样高水平的抗体有助于控制病毒复制是个值得探讨的问题。

树突状细胞亚群在SIVmac239感染中国恒河猴中数量、表型和功能变化及其机制的研究

本论文主要由3 个相对独立的部分组成：中国恒河猴单核细胞来源的树突 状细胞的表型及功能研究；外周血DC 亚群在SIVmac239 感染的中国恒河猴中 数量及细胞因子的变化以及急性感染期SIVmac239 对中国恒河猴外周血DC 亚 群的凋亡和免疫表型的影响。 非人灵长类动物是人类的近亲，由于在组织结构、免疫、生理和代谢等诸 多方面与人类高度近似，科学界较普遍地利用非人灵长类作为动物模型来进行 艾滋病（AIDS）的发病机制和疫苗研究。中国恒河猴发病缓慢，更适合于HIV 感染的相关研究。在本研究中，我们在体外成功培养了中国恒河猴单核细胞来 源的树突状细胞（monocyte derived dendritic cells，MDDC），并测定其表型和免 疫刺激功能。通过GM-CSF 和IL-4 共同刺激培养单核细胞6 天以后便获得了未 成熟MDDC，随后加入IL-1β、PGE2、LPS 和TNF-α 联合刺激MDDC 成熟。 成熟的MDDC 上调了共刺激分子和CD83 的表达，具有很强的刺激T 淋巴细胞 增殖的能力并分泌大量的IL-12。本研究为后续的DC 疫苗研究奠定了基础。 我们实验室建立了SIVmac239 感染的中国恒河猴动物模型。以该模型为依 托，我们研究了外周血中DC 亚群在急性感染期以及慢性感染期的数量、表型 及功能变化。DC 作为最重要的连接先天免疫与获得性免疫的抗原递呈细胞， 在AIDS 发病进程中扮演着重要的角色。研究发现AIDS 患者血液和淋巴结中 髓样DC（myeloid DC，mDC）和浆细胞样DC（plasmacytoid DC，pDC）会随 着感染的进程而减少，并且伴随着功能损伤。本论文通过研究发现，中国恒河 猴的DC 亚群数量在感染后尽管波动十分剧烈，但并没有显著性地增加或减少， 中文摘要 2 在后期DC 数量能够回升到正常的范围之类，这种回升不同于印度恒河猴，很 可能是中国恒河猴缓慢发病的原因之一。进一步通过研究体外刺激DC 亚群分 泌的细胞因子，我们发现在急性感染期，pDC 分泌的IFN-α 显著提高，并很可 能刺激mDC 成熟并促进了IL-12 的分泌。早期大量细胞因子的分泌有助于控制 病毒复制，但同时也激起了整个免疫系统的活化，促进了疾病进程。而在整个 感染阶段，IFN-α 与CD4+ T 细胞呈正相关，而与病毒载量呈负相关，表明了 IFN-α 对于延缓疾病进程具有重要的意义。 我们测定了急性感染期DC 亚群受病毒影响而发生的表型变化，发现pDC 更容易受到病毒影响而发生凋亡，这可能与pDC 高表达SIV 受体CD4 和CCR5 有关。在感染过程中，尽管mDC 和pDC 都显著地下调了CD4 表达，而上调了 CCR5 的表达，不过仅发现pDC CD4 的表达与病毒载量呈负相关，而CCR5 的 表达与病毒载量呈正相关。在此过程中DC 亚群都会因为病毒的影响而活化， 继而提高CCR7 的表达。同时无论mDC 还是pDC，其表达的CD80 和CD86 都与病毒载量呈正相关。在早期感染中，DC 的活化促使整个免疫系统针对病 毒发挥免疫反应，对于控制疾病发展具有重要意义。

猕猴多潜能成体肝前体细胞及猕猴ES 定向分化为胆管上皮细胞的研究

为解决供体器官的不足，以细胞移植为基础的替代疗法已成为治疗不可逆肝 脏疾病新的希望。 肝前体（干）细胞（Hepatic progenitor cellS，HPCs）和 胚胎干细胞（embryoic stem cells, ES）由于其特殊的细胞特性已成为细胞替 代治疗理想的种源细胞。 然而一方面包括人在内的灵长类动物的正常成体肝来 源的HPCs 的分离依然是很困难的；另一方面，ES 细胞来源的肝细胞和胆管细胞 的生成效率依旧很低。因此有必要建立稳定的高效的灵长类动物HPCs 细胞分离 培养体系及ES 细胞的肝细胞或胆管细胞分化体系以满足供体细胞的不足；这种 体系的建立还有利于研究肝细胞生物学如分化机制、自我更新机制等方面的重要 基础问题。 本研究以猕猴为实验模型，研究了正常成体肝来源的猕猴HPCs 分离、纯化 的条件，系统地鉴定了猕猴HPCs 的细胞特性和体内、外分化潜能，并评价了体 内移植效果。 同时以rES 为材料，建立了rES 高效分化为限定性内胚层 （definitive endoderm cells, DE）和胆管上皮细胞的分化体系。主要实验结 果包括：1）： FBS、EGF、HGF 及rat tail collagen (鼠尾胶原)是分离培养正 常成体猕猴来源的肝上皮前体细胞(rhesus monkey liver epithelial progenitor cells, mLEPCs)所必需的，mLEPCs 在此培养体系中至少可以扩增20 代或5 个月以上，并仍然保持原有的细胞特性；mLEPCs 呈现典型的上皮细胞形 态，并表达HPCs 细胞特有的表达模式即同时表达肝细胞和胆管细胞相关基因 （ALB，APOH，CX43，IB4）或蛋白（CK7，CK8，CK18）；在适宜的分化体系下， mLEPCs 可分化为功能性的肝细胞，形成具有胆管上皮细胞的胆管样结构，并能 转分化形成肌肉样细胞、肌样成纤维细胞及少突样细胞；移植入肝损伤的免疫抑 制的小鼠体内后，mLEPCs 能参与受体肝组织的再生，并能分化成ALB 阳性的肝 细胞；体内定位发现mLEPCs 与胆管区的细胞有相似的免疫原性，提示mLEPCs 可能来源于胆管区。2）：rES 在高浓度的acitvin A（100ng/ml）和低浓度的血 清(1%)单层诱导体系下可定向分化得到高比率的限定性内胚层细胞（definitive endoderm cells，DE 细胞）(约80%)； 高比率的DE 细胞的得到还与rES 细胞的接种密度相关；BMP4 和FGF1 可诱导DE 细胞高效向胆管上皮细胞分化（约90%）， 但并不能得到肝细胞；而Notch 信号通路可维持DE 细胞的存活，并决定着DE 细胞向胆管细胞分化，在Notch 信号通路失活的情形下，即使存在BMP4 和FGF1 都不能促使DE 细胞向胆管细胞分化。 本实验首次成功建立了正常猕猴成体肝HPCs 分离培养体系，证实了分离得 到的猕猴肝上皮前体细胞不但具有正常HPCs 的增殖活力和参与受体肝组织的再 生能力，而且还具有三个胚层的分化潜能，这一结果将为以HPCs 为基础的细胞 替代治疗人类肝脏疾病的实现提供了可能，并首次证明了HPCs 也可以像某些少 数成体干细胞一样具有三个胚层得分化潜能。 此外，本研究建立了rES 高效定 向分化为DE 细胞和胆管细胞的分化体系，这一方法的建立将促进灵长类动物的 DE 细胞的发育机制研究，同时也可为高比率的内胚层功能细胞（如胰岛细胞、 肝细胞、肺细胞）的获得提供丰富的种源细胞和平台。

猕猴胚胎干细胞无饲养层、无血清培养及诱导分化成O2A 胶质前体细胞的研究

灵长类胚胎干细胞（ES 细胞）不仅能为研究生殖发育生物学基础理论提供良好的 模型，而且可为细胞替代治疗提供大量的供体细胞，因此具有重要的研究价值。当前 灵长类ES 细胞研究还有很多问题需要解决，如分离建立更多的胚胎干细胞系，优化培 养体系，提高ES 细胞定向分化为特定细胞的比例，研究ES 细胞自我更新和分化的机 制等。本文一方面概括了灵长类ES 细胞的研究进展，另一方面并对制备抗体，免疫外 科手术法分离灵长类胚胎内细胞团，建立猕猴ES 细胞的无饲养层、无血清培养体系和 诱导猕猴ES 细胞分化成高纯度的O2A 神经胶质前体细胞进行了研究。主要结论如下： 1）分别以猕猴脾脏淋巴细胞和人外周血单个核细胞作为免疫原，免疫日本大耳白兔， 得到免疫血清。在补体介导的细胞毒作用下，兔抗人和兔抗猕猴免疫血清可以裂解人 和猕猴囊胚滋养层细胞，从而分离出内细胞团，用于分离培养人和猕猴胚胎干细胞。2） 猕猴ES 细胞在以层粘连蛋白（laminin）为胞外基质，含转化生长因子beta1（TGFβ1） 的无血清培养基（SFM）中可以稳定的增殖至少22 代，保持不分化，并具有分化成三 个胚层细胞的能力。进一步的研究发现去除TGFβ1 后，猕猴ES 细胞出现分化，整合 素表达降低，推测TGFβ1 可能通过促进猕猴ES 细胞整合素的表达，加强其与胞外基 质的相互作用，从而维持ES 细胞的自我更新。然而猕猴ES 细胞不能在纤粘连蛋白 （fibronectin）和明胶上生长。3）无饲养层、无血清培养体系中长期培养的猕猴ES 细 胞，分化出拟胚体，14 天的拟胚体在血清中分化培养一周后，在含碱性成纤维生长因 子bFGF、表皮生长因子EGF 和胰岛素＋转铁蛋白＋亚硒酸钠ITS 的培养基中培养， 获得97％的O2A 胶质前体细胞，得到的O2A 细胞能够稳定增殖，并且可以自发分化 为II 型星型胶质细胞和少突胶质细胞。本实验的结果有助于猕猴ES 细胞分离建系和培 养系统的优化、推动猕猴ES 细胞自我更新和诱导为神经胶质细胞机制的研究，便于建 立ES 细胞替代治疗的猕猴模型，从而为人类ES 细胞的临床疾病治疗提供参考。

猕猴胚胎干细胞培养以及定向分化成神经细胞的研究

灵长类胚胎干细胞（Es）的研究不仅对理解生殖发育生物学的基础理论、而且对实现细胞替代治疗具有重要意义。当前灵长类ES细胞还有很多问题需要解决，如ES细胞培养体系的改进、ES细胞定向分化成高纯度特定组织细胞的可能性、有效性以及分化机制等问题。本文一方面概述了灵长类ES细胞相关领域的研究进展；另一方面，以称猴胚胎干细胞（rEs）为材料，在改善rES细胞的培养体系、提高其定向分化成神经前体细胞（NPs）和少突细胞的比率进行了研究。实验采用同源称猴细胞系作为饲养层培养rES细胞，并在此基础上利用肝生长因子（HGF）和GS诱导rES细胞定向分化成高纯度的NPs和少突细胞，并评价了NPs是否具有移植功能。主要结论如下：1）四种称猴细胞系（MOF、MESF、MFG和CMESF）可作为饲养层支持rES细胞的生长，保持ES自我更新的能力和分化的多能性。而且这几种称猴饲养层支持ES细胞生长的能力存在明显的差异，进一步的研究表明这些差异主要是由于基因表达种类以及表达量上的差异而导致的。2）采用HGF和GS作为诱导因子添加到NDCM液中，诱导rES细胞分化成可移植的NPs。实验结果如下：单独的HGF或GS仅能诱导ES细胞分化成65±8.3％和69±14％NPs，而HGF和GS的联合使用NPs的比率达到88.3±8.1％，进一步纯化后获得98±1.2％的NPs。获得的NPs能在体内、外分化成三个谱系神经细胞，并能整合到大鼠脑部，发生迁移和分化。25％的NPs细胞8周后仍保持存活状态，其中65-80％的细胞发生了不同程度的迁移，而且细胞在脑部的分化种类以及数目与细胞在体内所处的微环境具有重要的关系。亚克隆实验也进一步证明采用HGF＋GS获得的部分单个NPs具有神经干细胞的特性，也能在体内、外分化成三个谱系的神经细胞，而另外的却只能分化成其中的一、两种谱系的细胞。3）利用五步法，ES细胞能分化成75±6.8％的少突祖细胞和81土8．6％的成熟少突细胞。HGF通过抑制NPs的凋亡和缩短NPs的复制周期，共同促进NPs的增殖。HGF也能诱导HGF+G5获得的NPs分化成少突祖细胞和成熟少突细胞，并且促进少突细胞成熟。而且HGF促进NPs分化成少突细胞的能力受到GS的调控，单独HGF作用将导致ES细胞分化成神经元。本实验的结果为促进rES细胞相关领域的研究，以及ES细胞在神经系统疾病临床应用上提供信息，也为研究NPs和少突细胞的发育提供典型的细胞模型。