Análise dos aspectos biológicos e epidemiológicos de cepas de Escherichia coli associadas à infecção do trato urinário (ITU)

A invasão de bactérias no trato urinário caracteriza a infecção do sistema urinário. A Escherichia coli é o principal microrganismo associado a esta infecção devido a sua importância em causar ITU, recebeu a denominação de UPEC (Escherichia coli uropatogênica). No presente trabalho pesquisamos em 50 cepas de UPEC, inicialmente isolados de urina de pacientes ambulatoriais com infecções sintomática ou assintomática, a presença de 7 fatores de virulência, através das técnicas de PCR simples e multiplex para verificação dos genes que codificam adesinas P (pap) , fímbria S (sfa), adesina afimbrial (afa), sideroforo (aerobactina- aer), toxinas fator necrotizante citotóxico (cnf) e alfa-hemolisinas (hly), proteína de membrana (traT); ilhas de patogenicidade (virulência) através do marcador PAI. O marcador pCVD432 de EAEC também foi pesquisado nestas amostras. O método difusão em disco foi o utilizado para a determinação dos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos. Podemos observar duas faixas etárias de maior incidência de ITU entre as mulheres: 19 a 35 anos, e acima de 50 anos. Sessenta e oito por cento das amostras apresentaram pelo menos um fator de virulência, onde os genes traT (54%) e aer (34%) foram os mais prevalentes. A sequência pCVD432 foi detectado em 6 amostras. No entanto, no ensaio de adesão em células Hep-2, doze amostras não apresentaram aderência (NA 24%). Nas 38 cepas restantes, 24 (48%) apresentaram aderência agregativa (AA). Observamos aderência sem padrão típico (SPT) em 48% das amostras, tendo sido dividido em discreto (SPT-D 22%), moderado (SPT-M 18%) e intenso (SPT-I 8%). Notamos os seguintes perfis de resistência para os antimicrobianos testados: ampicilina (44%), gentamicina (8%), nitrofurantoína (2%), norfloxacino (18%) e sulfametozaxol-trimetoprima (34%).

Sinusite odontogénica

Monografia apresentada à Universidade Fernando Pessoa para obtenção do grau de Licenciada em Medicina Dentária.

Disseminação horizontal de genes que codificam para β-lactamases de espectro alargado em isolados de enterobacteriaceae de origem hospitalar

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Engenharia de Tecidos na substituição de tecido ósseo

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Unidade de Estudos de Mastites em Pequenos Ruminantes - estudos em ovinos de regime extensivo

A “Unidade de Estudo de Mastites em Pequenos Ruminantes”, formalmente constituída no âmbito do Programa Nacional de Re-equipamento Científico, da Fundação para a Ciência e a Tecnologia, vem dar corpo ao trabalho de colaboração de diversas equipas de investigação que se têm debruçado sobre a problemática das infecções intramamárias em pequenos ruminantes, nos seus aspectos de saúde animal, saúde pública veterinária e qualidade e segurança alimentar. Tem como principal objectivo criar condições para o desenvolvimento de trabalhos de investigação e divulgação científica que contribuam para reduzir a prevalência de mastites em pequenos ruminantes e assim melhorar a produção e a qualidade do leite, favorecendo produtores de leite, produtores de queijo e consumidores. Entre os trabalhos já realizados, pela equipa científica, destaca-se o isolamento e identificação de agentes etiológicos de mastite em ovelhas e estudos epidemiológicos relativos a esta afecção, o estudo de factores de virulência nas bactérias mais relevantes, o estudo dos mecanismos de infecção e a resposta imunológica local e sistémica do hospedeiro. O estudo da etiologia e da fisiopatologia da mastite ovina, com o objectivo de compreender a modulação da resposta imunitária da glândula mamária, poderá contribuir para o desenvolvimento de métodos de controlo com base na estimulação da resposta imunitária, alternativos ao uso de antibióticos.

Educação sexual em contexto escolar: uma intervenção contra a vulnerabilidade na vivência da sexualidade adolescente

A sexualidade estando presente desde o nascimento, na adolescência assume novo significado. Descobre-se o primeiro amor através de uma relação de intimidade e partilha de afectos, o corpo adquire um novo sentido, o grupo torna-se importante enquanto fonte de suporte, partilha de angústias e confiança, contribuindo para o desenvolvimento do adolescente. Na adolescência, perscrutam alguns factores de risco, nomeadamente a vivência da sexualidade de forma não informada e responsável, com repercussões para a saúde física e psicológica, pelo que é imperioso intervir através de programas formativos no âmbito da sexualidade que promovam vivência desta de forma responsável. São objectivos do estudo: Promover um modelo de intervenção formativa baseado no debate e reflexão crítica sobre sexualidade em contexto de sala de aula; Construir e validar instrumentos que permitam avaliar as atitudes face à sexualidade e ainda os conhecimentos dos adolescentes sobre reprodução, planeamento familiar e infecções de transmissão sexual; Testar a eficácia de um programa de intervenção formativo a nível dos conhecimentos sobre planeamento familiar, infecções de transmissão sexual, reprodução e atitudes face à sexualidade; Testar a efectividade do programa de intervenção formativo numa amostra alargada de adolescentes, analisando também o papel das variáveis sociodemográficas, sociopsicológicas e sexuais. O trabalho de campo desenvolveu-se em três estudos distintos, no primeiro e terceiro participaram 840 adolescentes e no segundo 90. No primeiro estudo construímos e validamos os instrumentos para colheita de dados, no segundo, experimental de campo, validamos o modelo da intervenção formativa no âmbito da sexualidade e no terceiro, descritivo e correlacional, testamos a efectividade de um programa de intervenção numa amostra mais alargada. O protocolo de recolha de informação incluiu quatro escalas construídas para o efeito com o intuito de avaliar as atitudes face à sexualidade, os conhecimentos sobre planeamento familiar, infecções de transmissão sexual e reprodução e ainda a escala de insatisfação com a imagem corporal em adolescentes e a escala de satisfação com o suporte social. As raparigas e residentes na zona urbana são as que têm mais conhecimentos sobre planeamento familiar e possuem atitudes face à sexualidade mais favoráveis. Os interlocutores preferenciais sobre sexualidade são os amigos, seguidos da mãe. São os adolescentes com pouca ou moderada prática religiosa que já iniciaram a actividade sexual. São as raparigas que têm maior satisfação com o suporte social nas dimensões, satisfação com as amizades, intimidade, actividades sociais e suporte social total. Os adolescentes que já iniciaram a actividade sexual, revelam maior percepção de suporte social na dimensão satisfação com a amizade. O modelo de formação construído e aplicado influenciou as atitudes face à sexualidade, conhecimentos sobre reprodução, sobre infecções de transmissão sexual e sobre planeamento familiar. Do nosso ponto de vista, pensamos ser urgente a aplicação de programas de intervenção formativos em contexto escolar, ou outro, que integrem de uma forma harmoniosa as várias facetas da sexualidade humana, promovendo a aquisição de uma postura responsável, flexível e gratificante nos adolescentes enquanto seres sexuados.

Carbapenemases of Serratia fonticola UTAD54

As carbapenemases, serínicas e metalo-β-lactamases (MBLs), formam um grupo cada vez mais importante de β-lactamases capazes de tornar as bactérias resistentes a antibióticos β-lactâmicos, incluindo carbapenemos utilizados como antibióticos de último recurso no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes. De modo a compreender melhor a relação estrutura-função deste grupo de enzimas, prosseguimos com a caracterização bioquímica e estrutural das carbapenemases SFC-1 e Sfh-I específicas de Serratia fonticola UTAD54, uma estirpe ambiental isolada previamente de águas de consumo não tratadas no Nordeste de Portugal. Ambas as β-lactamases foram sobre-expressas em Escherichia coli e purificadas por cromatografia líquida. A SFC-1 recombinante, uma carbapenemase serínica, hidrolisa eficientemente antibióticos β-lactâmicos de todas as classes e exibe, comparativamente a enzimas relacionadas (ex. KPC), uma maior eficiência contra a ceftazidima e uma menor susceptibilidade aos inibidores convencionais das β-lactamases. As estruturas do cristal da SFC-1 nativa e de complexos de mutantes, obtidos por mutagénese dirigida, com o meropenemo não hidrolisado e na forma de acetilenzima foram determinados por substituição molecular utilizando cristalografia de raios-X. A estrutura da SFC-1 contém todas as características conservadas do centro activo das carbapenemases de classe A. Nas estruturas dos mutantes o meropenemo aparece orientado no centro activo por Thr236 e Thr238, posicionando-o próximo da Ser130 para a transferência do protão. Nas enzimas de classe A inibidas por carbapenemos, a interacção com a Arg244 impõe uma orientação diferente do meropenemo ligado, prejudicando a transferência do protão. Estas constituem as primeiras estruturas de uma carbapenemase de classe A com um carbapenemo no centro activo e revelam que estas enzimas alteram a orientação do meropenemo ligado para promover a catálise, sem alteração significativa da estrutura geral. A Sfh-I, tal como as outras MBLs da subclasse B2, apresenta um perfil de substratos reduzido, que inclui maioritariamente os carbapenemos. A Sfh-I hidrolisa imipenemo e meropenemo com um kcat de 51 e 109 s-1 e um KM de 79 e 215 μM, respectivamente. A Sfh-I liga um equivalente de zinco, como demonstrado por espectrometria de massa. Contrariamente a enzimas da subclasse B2 previamente caracterizadas, a Sfh-I hidrolisa a cefepima, mostrando que a Sfh-I é uma MBL da subclasse B2 com propriedades únicas. Por espectroscopia de fluorescência mostrou-se que a Sfh-I é capaz de ligar até 3 equivalentes de zinco (Kd2 = 95 μM; Kd3 = 2.3 mM). A estrutura do cristal da Sfh-I, determinada por substituição molecular utilizando a CphA como modelo, é a primeira para uma MBL da subclasse B2 não ligada. Esta estrutura revela a disposição das moléculas de água no centro activo corroborando um mecanismo catalítico para as MBLs da subclasse B2 no qual a His118, em vez do Asp120 proposto anteriormente, activa a molécula de água nucleofílica.

Resistance to last-resort antibiotics in natural environments

Last-resort antibiotics are the final line of action for treating serious infections caused by multiresistant strains. Over the years the prevalence of resistant bacteria has been increasing. Natural environments are reservoirs of antibiotic resistance, highly influenced by human-driven activities. The importance of aquatic systems on the evolution of antibiotic resistance is highlighted from the assumption that clinically-relevant resistance genes have originated in strains ubiquitous in these environments. We hypothesize that: a) rivers are reservoirs and disseminators of antibiotic resistance; b) anthropogenic activities potentiate dissemination of resistance to last-resort antibiotics. Hence, the main goal of the work is to compare the last-resort antibiotics resistome, in polluted and unpolluted water. Rivers from the Vouga basin, exposed to different anthropogenic impacts, were sampled. Water quality parameters were determined to classify rivers as unpolluted or polluted. Two bacterial collections were established enclosing bacteria resistant to cefotaxime (3rd generation cephalosporin) and to imipenem (carbapenem). Each collection was characterized regarding: phylogenetic diversity, antibiotic susceptibility, resistance mechanisms and mobile genetic elements. The prevalence of cefotaxime- and imipenem-resistant bacteria was higher in polluted water. Results suggested an important role in the dissemination of antibiotic resistance for Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Aeromonas. The occurrence of bacteria resistant to non-beta-lactams was higher among isolates from polluted water as also the number of multiresistant strains. Among strains resistant to cefotaxime, extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) genes were detected (predominantly blaCTX-M-like) associated to mobile genetic elements previously described in clinical strains. ESBL-producers were often multiresistant as a result of co-selection mechanisms. Culture-independent methods showed clear differences between blaCTX-M-like sequences found in unpolluted water (similar to ancestral genes) and polluted water (sequences identical to those reported in clinical settings). Carbapenem resistance was mostly related to the presence of intrinsically resistant bacteria. Yet, relevant carbapenemase genes were detected as blaOXA-48-like in Shewanella spp. (the putative origin of these genes), and blaVIM-2 in Pseudomonas spp. isolated from polluted rivers. Culture-independent methods showed an higher than the previously reported diversity of blaOXA-48-like genes in rivers. Overall, clear differences between polluted and unpolluted systems were observed, regarding prevalence, phylogenetic diversity and susceptibility profiles of resistant bacteria and occurrence of clinically relevant antibiotic resistance genes, thus validating our hypotheses. In this way, rivers act as disseminators of resistance genes, and anthropogenic activities potentiate horizontal gene transfer and promote the constitution of genetic platforms that combine several resistance determinants, leading to multiresistance phenotypes that may persist even in the absence of antibiotics.

Development of polymeric materials to inhibit bacterial quorum sensing

Bacterial infections are an increasing problem for human health. In fact, an increasing number of infections are caused by bacteria that are resistant to most antibiotics and their combinations. Therefore, the scientific community is currently searching for new solutions to fight bacteria and infectious diseases, without promoting antimicrobial resistance. One of the most promising strategies is the disruption or attenuation of bacterial Quorum Sensing (QS), a refined system that bacteria use to communicate. In a QS event, bacteria produce and release specific small chemicals, signal molecules - autoinducers (AIs) - into the environment. At the same time that bacterial population grows, the concentration of AIs in the bacterial environment increases. When a threshold concentration of AIs is reached, bacterial cells respond to it by altering their gene expression profile. AIs regulate gene expression as a function of cell population density. Phenotypes mediated by QS (QSphenotypes) include virulence factors, toxin production, antibiotic resistance and biofilm formation. In this work, two polymeric materials (linear polymers and molecularly imprinted nanoparticles) were developed and their ability to attenuate QS was evaluated. Both types of polymers should to be able to adsorb bacterial signal molecules, limiting their availability in the extracellular environment, with expected disruption of QS. Linear polymers were composed by one of two monomers (itaconic acid and methacrylic acid), which are known to possess strong interactions with the bacterial signal molecules. Molecularly imprinted polymer nanoparticles (MIP NPs) are particles with recognition capabilities for the analyte of interest. This ability is attained by including the target analyte at the synthesis stage. Vibrio fischeri and Aeromonas hydrophila were used as model species for the study. Both the linear polymers and MIP NPs, tested free in solutions and coated to surfaces, showed ability to disrupt QS by decreasing bioluminescence of V. fischeri and biofilm formation of A. hydrophila. No significant effect on bacterial growth was detected. The cytotoxicity of the two types of polymers to a fibroblast-like cell line (Vero cells) was also tested in order to evaluate their safety. The results showed that both the linear polymers and MIP NPs were not cytotoxic in the testing conditions. In conclusion, the results reported in this thesis, show that the polymers developed are a promising strategy to disrupt QS and reduce bacterial infection and resistance. In addition, due to their low toxicity, solubility and easy integration by surface coating, the polymers have potential for applications in scenarios where bacterial infection is a problem: medicine, pharmaceutical, food industry and in agriculture or aquaculture.

Infection mechanism of Diplodia corticola

Diplodia corticola is regarded as the most virulent fungus involved in cork oak decline, being able to infect not only Quercus species (mainly Q. suber and Q. ilex), but also grapevines (Vitis vinifera) and eucalypts (Eucalyptus sp.). This endophytic fungus is also a pathogen whose virulence usually manifests with the onset of plant stress. Considering that the infection normally culminates in host death, there is a growing ecologic and socio-economic concern about D. corticola propagation. The molecular mechanisms of infection are hitherto largely unknown. Accordingly, the aim of this study was to unveil potential virulence effectors implicated in D. corticola infection. This knowledge is fundamental to outline the molecular framework that permits the fungal invasion and proliferation in plant hosts, causing disease. Since the effectors deployed are mostly proteins, we adopted a proteomic approach. We performed in planta pathogenicity tests to select two D. corticola strains with distinct virulence degrees for our studies. Like other filamentous fungi D. corticola secretes protein at low concentrations in vitro in the presence of high levels of polysaccharides, two characteristics that hamper the fungal secretome analysis. Therefore, we first compared several methods of extracellular protein extraction to assess their performance and compatibility with 1D and 2D electrophoretic separation. TCA-Acetone and TCA-phenol protein precipitation were the most efficient methods and the former was adopted for further studies. The proteins were extracted and separated by 2D-PAGE, proteins were digested with trypsin and the resulting peptides were further analysed by MS/MS. Their identification was performed by de novo sequencing and/or MASCOT search. We were able to identify 80 extracellular and 162 intracellular proteins, a milestone for the Botryosphaeriaceae family that contains only one member with the proteome characterized. We also performed an extensive comparative 2D gel analysis to highlight the differentially expressed proteins during the host mimicry. Moreover, we compared the protein profiles of the two strains with different degrees of virulence. In short, we characterized for the first time the secretome and proteome of D. corticola. The obtained results contribute to the elucidation of some aspects of the biology of the fungus. The avirulent strain contains an assortment of proteins that facilitate the adaptation to diverse substrates and the identified proteins suggest that the fungus degrades the host tissues through Fenton reactions. On the other hand, the virulent strain seems to have adapted its secretome to the host characteristics. Furthermore, the results indicate that this strain metabolizes aminobutyric acid, a molecule that might be the triggering factor of the transition from a latent to a pathogenic state. Lastly, the secretome includes potential pathogenicity effectors, such as deuterolysin (peptidase M35) and cerato-platanin, proteins that might play an active role in the phytopathogenic lifestyle of the fungus. Overall, our results suggest that D. corticola has a hemibiotrophic lifestyle, switching from a biotrophic to a necrotrophic interaction after plant physiologic disturbances.This understanding is essential for further development of effective plant protection measures.

Identification of molecules and pathways regulating mistranslation in Candida albicans

Candida albicans is the major fungal pathogen in humans, causing diseases ranging from mild skin infections to severe systemic infections in immunocompromised individuals. The pathogenic nature of this organism is mostly due to its capacity to proliferate in numerous body sites and to its ability to adapt to drastic changes in the environment. Candida albicans exhibit a unique translational system, decoding the leucine-CUG codon ambiguously as leucine (3% of codons) and serine (97%) using a hybrid serine tRNA (tRNACAGSer). This tRNACAGSer is aminoacylated by two aminoacyl tRNA synthetases (aaRSs): leucyl-tRNA synthetase (LeuRS) and seryl-tRNA synthetase (SerRS). Previous studies showed that exposure of C. albicans to macrophages, oxidative, pH stress and antifungals increases Leu misincorporation levels from 3% to 15%, suggesting that C. albicans has the ability to regulate mistranslation levels in response to host defenses, antifungals and environmental stresses. Therefore, the hypothesis tested in this work is that Leu and Ser misincorporation at CUG codons is dependent upon competition between the LeuRS and SerRS for the tRNACAGSer. To test this hypothesis, levels of the SerRS and LeuRS were indirectly quantified under different physiological conditions, using a fluorescent reporter system that measures the activity of the respective promoters. Results suggest that an increase in Leu misincorporation at CUG codons is associated with an increase in LeuRS expression, with levels of SerRS being maintained. In the second part of the work, the objective was to identify putative regulators of SerRS and LeuRS expression. To accomplish this goal, C. albicans strains from a transcription factor knock-out collection were transformed with the fluorescent reporter system and expression of both aaRSs was quantified. Alterations in the LeuRS/SerRS expression of mutant strains compared to wild type strain allowed the identification of 5 transcription factors as possible regulators of expression of LeuRS and SerRS: ASH1, HAP2, HAP3, RTG3 and STB5. Globally, this work provides the first step to elucidate the molecular mechanism of regulation of mistranslation in C. albicans.

Avaliação da eficiência de higienização em cantinas

Dissertação de mest., Engenharia Biológica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2009

Desenvolvimento de um sistema multidimensional para classificação e gestão de informação em saúde: aplicabilidade à informação clínica

Introdução: A profusão de informação na área médica cria problemas de gestão, sendo necessários métodos sistematizados para armazenamento e recuperação. Quando a informação se insere no contexto do processo clínico, os métodos devem integrar terminologias biomédicas controladas e igualmente devem integrar as características desejáveis dirigidas à estrutura, conteúdo e resultados clínicos. O objectivo deste artigo é testar a aplicabilidade e capacidade de recuperação, de um sistema multidimensional desenvolvido para classificação e gestão de informação em saúde. Métodos: A partir das questões recebidas em seis anos (Serviço de Informação de Medicamentos, Serviços Farmacêuticos, Hospitais da Universidade de Coimbra), seleccionaram-se 300 questões sobre informação clínica, por método aleatório informatizado. Caracterizou-se e avaliou-se a aplicabilidade pela quantidade classificada e pela necessidade de alterações ao sistema que é constituído por várias dimensões independentes e que englobam conceitos por vezes hierarquizados. A recuperação das questões foi testada pesquisando informação numa dimensão ou cruzamento de dimensões. Resultados: Todas as questões foram classificadas: 53% são casos clínicos com incidência nas doenças geniturinárias; doenças metabólicas, nutricionais e endócrinas; neoplasias; infecções e doenças do sistema nervoso. Em 81%, o objecto é o medicamento, sobretudo anti-infecciosos e anti-neoplásicos. As áreas de terapêutica e segurança foram as mais solicitadas, incidindo principalmente sobre os assuntos: utilização, reacções adversas, identificação de medicamentos e tecnologia farmacêutica. Na aplicabilidade, foi necessário adicionar alguns conceitos e modificar alguns grupos hierárquicos que não modificaram a estrutura base, nem colidiram com as características desejáveis. As limitações prenderam-se com os sistemas de classificação externos integrados. A pesquisa na dimensão assunto, do conceito administração de medicamentos, recuperou 19 questões. O cruzamento de duas dimensões: anti-infecciosos (externa) e teratogenicidade (assunto), recuperou três questões. Nos dois exemplos recupera-se informação a partir de qualquer um dos níveis da hierarquia, do mais geral ao mais específico e mesmo a partir de dimensões externas. Conclusões: A utilização do sistema nesta amostra demonstrou aplicabilidade na classificação e arquivo de informação clínica, capacidade de recuperação e flexibilidade, sofrendo alterações sem interferir com as características desejáveis. Esta ferramenta permite a recuperação da evidência que interessa orientada para o doente. Introduction: The large amount of information in the medical area creates management problems, being necessary systematic methods for filing and retrieval. With information on the context of clinical records, methods must integrate controlled biomedical terminologies and desirable characteristics oriented to the structure, content and clinical results. The objective is to test the applicability and capacity for retrieval of a multidimensional system developed for classification and management of health information. Methods: Three hundred questions were randomly selected, by computerized method, from the questions received in six years (Medicine Information Service, Pharmaceutical Department, Coimbra University Hospitals). They were characterized and applicability evaluated by classified amount and need to alter the system, which is composed of various independent dimensions, incorporating concepts sometimes hierarchical. Questions retrieval was tested searching information in a dimension or between dimensions. Results: All questions were classified: 53% are clinical cases with illnesses incidence in the genitourinary system; metabolic, nutritional and endocrine disease; cancer; infections and nervous system. In 81%, the object is a drug, mostly anti-infectious and anti-neoplastic agents. The therapeutic and safety areas had been the most requested, regarding the subjects: use, adverse reactions, drug identification and pharmaceutical technology. As to applicability, it was necessary to add some concepts and modify same hierarchical groups, that didn’t modify the basic structure, nor had collided with the desirable characteristics. The limitations were related with the incorporated external classification systems. The search in the subject dimension of the concept drug administration retrieved 19 questions. The search between two dimensions: antiinfectious (external) and teratogenicity (subject) retrieved three questions. In the two examples, it was possible to retrieve information from any one of the levels of the hierarchy, from the most general to the most specific and even from external dimensions. Conclusions: The use of the system in this sample showed its applicability in clinical information classification and filing, retrieval capacity and flexibility, supporting modifications without interfering with desirable characteristics. This tool allows retrieval of patient-oriented evidence that matters.

New approaches for the diagnosis of human papillomavirus infection:relevance for clinical practice and cancer prevention

Tese de doutoramento, Biologia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014

Peroxide-based hybrid and prodrug antimalarials to deliver cysteine protease inhibitors into the parasitic food vacuole

Tese de doutoramento, Farmácia (Química Farmacêutica e Terapêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014