Interaction between Trypanosoma rangeli and the Rhodnius prolixus salivary gland depends on the phosphotyrosine ecto-phosphatase activity of the parasite

Trypanosoma rangeli is the trypanosomatid that colonizes the salivary gland of its insect vector, with a profound impact on the feeding capacity of the insect. In this study we investigated the role of the phosphotyrosine (P-Tyr) ecto-phosphatase activity of T. rangeli in its interaction with Rhodnius prolixus salivary glands. Long but not short epimastigotes adhered to the gland cells and the strength of interaction correlated with the enzyme activity levels in different strains. Differential interference contrast microscopy demonstrated that clusters of parasites are formed in most cases, suggesting cooperative interaction in the adhesion process. The tightness of the correlation was evidenced by modulating the P-Tyr ecto-phosphatase activity with various concentrations of inhibitors. Sodium orthovanadate, ammonium molybdate and zinc chloride decreased the interaction between T. rangeli and R. prolixus salivary glands in parallel. Levamisole, an inhibitor of alkaline phosphatases, affected neither process. EDTA strongly inhibited adhesion and P-Tyr ecto-phosphatase activity to the same extent, an effect that was no longer seen if the parasites were pre-incubated with the chelator and then washed. When the P-Tyr ecto-phosphatase of living T. ranged epimastigotes was irreversibly inactivated with sodium orthovanadate and the parasite cells were then injected into the insect thorax, colonization of the salivary glands was greatly depressed for several days after blood feeding. Addition of P-Tyr ecto-phosphatase substrates such as p-nitrophenyl phosphate (pNPP) and P-Tyr inhibited the adhesion of T. rangeli to salivary glands, but P-Ser, P-Thr and beta-glycerophosphate were completely ineffective. Immunoassays using anti-P-Tyr-residues revealed a large number of P-Tyr-proteins in extracts of R. prolixus salivary glands, which could be potentially targeted by T. rangeli during adhesion. These results indicate that dephosphorylation of structural P-Tyr residues on the gland cell surfaces, mediated by a P-Tyr ecto-phosphatase of the parasite, is a key event in the interaction between T. rangeli and R. prolixus salivary glands. (C) 2012 Australian Society for Parasitology Inc. Published by Elsevier Ltd. All rights reserved.

Antibacterial compound from the endophytic fungus Phomopsis longicolla isolated from the tropical red seaweed Bostrychia radicans

Endophytic fungi isolated from the red seaweed Bostrychia radicans were studied to identify their molecularly diverse and biologically active natural chemical products. According to 28S ribosomal DNA-based identification, the strain named C81 was 98% identical to Phomopsis longicolla. This strain was cultivated in solid rice medium and produced three major metabolites identified as 18-deoxycytochalasin H (1), mycophenolic acid (2), and dicerandrol C (3). The chemical structures of these compounds were elucidated by 1D and 2D nuclear magnetic resonance as well as by mass spectrometry. Dicerandrol C had significant antimicrobial activity against Staphylococcus aureus (ATCC 6538) and Staphylococcus saprophyticus (ATCC 15305), with minimum inhibitory concentrations of 1 and 2 mu g ml(-1) (1.33 and 2.66 mu M), respectively. These results show the presence of promising metabolites and indicate that these natural products should be considered in the development of new antibiotics.

PCBs, PBDEs and organochlorine pesticides in crabs Hepatus pudibundus and Callinectes danae from Santos Bay, State of Sao Paulo, Brazil

The occurrence of persistent organic pollutants (POPS) as polychlorinated biphenyls (PCBs), organochlorine pesticides (OCPs) and polybrominated diphenyl ethers (PBDE) in crabs Hepatus pudibundus and Callinectes danae was assessed from two different places inside of the Santos Bay and Moela Island near one of the most economically important metropolitan areas in Southern Brazil. Among POPs analyzed, Sigma PCBs (222-923 ng g(-1) lipid weight) and Sigma DDTs (154-410 ng g(-1) lw) exhibited the highest concentrations in the crabs. Sigma HCHs ranged from 10.3 to 30.9 ng g(-1), lw and were found in all individuals. Other OCPs found in lower concentration was Mirex (7.6-41.6 ng g(-1) lw) and HCB (5.83-16.9 ng g(-1) lw). Sigma PBDEs (24.1 ng g(-1) lw) were only found in one male individual from the species C. danae collected near to the submarine sewage of Santos. Male crabs showed higher POP concentrations than female crabs for those two species. (C) 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.

New insights on reaction pathway selectivity promoted by crown ether phase-transfer catalysis: Model ab initio calculations of nucleophilic fluorination

Crown ethers have the ability of solubilizing inorganic salts in apolar solvents and to promote chemical reactions by phase-transfer catalysis. However, details on how crown ethers catalyze ionic S(N)2 reactions and control selectivity are not well understood. In this work, we have used high level theoretical calculations to shed light on the details of phase-transfer catalysis mechanism of KF reaction with alkyl halides promoted by 18-crown-6. A complete analysis of the of the model reaction between KF(18-crown-6) and ethyl bromide reveals that the calculations can accurately predict the product ratio and the overall kinetics. Our results point out the importance of the K* ion and of the crown ether ring in determining product selectivity. While the K* ion favors the S(N)2 over the E2 anti pathway, the crown ether ring favors the S(N)2 over E2 syn route. The combination effects lead to a predicted 94% for the S(N)2 pathway in excellent agreement with the experimental value of 92%. A detailed analysis of the overall mechanism of the reaction under phase-transfer conditions also reveals that the KBr product generated in the nucleophilic fluorination acts as an inhibitor of the 18-crown-6 catalyst and it is responsible for the observed slow reaction rate. (C) 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.

Effects of the antimycobacterial compound 2-phenoxy-1-phenylethanone on rat hepatocytes and formation of metabolites

Context: Neolignans are usually dimers formed by oxidative coupling of allyl and propenyl phenols, and the neolignan analogue, 2-phenoxy-1-phenylethanone (LS-2) is a promising antimycobacterial compound showing very weak cytotoxicity in mammalian cells and lack of acute toxicity in murine models. Objectives: To investigate the mechanism of action of LS-2 in rat hepatocytes by evaluating the activity levels of enzymes related to oxidation status and drug-metabolizing activity. Materials and methods: Hepatocytes were treated with LS-2 from 0.05 up to 1 mM, for 24 and 48 h, and reduced glutathione (GSH), lipid peroxidation and cytochrome P450 enzyme (CYP450) activity were assayed. A homologous series of phenoxazone ethers were used as substrates to measure the enzymatic profile. The biotransformation of LS-2 was studied in hepatocytes by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) for detection and analysis of possible metabolites. Results: Hepatocytes treated with LS-2 up to 1 mM for 24 or 48 h did not induce the formation of GSH and lipid peroxidation. O-Dealkylation activities of the isoenzymes CYP4501A1, CYP4501A2, CYP4502B1 and CYP4502B2 were also not detected in the hepatocytes treated with LS-2 for 24 or 48 h. Discussion and conclusion: The results indicate that LS-2 or its two detected metabolites, 2-phenoxy-1-phenylethanol and 2,4-(2-hydroxy-2-phenylethoxy) phenol, are not cytotoxic to rat hepatocytes. These compounds maintain a balance between the production of pro-oxidant agents and their respective antioxidant systems. The data show that enzymes related to oxidation status and drug-metabolizing activities are not involved in the mechanism of action of LS-2.

Improvement of fungal arabinofuranosidase thermal stability by reversible immobilization

A gene encoding a-L-arabinofuranosidase (abfA) from Aspergillus niveus was identified, cloned, and successfully expressed in Aspergillus nidulans. Based on amino acid sequence comparison, the 88.6 kDa enzyme could be assigned to the GH family 51. The characterization of the purified recombinant AbfA revealed that the enzyme was active at a limited pH range (pH 4.0-5.0) and an optimum temperature of 70 degrees C. The AbfA was able to hydrolyze arabinoxylan, xylan from birchwood, debranched arabinan, and 4-nitrophenyl arabinofuranoside. Synergistic reactions using both AbfA and endoxylanase were also assessed. The highest degree of synergy was obtained after the sequential treatment of the substrate with endoxylanase, followed by AbfA, which was observed to release noticeably more reducing sugars than that of either enzyme acting individually. The immobilization of AbfA was performed via ionic adsorption onto various supports: agarose activated by polyethyleneimine polymers, cyanogen bromide activated Sepharose, DEAE-Sepharose, and Sepharose-Q The Sepharose-Q derivative remained fully active at pH 5 after 360 min at 60 degrees C, whereas the free AbfA was inactivated after 60 min. A synergistic effect of arabinoxylan hydrolysis by AbfA immobilized in Sepharose-Q and endoxylanase immobilized in glyoxyl agarose was also observed. The stabilization of arabinofuranosidases using immobilization tools is a novel and interesting topic. (C) 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Prey digestion in the midgut of the predatory bug Podisus nigrispinus (Hemiptera: Pentatomidae)

Pre-oral digestion is described as the liquefaction of the solid tissues of the prey by secretions of the predator. It is uncertain if pre-oral digestion means pre-oral dispersion of food or true digestion in the sense of the stepwise bond breaking of food polymers to release monomers to be absorbed. Collagenase is the only salivary proteinase, which activity is significant (10%) in relation to Podisus nigrispinus midgut activities. This suggests that pre-oral digestion in P. nigrispinus consists in prey tissue dispersion. This was confirmed by the finding of prey muscles fibers inside P. nigrispinus midguts. Soluble midgut hydrolases from P. nigrispinus were partially purified by ion-exchange chromatography, followed by gel filtration. Two cathepsin L-like proteinases (CAL1 and CAL2) were isolated with the properties: CAL1 (14.7 kDa, pH optimum (pHo) 5.5, km with carbobenzoxy-Phe-Arg-methylcoumarin, Z-FR-MCA, 32 mu M); CAL2 (17 kDa, pHo 5.5, km 11 mu M Z-FR-MCA). Only a single molecular species was found for the other enzymes with the following properties are: amylase (43 kDa, pHo 5.5, km 0.1% starch), aminopeptidase (125 kDa, pHo 5.5, km 0.11 mM L-Leucine-p-nitroanilide), alpha-glucosidase (90 kDa, pHo 5.0, km 5 mM with p-nitrophenyl alpha-D-glucoside). CAL molecular masses are probably underestimated due to interaction with the column. Taking into account the distribution of hydrolases along P. nigrispinus midguts, carbohydrate digestion takes place mainly at the anterior midgut, whereas protein digestion occurs mostly in middle and posterior midgut, as previously described in seed- sucker and blood-feeder hemipterans. (C) 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.

A novel xylan degrading beta-D-xylosidase: purification and biochemical characterization

Aspergillus ochraceus, a thermotolerant fungus isolated in Brazil from decomposing materials, produced an extracellular beta-xylosidase that was purified using DEAE-cellulose ion exchange chromatography, Sephadex G-100 and Biogel P-60 gel filtration. beta-xylosidase is a glycoprotein (39 % carbohydrate content) and has a molecular mass of 137 kDa by SDS-PAGE, with optimal temperature and pH at 70 A degrees C and 3.0-5.5, respectively. beta-xylosidase was stable in acidic pH (3.0-6.0) and 70 A degrees C for 1 h. The enzyme was activated by 5 mM MnCl2 (28 %) and MgCl2 (20 %) salts. The beta-xylosidase produced by A. ochraceus preferentially hydrolyzed p-nitrophenyl-beta-d-xylopyranoside, exhibiting apparent K-m and V-max values of 0.66 mM and 39 U (mg protein)(-1) respectively, and to a lesser extent p-nitrophenyl-beta-d-glucopyranoside. The enzyme was able to hydrolyze xylan from different sources, suggesting a novel beta-d-xylosidase that degrades xylan. HPLC analysis revealed xylans of different compositions which allowed explaining the differences in specificity observed by beta-xylosidase. TLC confirmed the capacity of the enzyme in hydrolyzing xylan and larger xylo-oligosaccharides, as xylopentaose.

N-4-Phenyl-substituted 2-acetylpyridine thiosemicarbazones: Cytotoxicity against human tumor cells, structure-activity relationship studies and investigation on the mechanism of action

N-4-Phenyl 2-acetylpyridine thiosemicarbazone (H2Ac4Ph; N-(phenyl)-2-(1-(pyridin-2-yl)ethylidene) hydrazinecarbothioamide) and its N-4-ortho-, -meta- and -para-fluorophenyl (H2Ac4oFPh, H2Ac4mFPh, H2Ac4pFPh), N-4-ortho-, -meta- and -para-chlorophenyl (H2Ac4oClPh, H2Ac4mClPh, H2Ac4pClPh), N-4-ortho-, -meta- and -para-iodophenyl (H2Ac4oIPh, H2Ac4mIPh, H2Ac4pIPh) and N-4-ortho-, -meta- and -para-nitrophenyl (H2Ac4oNO(2)Ph, H2Ac4mNO(2)Ph, H2Ac4pNO(2)Ph) derivatives were assayed for their cytotoxicity against human malignant breast (MCF-7) and glioma (T98G and U87) cells. The compounds were highly cytotoxic against the three cell lineages (IC50: MCF-7, 52-0.16 nM; T98G, 140-1.0 nM; U87, 160-1.4 nM). All tested thiosemicarbazones were more cytotoxic than etoposide and did not present any haemolytic activity at up to 10(-5) M. The compounds were able to induce programmed cell death. H2Ac4pClPh partially inhibited tubulin assembly at high concentrations and induced cellular microtubule disorganization. (C) 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Conformation and Stereodynamic of Hindered Aromatic System

The preparation of conformationally hindered molecules and their study by DNMR and computational methods are my thesis’s core. In the first chapter, the conformations and the stereodynamics of symmetrically ortho-disubstituted aryl carbinols and aryl ethers are described. In the second chapter, the structures of axially chiral atropisomers of hindered biphenyl carbinols are studied. In the third chapter, the steric barriers and the -barrier of 1,8-di-aylbiphenylenes are determined. Interesting atropisomers are found in the cases of arylanthrones, arylanthraquinones and arylanthracenes and are reported in the fourth chapter. By the combined use of dynamic NMR, ECD spectroscopy and DFT computations, the conformations and the absolute configurations of 2-Naphthylalkylsulfoxides are studied in the fifth chapter. In the last chapter, a new synthetic route to ,’-arylated secondary or tertiary alcohols by lithiated O-benzyl-carbamates carrying an N-aryl substituent and DFT calculations to determinate the cyclic intermediate are reported. This work was done in the research group of Prof. Jonathan Clayden, at the University of Manchester.

NMR studies on supramolecular aggregates in solution and the solid state

The aim of this work presented here is the characterization of structure and dynamics of different types of supramolecular systems by advanced NMR spectroscopy. One of the characteristic features of NMR spectroscopy is based on its high selectivity. Thus, it is desirable to exploit this technique for studying structure and dynamics of large supramolecular systems without isotopic enrichment. The observed resonance frequencies are not only isotope specific but also influenced by local fields, in particular by the distribution of electron density around the investigated nucleus. Barbituric acid are well known for forming strongly hydrogen-bonded complexes with variety of adenine derivatives. The prototropic tautomerism of this material facilitates an adjustment to complementary bases containing a DDA(A = hydrogen bond acceptor site, D = hydrogen bond donor site) or ADA sequences, thereby yielding strongly hydrogen-bonded complexes. In this contribution solid-state structures of the enolizable chromophor "1-n-butyl-5-(4-nitrophenyl)-barbituric acid" that features adjustable hydrogen-bonding properties and the molecular assemblies with three different strength of bases (Proton sponge, adenine mimetic 2,6-diaminopyridine (DAP) and 2,6-diacetamidopyridine (DAC)) are studied. Diffusion NMR spectroscopy gives information over such interactions and has become the method of choice for measuring the diffusion coefficient, thereby reflecting the effective size and shape of a molecular species. In this work the investigation of supramolecular aggregates in solution state by means of DOSY NMR techniques are performed. The underlying principles of DOSY NMR experiment are discussed briefly and more importantly two applications demonstrating the potential of this method are focused on. Calix[n]arenes have gained a rather prominent position, both as host materials and as platforms to design specific receptors. In this respect, several different capsular contents of tetra urea calix[4]arenes (benzene, benzene-d6, 1-fluorobenzene, 1-fluorobenzene-d5, 1,4-difluorobenzene, and cobaltocenium) are studied by solid state NMR spectroscopy. In the solid state, the study of the interaction between tetra urea calix[4]arenes and guest is simplified by the fact that the guests molecule remains complexed and positioned within the cavity, thus allowing a more direct investigation of the host-guest interactions.

1,2-Additionen deprotonierter Alpha-Aminonitrile: Umgepolte Imine als vielseitige Synthesebausteine

Von aromatischen Aldehyden abgeleitete α-Aminonitrile können ohne die Anwendung von Schutzgruppen in α-Position deprotoniert werden, wenn keine lithiumhaltigen Basen verwendet werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Reaktionen deprotonierter α-Aminonitrile mit Elektrophilen zu untersuchen. Die Addition von α-Aminocarbanionen an Imine führt unter intramolekularer Eliminierung von HCN zu Endiaminen, die sich in einer Eintopfsynthese abhängig von der Aufarbeitung in 1,2-Diamine oder 1,2-Diimine umwandeln lassen. Die nach Oxidation durch Luftsauerstoff erhaltenen Diimine können mit dem Reduktionsmittel BH3·THF diastereoselektiv reduziert werden. Es hat sich hier gezeigt, dass durch Zugabe einer katalytischen Menge an NaBH4 hauptsächlich die syn-Diamine erhalten werden, der Zusatz von Phthalsäure wiederum liefert bevorzugt die anti-Produkte. In beiden Fällen wird das Produkt in quantitativer Ausbeute erhalten. So konnte also eine effektive diastereoselektive Reduktionsmethode entwickelt werden, die eine freie Wahl der syn- oder anti-Konfiguration ermöglicht. Um enantiomerenreine 1,2-Diamine zu erhalten, wurden verschiedene Methoden getestet. Sowohl auxiliargesteuerte Synthesen mit einem N-Glycosyl-Aminonitril oder mit chiralen Sulfinyliminen als auch die Reduktion durch chirale Borverbindungen (CBS-Katalysatoren, Triacyloxyborhydrid oder Diisopinocamphenylboran), Transferhydrierungen mit chiralen Difluortitanocen-, Noyori- oder Organophosphat-Katalysatoren sowie enantioselektive Hydrierungen mit chiralen Übergangsmetall-katalysatoren waren jedoch nicht erfolgreich. Die Umsetzung der 1,2-Diimine mit Chlormethylethern oder -estern liefert die entsprechenden unsymmetrischen Imidazoliumsalze. Diese konnten zu N-heterocyclischen Carbenen deprotoniert und erfolgreich als Liganden in Suzuki- und Heck-Reaktionen eingesetzt werden. Durch die 1,2-Addition α-deprotonierter Streckerprodukte und anschließende Reduktion im Eintopfverfahren konnten 1,2-Aminoalkohole in mäßigen bis guten Ausbeuten dargestellt werden. Die Umsetzung von α-Aminocarbanionen mit N-Acyliminen erlaubt zudem die Synthese tetrasubstituierter Imidazole und trisubstituierter Oxazole in drei beziehungsweise vier Stufen: Die zunächst gebildeten α-Amino-α-acylaminopropionitrile können isoliert und in Gegenwart von Base einer Retro-Strecker-Reaktion unterworfen werden. Abhängig vom Substitutionsmuster schließt sich in manchen Fällen nach der Eliminierung von HCN direkt die Cyclisierung zum Imidazol an. Nicht cyclisierte Intermediate lassen sich durch Dehydratisierung mit PCl5 zu Imidazolen umsetzen, aber auch unter sauren Bedingungen zu α-Acylaminoketonen hydrolysieren, welche wiederum durch Einwirkung von PCl5 in Oxazole überführt werden können. Auf diese Weise wurden Imidazole und Oxazole in moderaten bis hohen Gesamtausbeuten hergestellt.

Synthese und photophysikalische Eigenschaften funktionalisierter 1-Oligoalkinylamide

Synthese und photophysikalische Eigenschaften funktionalisierter 1-Oligoalkinylamide Torsten Schweikert Zusammenfassung der Dissertation zur Erlangung des Grades „Doktor der Naturwissenschaften“ Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand aus der Synthese verschiedener 1-Oligoalkinylamide und deren Funktionalisierung mit endständigen Akzeptoreinheiten, um einen Zugang zu konjugierten Donor-Akzeptor-substituierten Acetylenchromophoren zu realisieren, welche die Aminogruppe direkt am Acetylenkohlenstoff tragen. In einer kupfer(I)-katalysierten Cadiot-Chodkiewicz-Reaktion konnten terminale 1-Alkinylamide 1 mit verschiedenen substituierten 1-Bromalkinen 2 zu den 1-Oligoalkinylamiden 3 umgesetzt werden. Die Reaktion zeichnet sich durch eine hohe Toleranz gegenüber verschiedenen funktionellen Gruppen aus und lieferte die 1-Oligoalkinylamide 3 in Ausbeuten von 34 bis 99 %. NR1EWGNR2R1EWGR2Br5 Mol-% CuI30 Mol-% NH2OH·H2O2.0 Äquiv. n-BuNH2MeOH0 °C - 40 °C, 0.5 - 2 h34 - 99 %1.5 Äquiv. 213R1: Phenyl, 2-Iodphenyl, Benzyl, AlkylR2: Alkyl, Hydroxyalkyl, O-Tetrahydropyranyloxyalkyl, Methylester, 4-Nitrophenyl, 4-Cyanophenyl, 4-Dimesitylborylphenylnn Mittels UV/Vis-Spektroskopie sind die verschiedenen Donor-Akzeptor-substituierten Chromophore auf ihre photophysikalischen Eigenschaften hin untersucht worden. Dabei zeigten sich verschiedene Effekte bei Variation der Donor- und Akzeptorgruppen sowie bei Verlängerung der Acetylenbrücke auf die Lage der Charge-Transfer-Bande. Die Solvatochromie der Absorptionsbanden zeigte das Vorhandensein eines permanenten Dipolmoments der Verbindungen. Die elektrooptische Absorptionsmessung konnte schließlich Informationen über die Größe der Dipolmomente im Grundzustand und im angeregten Franck-Condon-Zustand liefern. Die elektrischen Dipolmomente der Verbindungen im Grundzustand in 1,4-Dioxan und Cyclohexan liegen im Bereich von (9.4 – 12.2)10-30 Cm. Nach optischer Anregung erhöhen sich die Dipolmomente um (25.0 – 92.3)10-30 Cm, wobei die Änderung des Dipolmoments bei optischer Anregung ein Maximum für die 1-Diinylamide durchläuft und bei drei konjugierten Acetylenbindungen stark abnimmt. Die synthetisierten 1-Diinylamide fanden ferner Anwendung in der Synthese von funktionalisierten 3-Alkinylindolen, wobei mittels einer palladiumkatalysierten Heteroanellierungssequenz in 2-Position am Indol ein Schwefel- oder Stickstoffnucleophil eingeführt werden konnte.

New Methods in Organocatalysis

In the following chapters new methods in organocatalysis are described. The design of new catalysts is explored starting from the synthesis and the study of ion tagged prolines to their applications and recycle, then moving to the synthesis of new bicyclic diarylprolinol silyl ethers and their use in organocatalytic transformations. The study of new organocatalytic reaction is also investigated, in particular bifunctional thioureas are employed to catalyse the conjugate addition of nitro compounds to 3-yilidene oxindoles in sequential and domino reactions. Finally, preliminary results on photochemical organocatalytic atom transfer radical addition to alkenes are discussed in the last chapter.

Biochemical analysis of the phosphatase domain of the human soluble epoxide hydrolase (sEH)

Die lösliche Epoxidhydrolase (sEH) gehört zur Familie der Epoxidhydrolase-Enzyme. Die Rolle der sEH besteht klassischerweise in der Detoxifikation, durch Umwandlung potenziell schädlicher Epoxide in deren unschädliche Diol-Form. Hauptsächlich setzt die sEH endogene, der Arachidonsäure verwandte Signalmoleküle, wie beispielsweise die Epoxyeicosatrienoic acid, zu den entsprechenden Diolen um. Daher könnte die sEH als ein Zielenzym in der Therapie von Bluthochdruck und Entzündungen sowie diverser anderer Erkrankungen eingesetzt werden. rnDie sEH ist ein Homodimer, in dem jede Untereinheit aus zwei Domänen aufgebaut ist. Das katalytische Zentrum der Epoxidhydrolaseaktivität befindet sich in der 35 kD großen C-terminalen Domäne. Dieser Bereich der sEH s wurde bereits im Detail untersucht und nahezu alle katalytischen Eigenschaften des Enzyms sowie deren dazugehörige Funktionen sind in Zusammenhang mit dieser Domäne bekannt. Im Gegensatz dazu ist über die 25 kD große N-terminale Domäne wenig bekannt. Die N-terminale Domäne der sEH wird zur Haloacid Dehalogenase (HAD) Superfamilie von Hydrolasen gezählt, jedoch war die Funktion dieses N-terminal Domäne lange ungeklärt. Wir haben in unserer Arbeitsgruppe zum ersten Mal zeigen können, dass die sEH in Säugern ein bifunktionelles Enzym ist, welches zusätzlich zur allgemein bekannten Enzymaktivität im C-terminalen Bereich eine weitere enzymatische Funktion mit Mg2+-abhängiger Phosphataseaktivität in der N-terminalen Domäne aufweist. Aufgrund der Homologie der N-terminalen Domäne mit anderen Enzymen der HAD Familie wird für die Ausübung der Phosphatasefunktion (Dephosphorylierung) eine Reaktion in zwei Schritten angenommen.rnUm den katalytischen Mechanismus der Dephosphorylierung weiter aufzuklären, wurden biochemische Analysen der humanen sEH Phosphatase durch Generierung von Mutationen im aktiven Zentrum mittels ortsspezifischer Mutagenese durchgeführt. Hiermit sollten die an der katalytischen Aktivität beteiligten Aminosäurereste im aktiven Zentrum identifiziert und deren Rolle bei der Dephosphorylierung spezifiziert werden. rnrnAuf Basis der strukturellen und möglichen funktionellen Ähnlichkeiten der sEH und anderen Mitgliedern der HAD Superfamilie wurden Aminosäuren (konservierte und teilweise konservierte Aminosäuren) im aktiven Zentrum der sEH Phosphatase-Domäne als Kandidaten ausgewählt.rnVon den Phosphatase-Domäne bildenden Aminosäuren wurden acht ausgewählt (Asp9 (D9), Asp11 (D11), Thr123 (T123), Asn124 (N124), Lys160 (K160), Asp184 (D184), Asp185 (D185), Asn189 (N189)), die mittels ortsspezifischer Mutagenese durch nicht funktionelle Aminosäuren ausgetauscht werden sollten. Dazu wurde jede der ausgewählten Aminosäuren durch mindestens zwei alternative Aminosäuren ersetzt: entweder durch Alanin oder durch eine Aminosäure ähnlich der im Wildtyp-Enzym. Insgesamt wurden 18 verschiedene rekombinante Klone generiert, die für eine mutante sEH Phosphatase Domäne kodieren, in dem lediglich eine Aminosäure gegenüber dem Wildtyp-Enzym ersetzt wurde. Die 18 Mutanten sowie das Wildtyp (Sequenz der N-terminalen Domäne ohne Mutation) wurden in einem Expressionsvektor in E.coli kloniert und die Nukleotidsequenz durch Restriktionsverdau sowie Sequenzierung bestätigt. Die so generierte N-terminale Domäne der sEH (25kD Untereinheit) wurde dann mittels Metallaffinitätschromatographie erfolgreich aufgereinigt und auf Phosphataseaktivität gegenüber des allgemeinen Substrats 4-Nitophenylphosphat getestet. Diejenigen Mutanten, die Phosphataseaktivität zeigten, wurden anschließend kinetischen Tests unterzogen. Basiered auf den Ergebnissen dieser Untersuchungen wurden kinetische Parameter mittels vier gut etablierter Methoden berechnet und die Ergebnisse mit der „direct linear blot“ Methode interpretiert. rnDie Ergebnisse zeigten, dass die meisten der 18 generierten Mutanten inaktiv waren oder einen Großteil der Enzymaktivität (Vmax) gegenüber dem Wildtyp verloren (WT: Vmax=77.34 nmol-1 mg-1 min). Dieser Verlust an Enzymaktivität ließ sich nicht durch einen Verlust an struktureller Integrität erklären, da der Wildtyp und die mutanten Proteine in der Chromatographie das gleiche Verhalten zeigten. Alle Aminosäureaustausche Asp9 (D9), Lys160 (K160), Asp184 (D184) und Asn189 (N189) führten zum kompletten Verlust der Phosphataseaktivität, was auf deren katalytische Funktion im N-terminalen Bereich der sEH hindeutet. Bei einem Teil der Aminosäureaustausche die für Asp11 (D11), Thr123 (T123), Asn124 (N124) und Asn185 (D185) durchgeführt wurden, kam es, verglichen mit dem Wildtyp, zu einer starken Reduktion der Phosphataseaktivität, die aber dennoch für die einzelnen Proteinmutanten in unterschiedlichem Ausmaß zu messen war (2 -10% and 40% of the WT enzyme activity). Zudem zeigten die Mutanten dieser Gruppe veränderte kinetische Eigenschaften (Vmax allein oder Vmax und Km). Dabei war die kinetische Analyse des Mutanten Asp11  Asn aufgrund der nur bei dieser Mutanten detektierbaren starken Vmax Reduktion (8.1 nmol-1 mg-1 min) und einer signifikanten Reduktion der Km (Asp11: Km=0.54 mM, WT: Km=1.3 mM), von besonderem Interesse und impliziert eine Rolle von Asp11 (D11) im zweiten Schritt der Hydrolyse des katalytischen Zyklus.rnZusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass alle in dieser Arbeit untersuchten Aminosäuren für die Phosphataseaktivität der sEH nötig sind und das aktive Zentrum der sEH Phosphatase im N-terminalen Bereich des Enzyms bilden. Weiterhin tragen diese Ergebnisse zur Aufklärung der potenziellen Rolle der untersuchten Aminosäuren bei und unterstützen die Hypothese, dass die Dephosphorylierungsreaktion in zwei Schritten abläuft. Somit ist ein kombinierter Reaktionsmechanismus, ähnlich denen anderer Enzyme der HAD Familie, für die Ausübung der Dephosphorylierungsfunktion denkbar. Diese Annahme wird gestützt durch die 3D-Struktur der N-terminalen Domäne, den Ergebnissen dieser Arbeit sowie Resultaten weiterer biochemischer Analysen. Der zweistufige Mechanismus der Dephosphorylierung beinhaltet einen nukleophilen Angriff des Substratphosphors durch das Nukleophil Asp9 (D9) des aktiven Zentrums unter Bildung eines Acylphosphat-Enzym-Zwischenprodukts, gefolgt von der anschließenden Freisetzung des dephosphorylierten Substrats. Im zweiten Schritt erfolgt die Hydrolyse des Enzym-Phosphat-Zwischenprodukts unterstützt durch Asp11 (D11), und die Freisetzung der Phosphatgruppe findet statt. Die anderen untersuchten Aminosäuren sind an der Bindung von Mg 2+ und/oder Substrat beteiligt. rnMit Hilfe dieser Arbeit konnte der katalytischen Mechanismus der sEH Phosphatase weiter aufgeklärt werden und wichtige noch zu untersuchende Fragestellungen, wie die physiologische Rolle der sEH Phosphatase, deren endogene physiologische Substrate und der genaue Funktionsmechanismus als bifunktionelles Enzym (die Kommunikation der zwei katalytischen Einheiten des Enzyms) wurden aufgezeigt und diskutiert.rn