Purification and Characterization of AsES Protein A Subtilisin Secreted by Acremonium Strictum is a Novel Plant Defense Elicitor.

In this work, the purification and characterization of an extracellular elicitor protein, designated AsES, produced by an avirulent isolate of the strawberry pathogen Acremonium strictum, are reported. The defense eliciting activity present in culture filtrates was recovered and purified by ultrafiltration (cutoff, 30 kDa), anionic exchange (Q-Sepharose, pH 7.5), and hydrophobic interaction (phenyl-Sepharose) chromatographies. Two-dimensional SDS-PAGE of the purified active fraction revealed a single spot of 34 kDa and pI 8.8. HPLC (C2/C18) and MS/MS analysis confirmed purification to homogeneity. Foliar spray with AsES provided a total systemic protection against anthracnose disease in strawberry, accompanied by the expression of defense-related genes (i.e. PR1 and Chi2-1). Accumulation of reactive oxygen species (e.g. H2O2 and O2̇̄) and callose was also observed in Arabidopsis. By using degenerate primers designed from the partial amino acid sequences and rapid amplification reactions of cDNA ends, the complete AsES-coding cDNA of 1167 nucleotides was obtained. The deduced amino acid sequence showed significant identity with fungal serine proteinases of the subtilisin family, indicating that AsES is synthesized as a larger precursor containing a 15-residue secretory signal peptide and a 90-residue peptidase inhibitor I9 domain in addition to the 283-residue mature protein. AsES exhibited proteolytic activity in vitro, and its resistance eliciting activity was eliminated when inhibited with PMSF, suggesting that its proteolytic activity is required to induce the defense response. This is, to our knowledge, the first report of a fungal subtilisin that shows eliciting activity in plants. This finding could contribute to develop disease biocontrol strategies in plants by activating its innate immunity.

Potentiation of the Oxidative Burst and Isoflavonoid Phytoalexin Accumulation by Serine Protease Inhibitors1

Treatment of soybean (Glycine max L. cv Williams 82) cell-suspension cultures with Pseudomonas syringae pv glycinea (Psg) harboring an avirulence gene (avrA) or with yeast elicitor resulted in an oxidative burst characterized by the accumulation of H2O2. This burst, and the resultant induction of glutathione S-transferase transcripts, occurred more rapidly and was more prolonged if cells were simultaneously treated with serine protease inhibitors such as phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) or diisopropylfluorophosphate. PMSF and diisopropylfluorophosphate potentiate a large oxidative burst in cells exposed to Psg harboring the avrC avirulence gene, which is not recognized by the soybean cultivar used in this study. The potentiated burst was inhibited by diphenylene iodonium, an inhibitor of NADPH oxidase, and by the protein kinase inhibitor K252a. PMSF treatment of elicited cells or cells exposed to Psg:avrA caused a large increase in the accumulation of the isoflavonoid phytoalexin glyceollin; however, this was not associated with increased levels of transcripts encoding key phytoalexin biosynthetic enzymes. Glyceollin accumulation was inhibited by diphenylene iodonium; however, the oxidative burst in cells treated with Psg:avrC and PMSF was not followed by phytoalexin accumulation. We conclude that active oxygen species from the oxidative burst are necessary but not sufficient for inducing isoflavonoid phytoalexin accumulation in soybean cells.

Estimativa de dose nos pulmões para procedimentos de tomografia computadorizada

Desde o seu desenvolvimento na década de 1970 a tomografia computadorizada (TC) passou por grandes mudanças tecnológicas, tornando-se uma importante ferramenta diagnóstica para a medicina. Consequentemente o papel da TC em diagnóstico por imagem expandiu-se rapidamente, principalmente devido a melhorias na qualidade da imagem e tempo de aquisição. A dose de radiação recebida por pacientes devido a tais procedimentos vem ganhando atenção, levando a comunidade científica e os fabricantes a trabalharem juntos em direção a determinação e otimização de doses. Nas últimas décadas muitas metodologias para dosimetria em pacientes têm sido propostas, baseadas especialmente em cálculos utilizando a técnica Monte Carlo ou medições experimentais com objetos simuladores e dosímetros. A possibilidade de medições in vivo também está sendo investigada. Atualmente as principais técnicas para a otimização da dose incluem redução e/ou modulação da corrente anódica. O presente trabalho propõe uma metodologia experimental para estimativa de doses absorvidas pelos pulmões devido a protocolos clínicos de TC, usando um objeto simulador antropomórfico adulto e dosímetros termoluminescentes de Fluoreto de Lítio (LiF). Sete protocolos clínicos diferentes foram selecionados, com base em sua relevância com respeito à otimização de dose e frequência na rotina clínica de dois hospitais de grande porte: Instituto de Radiologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (InRad) e Instituto do Câncer do Estado de São Paulo Octávio Frias de Oliveira (ICESP). Quatro protocolos de otimização de dose foram analisados: Auto mA, Auto + Smart mA, Baixa Dose (BD) e Ultra Baixa Dose (UBD). Os dois primeiros protocolos supracitados buscam redução de dose por meio de modulação da corrente anódica, enquanto os protocolos BD e UBD propõem a redução do valor da corrente anódica, mantendo-a constante. Os protocolos BD e UBD proporcionaram redução de dose de 72,7(8) % e 91(1) %, respectivamente; 16,8(1,3) % e 35,0(1,2) % de redução de dose foram obtidas com os protocolos Auto mA e Auto + Smart mA, respectivamente. As estimativas de dose para os protocolos analisados neste estudo são compatíveis com estudos similares publicados na literatura, demonstrando a eficiência da metodologia para o cálculo de doses absorvidas no pulmão. Sua aplicabilidade pode ser estendida a diferentes órgãos, diferentes protocolos de CT e diferentes tipos de objetos simuladores antropomórficos (pediátricos, por exemplo). Por fim, a comparação entre os valores de doses estimadas para os pulmões e valores de estimativas de doses dependentes do tamanho (Size Specific Dose Estimates SSDE) demonstrou dependência linear entre as duas grandezas. Resultados de estudos similares exibiram comportamentos similares para doses no reto, sugerindo que doses absorvidas pelos uma órgãos podem ser linearmente dependente dos valores de SSDE, com coeficientes lineares específicos para cada órgão. Uma investigação mais aprofundada sobre doses em órgãos é necessária para avaliar essa hipótese.

Tratamento de lesões white spot pelo sistema fosfato de cálcio caseína-fosfopeptideo amorfo (CPP-ACP): prevenção secundária

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz

Rapid depletion of mutant eukaryotic initiation factor 5A at restrictive temperature reveals connections to actin cytoskeleton and cell cycle progression

Eukaryotic initiation factor 5A (eIF5A) is the only protein in nature that contains hypusine, an unusual amino acid derived from the modification of lysine by spermidine. Two genes, TIF51A and TIF51B, encode eIF5A in the yeast Saccharomyces cerevisiae. In an effort to understand the structure-function relationship of eIF5A, we have generated yeast mutants by introducing plasmid-borne tif51A into a double null strain where both TIF51A and TIF51B have been disrupted. One of the mutants, tsL102A strain (tif51A L102A tif51aDelta tif51bDelta) exhibits a strong temperature-sensitive growth phenotype. At the restrictive temperature, tsL102A strain also exhibits a cell shape change, a lack of volume change in response to temperature increase and becomes more sensitive to ethanol, a hallmark of defects in the PKC/WSC cell wall integrity pathway. In addition, a striking change in actin dynamics and a complete cell cycle arrest at G1 phase occur in tsL102A cells at restrictive temperature. The temperature-sensitivity of tsL102A strain is due to a rapid loss of mutant eIF5A with the half-life reduced from 6 h at permissive temperature to 20 min at restrictive temperature. Phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF), an irreversible inhibitor of serine protease, inhibited the degradation of mutant eIF5A and suppressed the temperature-sensitive growth arrest. Sorbitol, an osmotic stabilizer that complement defects in PKC/WSC pathways, stabilizes the mutant eIF5A and suppresses all the observed temperature-sensitive phenotypes.

Frases magnéticas, polaritons magnéticos e modos magnetostáticos em filmes e cristais magnônicos de terras-raras

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

Frases magnéticas, polaritons magnéticos e modos magnetostáticos em filmes e cristais magnônicos de terras-raras

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

ANÁLISE MICROBIANA E DO TEOR DE FLÚOR ADICIONADO À ÁGUA DE ABASTECIMENTO EM UM ESTADO DO NORDESTE DO BRASIL

Objetivo: Analisar os teores de íons de fluoreto e o padrão microbiológico encontrado nas águas de abastecimento público dos municípios alagoanos que fluoretam suas águas. Métodos: Estudo transversal descritivo realizado no período de 2012 a 2014, no qual se analisaram todos os laudos emitidos pelo Laboratório Central de Saúde Pública de Alagoas (LACEN-AL) com os resultados da análise da qualidade da água para consumo humano dos onze municípios alagoanos que fluoretaram suas águas, totalizando 3.089 laudos. Avaliouse o número total de amostras enviadas para análise da qualidade da água, a quantidade de amostras em que foi solicitada a análise de fluoreto, teores e variações dos íons de fluoreto e o padrão microbiológico das amostras fluoretadas. Realizou-se a análise descritiva dos dados, obtendo-se as frequências absolutas e relativas percentuais. Resultados: Foram encontradas 429 (83,9%) amostras coletadas no intervalo 0,0-0,5 mgF/L, número considerado abaixo do recomendável, além de grande variação na concentração dos íons de fluoreto e 128 (26,3%) amostras de água fluoretada fora dos padrões de potabilidade. Conclusão: Os dados mostraram uma grande variação e um alto percentual de amostras com baixas concentrações de fluoreto, assim como a necessidade de melhoria da qualidade da água ofertada, de modo a garantir para a população o acesso contínuo à água potável.

Purificação e caracterização parcial de duas N-acetil-ß-hexosaminidases do Equinoderma marinho Echinometra lucunter

Two b-N-acetylhexosaminidases (F11 e F15) were purified from Echinometra lucunter gonads extracts. The purified enzymes were obtained using ammonium sulfate fractionation, followed by gel filtration chromatographies (Sephacryl S-200, Sephadex G-75 and Sephacryl S-200). The F11 fraction was purified 192.47 -fold with a 28.5% yield, and F15 fraction 85.41 -fold with a 32.3% yield. The molecular weights of the fractions were 116 kDa for F11 and 42 kDa for F15 using SDS-PAGE. In Sephacryl S-200, F15 was 84 kDa, indicating that it is a dimeric protein. When p-nitrophenyl-β-D-glycosaminide was used as substrate, we determined an apparent Km of 0.257 mM and Vmax of 0.704 for F11 and for F15 the Km was 0.235 mM and Vmax of 0.9 mM of product liberated by hour. Both enzymes have optimum pH and temperature respectively at 5.0 and 45 °C. The enzymes showed inhibition by silver nitrate, while the glucuronic acid was a potent activator. The high inhibition of F15 by N-etylmaleimide indicates that sulphydril groups are involved in the catalysis of synthetic substrate

Avaliação da ação bioinseticida de SBTI e vicilina de Erythrina velutina em enzimas digestivas e membrana peritrófica de larvas de Plodia interpunctella (Lepidoptera: Pyralidae)

Plodia interpunctella (Indian meal moth) is a cosmopolitan pest that attacks not only a wide range of stored grain as well other food products. Due to its economic importance several researches have focused in a method with ability to control this pest with few or no damage to the environment. The study of digestive enzymes inhibitors, lectins and chitin-binding proteins, has often been proposed as an alternative to reduce insect damage. In this study we report the major classes of digestive enzymes during larval growth in P. Interpunctella, being those proteinases actives at pH 9.5 and optimum temperature of 50 oC to both larvae of the 3rd instar and pre-pupal stage of development. In vitro and zymogram assays presented the effects of several inhibitors, such as SBTI, TLCK and PMSF to intestinal homogenate of 3rd instar larvae of 62%, 92% and 87% of inhibition and In pre-pupal stage of 87%, 62 % and 55% of inhibition, respectively. Zymograms showed inhibition of two low molecular masses protein bands by TLCK and that in presence of SBTI were retarded. These results are indicative of predominance of digestive serine proteinases in gut homogenate from Plodia interpunctella larvae. This serine proteinase was then used as a target to evaluate the effect of SBTI on larvae in in vivo assay. Effect of SBTI on mortality and larval mass was not observed at until 4% of concentration (w/w) in diets. Chitin, another target to insecticidal proteins, was observed by chemical method. Moreover, optic microscopy confirmed the presence of a peritrophic membrane. Established this target, in vivo effect of EvV, a chitin binding vicilin, evaluated during the larval development of P. interpunctella and was obtained a LD50 of 0,23% and WD50 of 0,27% to this protein. Mechanism of action was proposed through of the in vivo digestibility of EvV methodology. During the passage through the larval digestive tract was observed that EvV was susceptible to digestive enzymes and a reactive fragment, visualized by Western blotting, produced by digestion was recovered after dissociation of the peritrophic membrane. The bound of EvV to peritrophic membrane was confirmed by immunohystochemical assays that showed strong immunofluorescent signal of EvV-FITC binding and peritrophic membrane. These results are a indicative that vicilins could be utilized as potential insecticide to Plodia interpunctella and a control methods using EvV as bioinsecticide should be studied to reduce lost caused by storage insect pests

Characterization of a new platelet aggregating factor from crotoxin Crotalus durissus cascavella venom

In this article we investigated the platelet aggregating activity of whole crotoxin and its subunits isolated from Crotalus durissus cascavella venom. During the purification protocols of the venom, using HPLC molecular exclusion, we detected the presence of two different serine protease activities in the gyroxin fraction, and another in the crotoxin fraction, which induced strong and irreversible platelet aggregation, in addition to blood coagulation. From crotoxin, we isolated PLA(2), crotapotin (both fractions corresponding approximately 85% of whole crotoxin) and another minor fraction (F20) that exhibited serine protease activity. After a new fractionation on reverse phase HPLC chromatography, we obtained three other fractions named as F201, F202 and F203. F202 was obtained with high degree of molecular homogeneity with molecular mass of approximately 28 kDa and a high content of acidic amino residues, such as aspartic acid and glutamic acid. Other important amino acids were histidine, cysteine and lysine. This protein exhibited a high specificity for BApNA, a Michaelis-Menten behavior with Vmax estimated in 5.64 mu M/min and a Km value of 0.58 mM for this substrate. In this work, we investigated the ability of F202 to degrade fibrinogen and observed alpha and beta chain cleavage. Enzymatic as well as the platelet aggregation activities were strongly inhibited when incubated with TLCK and PMSF, specific inhibitors of serine protease. Also, F202 induced platelet aggregation in washed and platelet-rich plasma, and in both cases, TLCK inhibited its activity. The N-terminal amino acid sequence of F202 presented a high amino acid sequence homology with other thrombin-like proteins, but it was significantly different from gyroxin. These results showed that crotoxin is a highly heterogeneous protein composed of PLA(2), thrombin-like and other fractions that might explain the diversity of physiological and pharmacological activities of this protein.

Novos recetores de aniões baseados em homooxacalixarenos fluorescentes com potenciais aplicações biotecnológicas

A reação de condensação de fenóis para-substituídos com formaldeído em meio básico conduz à formação de calixarenos, compostos macrociclícos com cavidades que podem exibir diversos tamanhos e conformações. Estes compostos têm sido alvo de grande interesse devido à sua capacidade complexante e de transporte seletivo de iões e moléculas neutras, para além de serem usados como plataforma na obtenção de moléculas recetoras mais complexas. Nesta Tese de Mestrado realizou-se a síntese de novos recetores de aniões baseados em homooxacalixarenos fluorescentes contendo grupos ureia ou tioureia na coroa inferior e determinaram-se as suas propriedades complexantes relativamente a aniões com diversas geometrias. Primeiramente, efetuou-se a síntese de dois derivados dihomooxacalix[ 4]arenos (a partir do precursor p-terc-butildihomooxacalix[4]areno), compostos bidentados contendo grupos naftilureia (ou tioureia) na coroa inferior, através de um espaçador com quatro átomo de carbono, e de um derivado tri-substituído idêntico, a partir do precursor p-terc-butilhexahomotrioxacalix[3]areno. Os novos compostos foram caracterizados através das técnicas usuais e foi feita a sua análise conformacional por RMN. Em seguida investigaram-se as propriedades complexantes de aniões de diferentes geometrias (esférica, linear, trigonal planar e tetraédrica) com dois dos recetores sintetizados. Estes estudos foram realizados por RMN de protão e por espectroscopia de absorção no UV-Vis e de emissão em estado estacionário, utilizando três solventes diferentes (clorofórmio, diclorometano e acetonitrilo). Um terceiro recetor bidentado análogo já existente (dihomooxa fenilureia) foi também estudado por espectroscopia de absorção e emissão. De um modo geral, o derivado hexahomotrioxa trinaftilureia mostrou uma afinidade ligeiramente superior para com os aniões. Todos os recetores apresentaram as maiores constantes de associação para o anião fluoreto. Foram ainda feitos estudos de fotodegradação que indicaram a impossibilidade do uso do clorofórmio como solvente nos estudos por fluorescência.

Fluorose dentária: uma revisão da litertura

A fluorose dentária origina-se da exposição do germe dentário, durante o seu processo de formação, a altas concentrações do íon flúor. Este trabalho teve como objetivo fazer uma revisão da literatura narrativa sobre os estudos da fluorose dentária na década de 2001 a 2010. Foi feita uma pesquisa na base de dados da Biblioteca Brasileira de Odontologia (BBO) e em livros textos da área de cariologia, usando as palavras-chave: fluorose dentária, microabrasão de esmalte, epidemiologia, intoxicação por flúor, abastecimento de água, percepção visual, tratamentos de fluorose dentária. A ação dos fluoretos é basicamente dose dependente. A exposição adequada a fluoretos ajuda no controle da cárie dentária. Uma dose muito alta pode causar pigmentação marrom, com manchas brancas e hipomineralização superficial, em dentes homólogos, até o ponto em que o esmalte se torna muito poroso e altamente manchado. Além da dosagem de flúor, outros fatores interferem na severidade da doença: baixo peso corporal, taxa de crescimento esquelético e períodos de remodelamento ósseo constituem-se fases de maior absorção do flúor; estado nutricional, altitude e alterações da atividade renal e da homeostase do cálcio também são fatores relevantes. A observação das características clínicas com finalidades de diagnóstico deve ser realizada com boa iluminação, após profilaxia e secagem prévia dos dentes, e um dos fatores para diferenciar o diagnóstico de fluorose e defeitos de esmalte é observar se as alterações estão em dentes homólogos. A forma mais comum de fluorose é a leve. Observa-se, entretanto, que a proporção de indivíduos que apresentam as formas moderada e severa ainda é pequena, mas existe um aumento significativo nos locais onde a fluorose é endêmica e isto se deve à alta concentração do fluoreto nas fontes naturais de água. A fluoretação da água é importante medida preventiva para o declínio da prevalência de cárie dentária, mas, deve ser monitorada, a fim de que o teor de flúor seja mantido dentro dos padrões adequados para o controle da cárie e prevenção da fluorose dentária. A literatura relata várias formas de tratamento clínico do esmalte comprometido por fluorose, entre eles, técnicas mais invasivas, como coroas protéticas e facetas estéticas, e menos invasivas, como as técnicas de clareamento dental e microabrasão de esmalte, a qual não causa nenhum desconforto trans e pós-operatório aos pacientes a ela submetida. Nos casos de fluorose leve, que são as formas mais prevalentes, o tratamento mais indicado é a combinação das técnicas de microabrasão de esmalte e clareamento dental, por serem considerados os tratamentos menos invasivos já fundamentados na literatura para a diminuição dos efeitos da fluorose, podendo promover um maior benefício ao paciente quando utilizados em conjunto.

Revisão de literatura sobre o controle do flúor e sua importância na prevenção da cárie

Com os avanços da odontologia constatou-se que o uso do flúor é a medida de maior impacto e relevância para o controle da cárie dentária, por isso, após a descoberta dos benefícios da fluoretação da água, esse mecanismo tornou-se obrigatório no Brasil em todas as fontes de abastecimento público de água, embora, ainda não alcance as populações da zona rural que se utiliza de águas de cisternas e poços. Em algumas regiões do Brasil é possível encontrar fontes de flúor natural nas águas, muitas vezes em nível elevado ao ponto de refletir a fluorose dentária, as vezes em nível baixo ao ponto de não interferir na prevenção da cárie dentária, o que torna imprescindível o estudo do teor de flúor já existente na água para que a fluoretação seja feita no nível adequado ao controle da cárie. Desse modo, o presente estudo visa abordar a importância da fluoretação da água na prevenção da cárie, bem como, alertar quanto aos malefícios causados pela utilização em excesso de flúor. Para tanto, o estudo será baseado em uma revisão bibliográfica sobre o controle do flúor e a importância e eficácia da fluoretação das águas na prevenção da cárie dentária, utilizando-se de conceitos fundamentais para o entendimento do assunto. Concluímos que, mesmo com a existência de Leis, Decretos e Portaria concernentes ao assunto, os órgãos de fiscalização devem ficar em alerta e quando preciso buscarem alternativas que sejam capazes de solucionar possíveis problemas oriundos do excesso ou da inexistência de flúor na água através da exigência de manutenção e monitoramento do flúor nas águas, determinando também os diferentes meios em que o fluoreto de sódio pode ser aplicado na cavidade bucal visando diminuir os danos que podem ocorrer se forem utilizados de maneira inadequada.