Purificação e caracterização parcial de duas N-acetil-ß-hexosaminidases do Equinoderma marinho Echinometra lucunter

Two b-N-acetylhexosaminidases (F11 e F15) were purified from Echinometra lucunter gonads extracts. The purified enzymes were obtained using ammonium sulfate fractionation, followed by gel filtration chromatographies (Sephacryl S-200, Sephadex G-75 and Sephacryl S-200). The F11 fraction was purified 192.47 -fold with a 28.5% yield, and F15 fraction 85.41 -fold with a 32.3% yield. The molecular weights of the fractions were 116 kDa for F11 and 42 kDa for F15 using SDS-PAGE. In Sephacryl S-200, F15 was 84 kDa, indicating that it is a dimeric protein. When p-nitrophenyl-β-D-glycosaminide was used as substrate, we determined an apparent Km of 0.257 mM and Vmax of 0.704 for F11 and for F15 the Km was 0.235 mM and Vmax of 0.9 mM of product liberated by hour. Both enzymes have optimum pH and temperature respectively at 5.0 and 45 °C. The enzymes showed inhibition by silver nitrate, while the glucuronic acid was a potent activator. The high inhibition of F15 by N-etylmaleimide indicates that sulphydril groups are involved in the catalysis of synthetic substrate

Neste trabalho foram purificadas e caracterizadas parcialmente duas N-acetil-b- hexosaminidases (F11 e F15) extraídas de gônadas do equinoderma marinho Echinometra lucunter. As enzimas foram purificadas com protocolo seqüencial por precipitação com sulfato de amônio e cromatografias de exclusão molecular (Sephacryl S-200, Sephadex G-75 e Sephacryl S-200). A fração F11 foi purificada 192,47 vezes com recuperação de 28,5% e F15 85,41 vezes com recuperação de 32,3%. Suas massas moleculares, determinadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS, foram respectivamente 116 e 42 kDa. Em Sephacryl S-200 F15 apresentou massa molecular de 84 KDa, sugerindo que esta enzima possui forma dimérica. Utilizando-se p-nitrofenil N-acetil-b-glicosaminídeo como substrato obtivemos Km aparente de 0,257 mM e Vmax de 0,704 unidades de absorbância a 405 nm / h para a fração 11, e 0,235 mM e Vmax de 0,9 unidades de absorbância a 405 nm / h para F15. Ambas frações apresentaram pH e a temperatura ótima de catálise 5,0 e 45 °C, respectivamente. A atividade N-acetil-b-glicosaminidásica foi potencialmente inibida por prata, iodoacetamida, N-etilmaleimida e PMSF. A forte inibição de F15 por N-etilmaleimida indica o envolvimento de radicais sulfidrila na hidrólise do substrato sintético, caracterizando também ser uma enzima altamente sensitiva a este sal