Infection mechanism of Diplodia corticola

Diplodia corticola is regarded as the most virulent fungus involved in cork oak decline, being able to infect not only Quercus species (mainly Q. suber and Q. ilex), but also grapevines (Vitis vinifera) and eucalypts (Eucalyptus sp.). This endophytic fungus is also a pathogen whose virulence usually manifests with the onset of plant stress. Considering that the infection normally culminates in host death, there is a growing ecologic and socio-economic concern about D. corticola propagation. The molecular mechanisms of infection are hitherto largely unknown. Accordingly, the aim of this study was to unveil potential virulence effectors implicated in D. corticola infection. This knowledge is fundamental to outline the molecular framework that permits the fungal invasion and proliferation in plant hosts, causing disease. Since the effectors deployed are mostly proteins, we adopted a proteomic approach. We performed in planta pathogenicity tests to select two D. corticola strains with distinct virulence degrees for our studies. Like other filamentous fungi D. corticola secretes protein at low concentrations in vitro in the presence of high levels of polysaccharides, two characteristics that hamper the fungal secretome analysis. Therefore, we first compared several methods of extracellular protein extraction to assess their performance and compatibility with 1D and 2D electrophoretic separation. TCA-Acetone and TCA-phenol protein precipitation were the most efficient methods and the former was adopted for further studies. The proteins were extracted and separated by 2D-PAGE, proteins were digested with trypsin and the resulting peptides were further analysed by MS/MS. Their identification was performed by de novo sequencing and/or MASCOT search. We were able to identify 80 extracellular and 162 intracellular proteins, a milestone for the Botryosphaeriaceae family that contains only one member with the proteome characterized. We also performed an extensive comparative 2D gel analysis to highlight the differentially expressed proteins during the host mimicry. Moreover, we compared the protein profiles of the two strains with different degrees of virulence. In short, we characterized for the first time the secretome and proteome of D. corticola. The obtained results contribute to the elucidation of some aspects of the biology of the fungus. The avirulent strain contains an assortment of proteins that facilitate the adaptation to diverse substrates and the identified proteins suggest that the fungus degrades the host tissues through Fenton reactions. On the other hand, the virulent strain seems to have adapted its secretome to the host characteristics. Furthermore, the results indicate that this strain metabolizes aminobutyric acid, a molecule that might be the triggering factor of the transition from a latent to a pathogenic state. Lastly, the secretome includes potential pathogenicity effectors, such as deuterolysin (peptidase M35) and cerato-platanin, proteins that might play an active role in the phytopathogenic lifestyle of the fungus. Overall, our results suggest that D. corticola has a hemibiotrophic lifestyle, switching from a biotrophic to a necrotrophic interaction after plant physiologic disturbances.This understanding is essential for further development of effective plant protection measures.

Diplodia corticola é considerado o fungo mais virulento associado ao declínio do sobreiro, infectando não só espécies de Quercus (na maioria Q. suber e Q. ilex), como também videiras (Vitis vinifera) e eucaliptos (Eucalyptus sp.). Este fungo endofítico é também um patógeno, cuja virulência se manifesta reiteradamente com o aparecimento de stress na planta. Considerando que a infeção culmina frequentemente na morte do hospedeiro, a sua propagação gera uma crescente preocupação a nível ecológico e socio-económico. Os mecanismos moleculares da infeção permanecem até agora largamente desconhecidos. Por conseguinte, o objectivo deste estudo é revelar potenciais fatores de virulência implicados na infeção de D. corticola. Este conhecimento é essencial para delinear a estrutura molecular que lhe permite invadir e proliferar nos seus hospedeiros, causando doença. Como os efetores utilizados são na sua maioria proteínas, adoptou-se uma abordagem proteómica. Foram realizados testes de patogenicidade in planta para seleccionar duas estirpes de D. corticola com graus de virulência distintos, para os estudos que se subseguiram. À semelhança de outros fungos filamentosos, D. corticola secreta concentrações diminutas de proteínas in vitro, assim como elevados níveis de polissacáridos, duas características que dificultam a análise do secretoma. Assim, compararam-se vários métodos de extracção de proteínas extracelulares para averiguar o seu desempenho e compatibilidade com a separação electroforética por 1D e 2D. A precipitação de proteínas com TCA-acetona e TCA-fenol foram os métodos mais eficientes, tendo-se seleccionado o primeiro para os estudos ulteriores. As proteínas foram extraídas, separadas por 2D-PAGE, digeridas com tripsina e os péptidos resultantes analisados por MS/MS. A sua identificação foi efetuada por sequenciação de novo e/ou por pesquisa no MASCOT. Deste modo, identificaram-se 80 proteínas extracelulares e 162 intracelulares, um marco para a família Botryosphaeriaceae que contém apenas um membro com o proteoma caracterizado. Realizou-se também uma extensa análise comparativa dos géis 2D para evidenciar as proteínas expressas de forma diferenciada durante a mimetização de infeção. Foram ainda comparados os perfis proteicos de duas estirpes com diferentes graus de virulência. Em suma, caracterizou-se pela primeira vez o secretoma e proteoma de D. corticola. Os resultados obtidos contribuiram ainda para a elucidação de alguns aspetos da biologia do fungo. A estirpe avirulenta contém um leque variado de proteínas que facilitam a adaptação a vários substratos, e as proteínas identificadas sugerem que este fungo degrada os tecidos dos hospedeiros recorrendo a reações de Fenton. Além disso, constatou-se que esta estirpe metaboliza ácido aminobutírico, uma molécula que poderá ser o factor desencadeante da transição do estado latente para patogénico. Por fim, o secretoma inclui potenciais factores de patogenicidade como a deuterolisina (peptidase M35) e a cerato-platanina, proteínas que poderão desempenhar um papel activo no modo de vida fitopatogénico do fungo. De forma geral, os resultados sugerem que D. corticola tem um estilo de vida hemibiotrófico, transitando de uma interacção biotrófica para necrotrófica após a ocorrência de distúrbios fisiológicos da planta. Esta percepção é essencial para o futuro desenvolvimento de medidas efectivas de protecção das plantas.

Diplodia corticola behoort tot de meest virulente plantenpathogene schimmels en wordt verantwoordelijk geacht voor de achteruitgang van de kurkeik populatie. Ze infecteert niet alleen Quercus soorten (voornamelijk Q. suber en Q. ilex), maar ook wijnstokken (Vitis vinifera) en eucalyptus (Eucalyptus sp.). Deze endofytische schimmel is een pathogeen waarvan de virulentie zich meestal manifesteert wanneer de plant een stress ervaart, bijvoorbeeld bij droogte. Gelet op het feit dat de infectie meestal fataal is voor de gastheerplant, is er een groeiende ecologische en sociaal-economische bezorgdheid over D. corticola. De moleculaire mechanismen vande infectie zijn tot nu toe echter grotendeels onbekend. Het doel van deze studie was dan ook om potentiële virulentie effectoren betrokken bij D. corticola infectie te ontdekken, wat ons een fundamentele kennis moet opleveren over het moleculaire arsenaal waarmee de schimmel invasie en proliferatie kan uitvoeren in plantgastheren. Aangezien dergelijke effectoren meestal eiwitten zijn, kozen we voor proteoomanalyse als benadering van de problematiek. Wij zijn gestart met het testen van in planta pathogeniciteit testen van verschillende stammen op basis waarvan twee D. corticola stammen met verschillende virulentiegraadwerden geselecteerd voor verdere studies. Zoals andere filamenteuze schimmelssecreteert D. corticola in vitro relatief lage gehalten van eiwittenin aanwezigheid van grote hoeveelheden polysacchariden, wat de analyse van het secretoom bemoeilijkt. Daarom, vergeleken we eerst verschillende methoden voor de extractie van extracellulaire eiwitten op basis van hun performantie en compatibiliteit met 1D en 2D elektroforetische scheiding. Eiwitprecipitatie met TCA-aceton en TCA-fenol bleken de meest efficiënte methoden, de eerste methode werd uitgekozen voor de verdere analysen. Eiwitten werden vervolgens geëxtraheerd en gescheiden via 2D-PAGE, en de peptiden werden verder geanalyseerd met MS/MS. De eiwitten werden geïdentificeerd door de novo sequentiebepaling en/of MASCOT als zoekroutine. Wij konden op deze manier 80 extracellulaire eiwitten en 162 intracellulaire identificeren, een mijlpaal voor de studies binnen de Botryosphaeriaceae familie waarvan tot nu toe van slechts drie leden het proteoom werd gekarakteriseerd. Dit werd gekoppeld aan een vergelijkende 2D-PAGE analyse om differentieel geproduceerde proteïnen betrokken bij host-pathogeen interactie te identificeren. Bovendien werden de eiwitprofielen van de twee stammen met verschillende virulentievergeleken. Kortom, voor het eerst werd het secretoom en proteoom van D. corticolain kaart gebracht. De verkregen resultaten kunnen bijdragen tot de opheldering van de biologie van de schimmel. De avirulente stam bevat een assortiment van proteïnen toe dat het organisme toelaat om zich gemakkelijk aan te passen aan diverse omstandigheden en de geïdentificeerde eiwitten suggereren dat de schimmel weefsels van de aangetaste plantdoor Fenton reacties degradeert. Aan de andere kant, lijkt de virulente stam zijn secretoom veel beter aan de gastheerkenmerken te hebben aangepast. Bovendien blijkt uit de resultaten dat deze stam aminoboterzuur kan metaboliseren, een molecule die misschien wel de activerende factor van de overgang van een latente naar een pathogene toestand is.Tenslotte werden eiwitten geïdentificeerd, zoals deuterolysin (dipeptidylpeptidase M35) en cerato-platanin, die een actieve rol in de plantpathogene levensstijl van de schimmel kunnen hebben.Onze resultaten suggereren dat D. corticola een hemibiotrophic levensstijl onderhoudt, waarbij het overschakelt van een biotrofe naar een necrotrofe interactie ten gevolge van plantenfysiologische verstoringen. Deze kennis is van essentieel belang voor de verdere ontwikkeling van effectieve bestrijdingsmiddelen.

Doutoramento em Biologia