谷子体细胞无性系变异和抗除草剂基因转化研究

谷子是我国北方具有区域重要性的禾谷类粮食作物。谷子的体细胞无性系变异和外源基因转化相对其它作物研究较少。本研究利用谷子生产的育种中应用的多个优良品种为材料，分析了谷子体细无性系变异发生的影响因素、变异性和频率、DNA分子水平变异和育种应用等问题;采用基因枪法和花粉管通道法，进行了谷子抗除草剂基因转化研究。 主要结果包括： 1. 通过几种外植体的愈伤组织诱导分析,找到了小花分化期前后的谷子幼穗是愈伤组织诱导的最好外植体.提出谷子愈伤组织可按生长状态和结构划分为质密型、松软型和松散型三种基本类型的观点。前两种为胚性愈伤组织并可相互转换，松软型愈伤组织生长状态稳定，可塑性好，是继代培养和因基化的首选类型。供试品种中豫谷1号、高39、郑407和矮宁黄为易培养品种，矮88、豫谷2号、系238、冀14号、C445和青丰谷为相对难培养品种。这些结果为谷子组织培养和生物技术操作提供了基础资料。 2. 首次对多个谷子品种较大群体的无性系变异进行了分析。结果表明，以R_2株系为单位的谷子体细胞无性系表现型变异频率平均为13.0%，不同基因型的变幅为4.3～32.9%;变异涉及株高、抽穗期、穗粒重、出谷率、叶鞘色、育性、抗病性、米色、穗型等多个性状，多数变异为株高和抽穗期等数量性状，少数为矮秆等质量性状：变异的性状多数能在R_3稳定并遗传给后代。从谷子体细胞无性系变异中选出了一批农艺性状得到改良的新品系，其中系103已进入省区域试验，并提供给多家育种单位作为亲本应用。 3. 将RAPD分析技术引入谷子体细胞无性系变异研究。豫谷2号无性系的RAPD多态性变化既有亲本带的缺失，也有新带的产生。用RAPD多态性变化的SMC值度量无性系同亲本相比DNA水平变异的大小，表现型发生变异的无性系,其SMC值分别为0.905～1.0;表现型未发生变异的无性系，RAPD多态性也可能发生变化，其SMC值分布为0.953～1.0。 4. 通过Gus基因瞬时表达单位数的比较，优化了JQ－700基因枪转化谷子松型愈伤组织的操作参数：质粒DNA用量3μg/mg钨粉，CaCl_2农度1.5M，亚精胺浓度40mM，样品室高度7cm，粗弹头为微弹载体，每皿愈伤组织用量1～2g，每次轰击钨粉用量50μg，轰击前4小时和轰击后16～20小时，用含蔗糖150g/l的高渗培养基处理。利用该技术体系，以bar基因为目的基因转化豫谷2号愈伤组织。经选择培养和植株再生，首次获得了抗0.1% bialaphos的正常可育植株，经PCR和Southern blot分析，bar基因已整合到转化体的基因组中，为创造抗除草剂的谷子新种质提供了材料和技术基础。 5. 研究了花粉管通道法转化和花粉介导的基因枪转化谷子的可行性。花粉管通道法转化后代中，获得了抗0.1% bialaphos的抗性植株，经X-gluc组织化学检测，抗性植株叶片的Gus反应为阳性。初步说明该植株可能为转化体，在谷子上为花粉管通道法转化的可行性提供了佐证。花粉介导的基因枪转化未获得转化体。 本文对体细胞无性系变异形成的原因和应用、无性系变异的分子生物学分析、以及谷子的外源基因转化方法等问题进行了讨论。

组织培养产生小麦族属间易位和其它染色体变异的分子细胞遗传学分析

组织培养能够诱导染色体断裂和重接进而产生染色体易位的观点已被广泛认识。大量的研究注意到了组织培养产生的核型不稳定性，其中大多数研究的对象是栽培作物及其属间或种间杂种幼胚和幼穗再生植株。借助于减数分裂分析、染色体分带和其它检测技术，在再生植株中发现了包括易位在内的许多染色体变异。可以相信，除了传统的同源和部分同源染色体配对时的自发易位和辐射诱变等方法以外，远缘杂种组织培养有可能作为产生染色体易位的又一种选择。尽管如此，至今还没有取得培养细胞中染色体易位的直接证据。本研究以普通小麦×硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂种为材料，研究了组织培养过程中离体细胞的染色体变异，用基因组原位杂交技术（GISH）证实组织培养诱导小麦染色体与簇毛麦染色体发生易位。同时，研究了小麦×黑麦杂种培养细胞中的染色体变异和黑麦B-染色体的变化。利用组织培养技术获得了小麦-黑麦和小麦-长穗偃麦草代换系和附加系。 1 普通小麦比较容易与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体TH_1和TH_1W杂交，所选的9个普通小麦品种或品系与TH_1和TH_1W配制的19个杂交组合，平均结实率为46.7%，共计获得19个杂交组合2316粒杂种种子。正反交结果表明，以普通小麦为母本的杂交结实率高于反交结实率。在继代培养过程中，杂种幼胚愈伤组织生长迅速，甚至直接诱导出绿苗，共获得不同杂交组合2005株再生植株。 2 普通小麦与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂种愈伤组织发生了比较大范围的染色体数目和结构变异。在检查的中国春×TH_1W、TH_1W×84加7911515、TH_1×84加7911515、TH_1W×91E27、鲁资357×TH_1W等5个杂种组合的1730个愈伤组织细胞中，平均有19.1%的细胞发生了染色体数目变异，不同杂交组合变化在12.7%（中国春×TH_1W）至30.7%（TH_1×84加7911515），其中，以染色体数目减少的变异为主，数目增加的变异比较少。杂种愈伤组织平均有6.3%的细胞发生了染色体断裂，产生染色体断片、环状染色体、端着丝点染色体和缺失染色体。断裂的染色体可能重新融合在一起，形成双着丝点染色体。 3 培养时间影响普通小麦×硬粒小麦-簇毛麦双二倍体和普通小麦×黑麦杂种愈伤组织细胞中的染色体数目和结构变异。在一定时间里，随着培养时间的延长，未发生核型变异的细胞逐渐减少，发生变异的细胞逐渐增多，主要表现在染色体数目减少的细胞增多，而染色体数目增加的细胞有减少的趋势。在长时间培养（190日龄）的愈伤组织中染色体加倍的细胞消失了，表明长时间培养对高倍性的细胞具有不利的选择，使这类细胞难以在长期继代培养中生存下去。愈伤组织在第一次继代培养时就发现有核型变异，说明染色体变异在愈伤组织培养初期就可以发生。 4 以簇毛麦总基因组DNA为探针，采用荧光原位杂交技术在普通小麦×硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂种愈伤组织细胞中发现小麦染色体与簇毛麦染色体发性易位，这一结果是组织培养诱导培养细胞中属间染色体易位的第一个直观的证据。易位的染色体既有臂间易位，也有小片段易位。易位的染色体不仅可以在愈伤组织细胞中存在，也能够在再生植株中表达。在64株中国春×TH_1W和NPFP×TH_1再生植株中，观察到了3个易位株，其中1个易位株是一个小麦染色体与一个簇毛麦染色体发生了相互易位，易位的簇毛麦染色体片段比较小，大约为簇毛麦染色体臂的1/2，而易位的小麦染色体大约是臂长的1/3，另外2个易位株染色体断点位于或靠近着丝点。本研究的结果再次证实了利用组织培养能够创造小麦与外源染色体之间发生易位。 5 ~(60)Co γ-射线辐射处理对于普通小麦中国春与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体TH_1W杂种愈伤组织细胞的染色体变异有很大的影响。表现在未发生变异的细胞大大减少，发生染色体数目变异的细胞急剧增加，主要是染色体数目减少的变异提高了21.3%，相反染色体增加的变异不但没有增加，而且还有所减少。经过辐射处理的愈伤组织细胞染色体结构变异也有大幅度增加，变异频率提高，变异类型增加。发生染色体断裂和重接形成双着丝点染色体的细胞频率达到22.3%，比对照提高13.9%。辐射诱变对培养细胞中簇毛麦染色体变异发生明显的影响。与此同时，簇毛麦染色体与小麦染色体易位频率比对照提高了近2倍。观察结果还表明愈伤组织辐射处理比延长培养时间诱导染色体变异的效果更好。 6 尽管愈伤组织中发生的染色体变异在再生植株中多有发现，但是，只有比较小范围染色体变异的愈伤组织细胞具有再生能力形成再生植株，那些发生剧烈变异的细胞通常不具有再生能力，因而不能在再生植株中得到表达。普通小麦与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂种大多数再生植株染色体数目与供体杂种保持一致，只有少数植株发生染色体数目变异。显然，发生较大染色体变异的愈伤组织细胞在增殖和分化过程中处于不利的地位，逐渐被淘汰。 7 在普通小麦与硬粒小麦-簇毛麦与黑麦杂种愈伤组织中，观察到相当高频率的染色体加倍细胞，为利用组织培养创造双二倍体提供了一种可能。但是，加倍的细胞只是培养初期的愈伤组织中出现，经过一段时间的培养，这种细胞大多消失了。而且，大多数再生植株染色体数目未发生加倍，其中并没有出现期望的双二倍体植株。表明加倍了的细胞在愈伤组织生长和分化过程中大范围变异的细胞一样受到不利的选择，再生能力比较差。因此，利用组织培养创造双二倍体需要更大的努力。 8 一些黑麦品种含有数目不等的B-染色体。B-染色体的多少对普通小麦与黑麦的杂交结实率有比较大的影响，数目越多，杂交结实率越低。在培养初期的愈伤组织细胞中，B-染色体的频率很高，例如69%的中国春×芬7416杂种的40日龄愈伤组织细胞中含有数目不等的B-染色体。常染色体的倍性影响B-染色体的分布，染色体数目加倍的双二倍体细胞中含多数B-染色体的细胞频率大大高于单倍体细胞。经过一段时间的培养之后，绝大多数B-染色体都不存在了，只有极少数细胞含有1个B-染色体。可能的原因是离体培养过程对B-染色体产生了不利的选择。 9 利用组织培养技术，从普通小麦与八倍体小黑麦杂种幼胚再生植株自交后代中选育出2个异代换系，从4D缺体小麦×八倍体小黑麦再生植株回交后代中选育出1个附加系。荧光原位杂交、C-分带和种子贮藏蛋白分析证明这两个代换系1D/1R代换，附加的也是1R染色体。从4D缺体小麦与八倍体小偃麦杂种再生植株自交和回交后代中选育出5个代换系和2个附加系。染色体配对和RAPD分析证实了长穗偃麦草染色质的存在。其中一些小麦-长穗偃麦草代换系和附加系对叶锈病免疫或高抗，对条锈病的一些生理小种和白粉病具有比较高的抗性。而且，附加系924和代换系807蛋白质含量分别达到19.32%和18.83%。 10 当普通小麦鲁资357与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂交时，无论是实生苗还是再生植株都发生杂种致死现象。细胞学观察没有发现植株染色体发生变异，荧光原位杂交表明簇毛麦染色也没有发生可见的变异。推测这种杂种致死现象是由于鲁资357和硬粒小麦81086A（TH_1和TH_1W的硬粒小麦亲本）中可能分别带有互补的杂种致死基因所致。

体细胞无性系变异与烟草抗黑胫病细胞突变体的筛选

体细胞无性系变异是植物组织培养过程中发生的一种较为普遍的现象，这种现象在遗传学理论和育种实践上都很值得研究。应用这种变异进行筛选人们已经获得了一大批生产上有广泛意义的细胞突变体。但对于无性系变异发生的机理，人们虽然也进行了详细研究，提出了不少假说，但一直未能给出一个较为全面的解释。有些解释仍然建立在推测的基础上，有待进一步的研究。在这些解释中，利用转座子活化进行解释是最使人感兴趣的一种，也是较有说服力的一种。我们的实验分为两个部分，一是对无性系变异发生与转座子的关系进行了初步的探索,一是利用体细胞无性系变异筛选烟草黑胫病细胞突变体的应用进行了研究。 对转座因子的转活性进行分析，通常采用标记基因的表型检测。本实验用农杆菌双元载体pSLJ721（Ac∷GUS）转化烟草（品种：红花大金元）， 然后对转基因烟草的愈伤组织进行GUS酶活性的组织化学分析。通过GUS活性变化来分析转座活性。结果表明组织培养可以增强转座子的活性。间接证明转座子活化是体细胞无性系变异的原因之. 本论文实验方面的另一部分是体细胞无性系变异在烟草抗黑茎病研究上的应用。烟草黑茎病是由烟草致病疫霉引起的一种烟草主要病害。首先从云南地区黑胫病病区分离、纯化黑胫病（Phytophythora parasitica via. Nicotina）病原菌，同时利用红花大金元为实验对象，以组织培养中自然发生的元性系变异为基础，以50％以及80％的黑胫病病菌粗毒素为选择压力，筛选出抗黑胫病毒素的烟草株系，用离体叶片法和茎部接种法进一步鉴定其对黑胫病病菌的抗性。最后进行田间检测以期获得综合性状优良的抗黑胫病细胞突变体。另外我们还利用随机引物扩增多态DNA（RAPD）分析技术，对选择到的九个抗病株系和六株对照的DNA进行分析。在使用的70种随机引物中，共有57个引物产生可检测扩增产物，产生306条搁增带，其中有多态性的条带数为51条，突变体的平均RAPD条带变异率为1.85％，其中有两个RAPD条带（CYA－17－100和Sangon03-350）为突变体所特有，可初步判断为抗黑胫病的RAPD标记。对突变体和对照植株叶片水溶性蛋白SDS电泳观察到一些条带的变异，但没有找到突变体特异的共同条带。

大麦雄核发育的基因型效应及相关的分子标记

基因型效应是影响植物雄核发育（Androgenesis）的重要因素，在很多情况下基因型的限制是单倍体育种用于实践的主要障碍。尽管人们对基因型效应进行了大量的遗传学研究，但对其机理仍然了解很少。本研究以具有不同花粉胚胎发生能力的两个大麦基因型为材料，细致地观察了大麦花粉体内发育和雄核发育的过程，确认大麦雄核发育途径包括营养核分裂途径、营养核与生殖核分裂途径和小孢子均等分裂途径三种。在雄核发育过程的每一个阶段，从单核、二核、多核花粉粒到愈伤组织，都可能发生败育。无论基因型是否具有高频率花粉胚胎发生能力，这种败育都是限制愈伤组织产量的重要因素。对两个基因型离体培养花药中不同类型花粉频率的连续统计表明，从培养开始到大量多核花粉粒形成，三种花粉－单核花粉、分裂花粉和死亡花粉的频率变化在两基因型中是相似的，发育途径都是以小孢子均等分裂途径为主，因此两基因型的早期雄核发育过程无明显区别。然而两基因型最终出愈率是有显著差异的，这种差异从时间上讲是在小孢子形成多核粉以后产生的。推测大麦不同基因型之间，花药培养反应的差异不是受小孢子脱分化启动能力控制的，更可能由其多核花粉发育成愈伤组织或胚状体的能力决定，可能与细胞壁的形成有关。从这种意义上来说，雄核发育过程中的愈伤组织形成又可以分为两个阶段：愈伤组织形成的诱导和愈伤组织形成的维持，并且它们分别受不同的基因控制，有不同的遗传机制。因此，大麦愈伤组织形成维持能力的差异是造成不同基因型对花药培养反应不同的主要原因。 利用BSA（Bulked Segregant Analysis）法对60个单株构成的F2分离群体进行分析。在520条随机引物中，有7个在高频池和低频池中的扩增产物有差异，其中引物S500重复性最好，其扩增带S500_(－650)经过单株验证后，确认与高频率胚胎发生能力连锁。聚丙烯酰胺凝胶电泳银染证明这一条带只存在于高频池中，可以初步确认是一个与高频率胚胎发生能力连锁的RAPD标记。

水稻颖花开裂突变体的鉴定及颖花开裂基因srs-1的定位

　　水稻(Oryza sativa L.) 颖花开裂 (split rice spikelet，SRS) 突变体是从水稻品系 8902s 花药培养得到的双单倍体群体中筛选出的同源异型突变体。以窄叶青8号为母本，SRS突变体为父本配制杂交组合，其F2群体中正常植株和突变植株的分离比例符合3:1，说明颖花突变性状是由单隐性基因决定的。 利用扫描电镜观察 SRS突变体花器官形态发生过程。其性状表现为内外稃变软变长，不抱合，在外稃基部又着生一朵花，两浆片基部融合，质地呈稃片状，雄蕊和雌蕊形态正常，且可育。该突变体的突变性状与拟南芥APETALA1的突变表现相似，说明两者在形态建成方面具有相似之处。由于 SRS 突变体第一轮和第二轮花器官发生了变化，根据 ABC 模型，srs-l基因应属于同源异型 A 组基因。 采用BSA法在F2群体中建立DNA正常池和突变池，利用RAPD技术筛选与突变基因srs-l连锁的分子标记。从520条随机引物中筛选出了引物S465能在两池间扩增出分子量为900 bp的差异片段，并证明其在F2群体中表现共分离。将此DNA片段克隆后作为RFLP探针pS465A，该探针与srs-l基因紧密连锁，在DH群体的RFLP分子连锁图谱上成功地将它们定位于第三染色体上。 本研究是利用水稻同源异型突变体为材料，研究水稻花器官发育基因的首例报道。

盐渍条件下野大豆群体的DNA变异

当前分子生物学的方法以惊人的速度渗透到生命科学研究的各个领域。植物对不断变化的环境逐步适应的过程中，积累了丰富的遗传多样性。与此同时，人类活动空间的不断扩大已经严重威胁到其他生命的生存和繁衍，越来越多的物种以越来越快的速度在我们还没有来得及认识它们时就已经永远地消失了。加快物种鉴定和保护的步伐就必须发展更多能充分揭示物种遗传多样性的实验技术，从具有丰富遗传多样性的野生资源中寻找到更多能够服务于人类可持续发展的基因资源。本文以杨树杂交后代过氧化物同工酶和RAPD分析为基础，论证了我们改进的RAPD方法用于遗传分析的可行性。在前期工作的基础上，进一步测定了野大豆自然群体的耐盐性变异，并且用微卫星和RAPD分析的方法研究分子标记与DXA变异、植株耐盐性之间的关系。对四个可能与抗盐性有关的RAPD片段进行克隆、测序，并进行序列比较。由此得出以下结论： 1、在本文的实验条件下，杨树同工酶和RAPD分析均表明，RAPD标记在亲本及其杂交后代中性状比例符合孟德尔遗传规律，尽管有时也会出现遗传负载等机制引起的基因分布扭曲现象。 2、初步研究了个体发育阶段和环境条件对植株耐盐性的影响。结果表明，植物耐盐性不仅仅与外界的盐度有关，而且受发育阶段和其它环境条件（如，温度）的影响。但也发现了某些个体在各种条件下都具有较高的耐盐性，而且，不易受到其它环境条件的影响。 3、微卫星标记的结果表明，10对引物中的8对引物共检测到时17个等位基因，平均每对引物2.125个等位基因。本文的实验条件下，双核苷酸和三核苷酸的引物对扩增产物都没有出现“ghosts"条带或“打滑”现象。 4、有4个RAPD标记可能与野大豆群体的耐盐性有关，分别是OPCO8460bp、OPCO8213bp、OPCO2690bp、以及OPCO5270bp。测序结果与GenBank中的序列作同源性比较，结果显示，OPCO2_(690bp)与小麦、松树等植物的吉普赛性的逆转录转座子的部分区域（24－－53）有很高的同源性（86－89％）。此外，OPCO2690bp与栽培大豆胞质谷氨酰胺合成酶（gs15）基因的启动子有高达95％的同源性。 5、本文实验条件下，RAPD扩增产物在限制性内切酶消化后，消化产物的多态性未见增大，也没有发现与耐盐性相关的多态位点。 6、野大豆自然群体DNA变异的研究中也可以应用SWAPP方法。

毛乌素沙地中间锦鸡儿根瘤菌遗传多样性对柠条生态系统功能的影响

生物多样性科学（BiodiversityScience）的国际规划提出生物多样性对生态系统功能的影响是整个研究计划五大核心的核心.生物多样性包括遗传、物种和生态系统三个水平,其中遗传多样性是其它两个水平多样性的基础和最终来源.该文在实验室多年研究毛乌素沙地柠条遗传多样性的基础上,分别从表型（生理生化）、蛋白质、同工酶以及遗传型（rDNA）水平探讨中间锦鸡儿根瘤菌的遗传多样性,并模拟沙地生境,建立人工共生体系,以期发现最有效的共生伙伴关系,这不仅有得提高毛乌素地区农牧业产量,更重要的是在当今沙尘暴肆虐的情况下,发挥柠条防风固沙的能力具有现实意义. 1.毛乌素沙地中间锦鸡儿根瘤菌遗传多样性(1)全细胞可溶性蛋白质谱将供试中间锦鸡儿根瘤菌菌株分为两大类群，其中硬梁覆沙地菌株GH72不同于来自沙丘顶部和底部的菌株，而且中间锦鸡儿根瘤菌独立于参比菌株。酯酶同工酶谱分析表明，中间锦鸡儿根瘤菌与参比菌株仅存在一个等位酶位点差异，其余等位点与参菌株共享，因此，酯酶同工酶反映出中间锦鸡儿根瘤菌的异质性。(2)16SrDNA部分序列与16S-23S rDNA IGS结果表明，所有供试菌株扩增产物均较前人报道的分子量偏高。经16S rDNA PCR-RFLP分析，中间锦鸡儿根瘤菌共形成12种基因型，表现出丰富的遗传多样性，其中属于基因型2的菌株占42.4%。代表菌株GH33 16S rDNA全序列结果显示，与已知的快生型根瘤菌同源性在95%以上。(3）中间锦鸡儿根瘤菌生理生化反应特性B．T．B实验证明所有中间锦鸡儿根瘤菌均产酸，符合快生型根瘤菌的特征．唯一碳源测试显示，95%中间锦鸡儿根瘤菌不利用淀粉，33%菌株不利用乳糖，对其他测试碳源不具有选择性。检洲在不同盐离子浓度、不同酸性梯度以及不同温度条件下菌株生长状况，发现毛乌素沙地中间锦鸡儿根瘤菌具极强的耐盐性．53.8%的菌株可以在9%NaCl的YMA培养基生长．75%的菌株在pH4．O和pHl0,0 环境中仍能生长，66.7%菌株在60℃处理1 0min后仍具有生活力。体现出对于干旱沙地的适应。 2．不同实验共生系统中植物和根瘤菌对生态系统功能的影响14株根瘤菌分与三个柠条种（小叶锦鸡儿，中间锦鸡儿和柠条锦鸡儿）回接，用土壤上覆沙模拟毛乌索沙地景观生态条件，以多石砾贫瘠土壤为对照，比较不同基因型柠条与根瘤菌人工共生体的长和结瘤与生境的关系，初步证明根瘤菌很可能是该生态系统的关键种。寄主植物与共生根瘤菌的遗传多样性对生态系统功能的影响与生态环境有关。实验还表明，选择适当的共生组合对于防治沙漠化有很大潜力。3．银染变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测RAPD遗传模式以85株小钻杨F2代为材料，用本实验室改良的银染变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测RAPD遗传模式。结果表明，仅用9个引物共扩增到399个位点，其中98个位点表现为多态性，卡方测验显示，79个多态位点符合经典的孟德尔遗传(3：1)，占多态位点80.6%。这种改良的检测RAPD标记的方法必将推动RAPD标汜构建连锁图谱的进程。

羊草繁殖生物学特性的研究

羊草(Leymus chinensis (Trin.) Tzvel. )又称碱草，隶属禾本科，赖草属，因其营养价值高，富含蛋白质，适口性好，抗旱，耐盐碱，耐贫瘠，抗逆性强，适应性广等优点，对我国发展草原畜牧业和退化草地、荒漠化治理方面具有举足轻重的作用。近年来，由于自然环境变劣，荒漠化加剧，以及过度放牧等不利影响，加之羊草本身固有的“三低”问题（即结实率低、出苗率低、产草量低）已对羊草生物多样性维持构成了严重的威胁，严重限制了我国人工草地建设和天然草地的改良和沙化治理的步伐。加强羊草生物学研究，开展羊草种质生物多样性保护，成为当前研究的紧迫课题。经对国内外相关文献的查新发现：国外发表的文献匮乏，国内的报导大多集中在草原生态等宏观领域，在羊草繁殖生物学方面缺乏系统的研究。本文以本课题组从国内外收集的羊草资源为材料，从以下几个方面进行了初步探索： 一、羊草繁殖性状与遗传多样性分子标记指标的相关分析。利用分子标记与形态标记对随机抽取的17份羊草种质进行了种质评估的比较研究。结果表明：两种方法均在17份供试材料中鉴别出9份羊草种质,说明分子标记方法用于羊草种质资源鉴定是可行的，并具有快速、准确、不受环境条件限制等优点。在40个10 Mer的随机引物当中筛选出21个有效引物，以之对9份羊草材料进行RAPD 分析，共扩增出115条带，其中95条带表现出多态性，多态比率82.61%，并筛选出S1213-900，S1213-1700，S1215-5500， S1396-1370，S1384-900，S1202-5180，S1220-2200，S1381-1580，S1211-1300，S1211-800为羊草种质所具有的10个特异性标记，据此可将羊草种质与披肩草、赖草加以区分。同时在羊草种内亦发现13条可区分供试羊草种质的特有标记。形态标记与分子标记相关性分析结果显示：羊草种质的小穗数，种子千粒重，叶色，有性繁殖量和结实率5个形态学指标与遗传多样性指标---特有带百分率及遗传距离之间，存在一定相关性。同时对羊草种质资源在收集和评价过程中存在的问题进行了探讨。 二、羊草不同基因型无性繁殖特性比较研究。以本课题组从吉林、内蒙古等省份收集的10个基因型羊草为供试材料，在相同的生态因子作用下，以吉生1号羊草为对照，对10个基因型羊草的叶数增量、芽数增量、芽高度、芽间距、芽重量、根量六个无性系形态性状指标进行测评。结果表明：基因型的差异也是影响羊草无性系生长发育的重要影响因子。因此，在今后的羊草无性繁殖生物学研究中，应综合考虑环境因子和基因型因子对羊草无性繁殖生长发育的影响。在所测评的10个基因型中，各基因型的形态性状指标差异很大，栽3基因型较其他基因型优于对照吉生1号，此结论可为今后培育羊草新种提供重要资料。 三、羊草幼穗离体培养方法的建立。其方法是取羊草幼穗为外植体，经0.1%升汞溶液表面消毒后，接种到含2mg/L的2,4-D的MS培养基上，置于恒温25℃条件下诱导愈伤组织。在加有1mg/L2,4-D的MS培养基上继代2次后，转移到含1mg/L KT和0.5mg/LNAA的MS培养基上分化培养得到再生芽。在除去激素后的基本培养基上获得了生根的试管苗。试管苗移栽到温室后生长正常。羊草试管苗的分化因基因型和外源激素条件的不同而异。 四、羊草有性生殖特性的研究。在自然条件下进行了羊草自交、异交结实性实验，采用FDA染色法检测羊草小孢子活性，并观测羊草雌蕊、雄蕊发育的时空特点。结果表明：在大田中羊草异交结实率远大于其自交结实率;成熟花药中有活性的花粉达到92.2%以上;同时，在发育时间顺序和空间结构上，羊草的雌蕊、雄蕊并不妨碍自体授粉。因此，初步结论认为羊草具自交不和性。

低能N+诱导拟南芥突变体DNA变异的研究

低能离子束的诱变效应首先由我国科学家发现并将其广泛应用于育种实践，但是离子注入诱导DNA变异的研究结果主要是以微生物离体质粒DNA为材料获得的，以活体高等生物为材料的研究尚未见报道。 我们以30 keV N+（注入剂量80×1015 ions/cm2）注入拟南芥后获得的稳定突变体T80II为实验材料，对突变体植株进行了RAPD标记，并将T80II和对照部分RAPD特异条带进行克隆测序和DNA序列分析。结果显示，在可分辨的总计397个RAPD条带中，T80II株系中有52个条带表现出差异，包括条带的缺失和增加，条带变异率为13.1%;克隆的T80II序列中，平均每16.8个碱基出现一个碱基变异位点，表现出较高频率的碱基突变。碱基突变的类型包括碱基的颠换、转换、缺失、插入等。在检测到的275个碱基突变中，主要是单碱基置换（97.09%），碱基缺失或者插入的比例较小（2.91%）。在碱基置换中，转换的频率（66.55%）高于颠换的频率（(30.55%)。此外，构成DNA的四种碱基均可以被离子束辐照诱发变异，而且每一种碱基都可以被其它三种碱基所替换，但是胸腺嘧啶（T）的辐射敏感性要高于其它三种碱基。通过分析突变碱基周边序列，对低能N+离子注入拟南芥突变体引发的碱基突变热点进行了讨论。 另外，低能离子注入诱变获得的突变体特异表达基因的克隆方面也没有报道。我们以突变体T80II作为实验材料，用PCR增效的减法杂交技术构建了T80II特异表达的cDNA减法文库，克隆特异表达的cDNA片段，并对其中1个与14-3-3 protein GF14 nu (GRF7) gene有部分同源性、长712 bp的cDNA片段进行了讨论。我们的研究证明通过减法杂交技术克隆低能离子诱发的突变体特异表达的cDNA是可能的，这为低能离子注入技术在分子生物学上的应用开辟了一个新思路。

青蒿素含量影响因子分析及青蒿生殖结构的研究

由于青蒿中青蒿素含量很低，造成生产上成本过高，限制了青蒿素的应用。因此找到青蒿素含量的影响因子，并利用这些因子提高青蒿素含量是十分必要的。 研究青蒿有性生殖过程和生殖结构能够为青蒿遗传育种方面的研究提供理论依据。 利用青蒿高产株系001的茎段作为外植体，通过诱导丛生芽的方法得到无性克隆系s．，利用s．进行了青蒿素含量影响因子的研究。发现在Hoagland培养液中添加0. 44mg/L浓度的ZriS04.7H20,5.72 mg/L的HB03,0.32 mg/L的CuS04.5H20或者5uLmol／L的茉莉酸甲酯时能够明显提高青蒿素含量。 一些试验结果表明青蒿素含量不但受到培养条件的影响，而且和青蒿自身的生长发育有很大的关系。青蒿素含量在营养生长阶段随着青蒿的生长而逐步提高，当每天日照长度短于临界日长一16.5小时，青蒿进入生殖生长阶段，青蒿素含量短日照处理的第9-18天最高，而这一阶段也恰好是青蒿花蕾出现和发育的时期，此后青蒿素含量持续变低。青蒿素在青蒿植株不同器官中含量不同，其中叶片青蒿素含量最高，花蕾中也较高，但茎中含量极低。在不同部位的叶片中含量由高到低的顺序为中部叶片》下部叶片》上部叶片。青蒿植株不同部位器官中青蒿素含量的差异可能和这些部位腺毛数量的差异有关。 遗传差异是导致青蒿各个植株间青蒿素含量差异的主要原因。对青蒿素低产（02卜1，021-5）高产02卜18, 02卜19, 021-20）的五个青蒿株系进行了RAPD研究，以中间型产量02卜g和02卜d两个株系作对照。用OPRON公司的A，B，c，D，K五组100条随机引物进行PCR扩增。发现OPA15 (5' TTCCGAACCC 3')能在所有高产株系中扩增到一条lOOObp的条带，而在低产株系中则扩增不到这条带。这个条带很可能是高产青蒿株系特有的条带( OPA151000)，并有可能作为高产株系的分子标记。 利用整体透明和石蜡切片技术对青蒿的生殖结构进行了研究，研究表明青蒿的头状花序球形，直径大约2—3mm。两性花10-30朵，单层花冠合生，开放时顶端5裂，内有5枚聚合雄蕊。一枚雌蕊，柱头两裂。单性雌花10-18朵，花冠舌状，雄蕊退化。两种花都是子房下位，单室倒生型胚珠。 雌配子体的的发育过程，大孢子母细胞经过减数分裂形成二分体和四分体，四分体中合点端的一个发育成具功能的大孢子，其它三个分解掉，胚囊发育成单核胚囊。然后通过三次有丝分裂经过二核胚囊、四核胚囊阶段发育到八核胚囊，最后形成七细胞、八核胚囊。卵细胞和两个助细胞组成卵器分布在珠孔端，而三个反足细胞分布在合点端。 小孢子母细胞经过两次减数分裂形成二分体和四分体，四分体中的小孢子释放出来后发育成单核花粉，单核花粉经过有丝分裂发育成二核花粉和三核花粉。

大车前（Plantago major L. "Giant Turkish."）体外优化再生体系的建立及Na+/H+逆向转运蛋白基因SeNHX1 和TtNHX1 的功能鉴定

大车前（Plantago major L. "Giant Turkish."）不仅有很高的药用价值，在生态学研究方面也是重要模式植物。大车前的组织培养工作，目前报道很少。对其组织培养体系的建立，为筛选大车前耐盐突变体和基因转化建立高效的体外再生系统和实验平台体系。通过愈伤组织诱导和直接不定芽再生途径， 建立了大车前（Plantago major L. "Giant Turkish."）的快速高效再生系统。叶片外植体在含有1.0 mg/L NAA的MS培养基中培养3周后，形成愈伤组织，愈伤组织在含4.0 mg/L 6-BA的MS培养基中成功再生，得到完整植株。种子外植体在含0.2 mg/L IAA和1.0 mg/L TDZ的MS培养基中培养4周后产生大量的丛生芽，对9株再生植株进行RAPD检测表明，部分植株在DNA水平上发生了变异。 植物抵御盐胁迫的一个重要机制是在液泡中积累Na+，从而使细胞质内Na+保持在较低水平，并且降低细胞渗透势。Na+运输到液泡是由液泡Na+/H+逆向转运蛋白完成的。本实验室已从盐生植物盐角草（Salicornia europaea）和番杏（Tetragonia tetragonioides）中分别克隆得到SeNHX1和TtNHX1基因。本文研究了SeNHX1和TtNHX1基因在酵母突变体里的作用。TtNHX1和SeNHX1蛋白在缺陷型酵母菌株里的表达能够提高这些菌株对NaCl、LiCl和潮霉素的抗性，提高到与野生型相当的抗性水平。说明TtNHX1和SeNHX1有着与酵母ScNHX1相似的细胞定位和作用机制，是ScNHX1的功能类似蛋白。

药蒲公英（Taraxacum officinale weber）耐盐变异体的筛选及其耐盐性分析研究

以药蒲公英（Taraxacum officinale Weber）叶片外植体为材料诱导愈伤组织。以NaCl作为选择因子，从愈伤组织直接筛选。在选择培养基上，大部分愈伤组织褐化死亡，在一些褐化死亡的愈伤组织周围有少量新的细胞团生长，挑选生长存活状况好的细胞团转接到新鲜培养基上，每3周继代一次，经3个月继代筛选获得了耐1.5% NaCl的药蒲公英细胞团。以普通愈伤为对照，发现随着NaCl浓度的升高，耐盐愈伤的相对生长率下降但显著高于对照;且随着盐胁迫处理时间的延长持续升高，而普通愈伤对照几乎停止生长，说明耐盐愈伤具有相对稳定的耐盐性。在蛋白水平上，耐盐愈伤与对照愈伤差异明显，SDS-PAGE分析显示：耐盐愈伤比对照多出一条34 KD大小的蛋白带，且30 KD，18 KD左右的蛋白带明显上调。相同处理条件下耐盐愈伤脯氨酸的增加幅度高于对照。盐胁迫条件下，耐盐愈伤的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性明显高于对照，且随着处理时间的延长和盐浓度的增加呈现升高的趋势，而对照则呈现先升高后下降的趋势。1.5% NaCl处理前后，耐盐愈伤的总黄酮含量显著高于对照。结果说明耐盐愈伤一方面通过积累蛋白和其他小分子有机溶质的方式调节其渗透平衡，另一方面还可通过提高抗氧化能力降低盐分造成的次级伤害。 将耐1.5% NaCl的药蒲公英愈伤组织接种在分化培养基上分化出芽，之后将再生芽转接到生根培养基中进行生根培养，经4个月得到了12株耐1.5% NaCl的药蒲公英再生植株。与野生型相比，耐盐植株叶片宽大、叶柄粗短、叶表面覆盖白色细毛，根粗壮较短，花茎中部具有2 cm左右的苞叶。RAPD和SDS-PAGE检测表明，耐盐植株与对照植株在DNA及蛋白水平上均存在明显差异。1.5% NaCl处理后，与普通再生植株相比，耐盐株系的抗氧化酶活性明显提高，脯氨酸含量上升幅度更为显著，而丙二醛含量降低，其主要药用成分黄酮的含量显著增加。这些结果说明耐盐植株的抗氧化防御能力明显增强。以上结果表明耐1.5% NaCl的药蒲公英再生植株为耐1.5% NaCl药蒲公英变异体，这些耐盐变异体有望成为抗盐耐海水蔬菜家族的新成员。同时，这些耐盐变异体植株比普通植株具有更高的医用商业价值。耐1.5% NaCl的药蒲公英再生变异体遗传稳定性的研究正在进行中。

紫薇种质资源的研究

本文回顾了紫薇在国内外的栽培历史。在中国，紫薇的栽培虽历史悠久，但种质资源缺少系统的研究。本研究通过宏观与微观的技术和方法，探索紫薇种间及品种间的演化关系，并为今后开展种质鉴定、 品种分类以及有计划、有目的的进行新品种的培育提供依据，以期达到紫薇种质资源多样性保护的目的。主要的结果及结论： 1．认为紫薇栽培的历史是紫薇不同种质进行组合和渗透的历史，也在一定程度上反映了品种演化的历史。并提出除了抗病、矮型紫薇的育种外，还要重视重瓣紫薇的育种。 2．通过对紫薇的形态学性状进行聚类分析，寻找到了评价紫薇种质资源的标准，进而提出栽培观赏植物种质资源的评价标准， 即将其性状分为种源性状和观赏性状，这种对观赏植物性状的分解反映了栽培植物不同于野生植物的特点。同时，对其形态学性状进行主分量分析表明，花色与其它营养器官性状相关性不大，很难从其营养器官性状推测花的颜色。 3．通过对紫薇的分子生物学研究，建立了紫薇的DNA提取流程及RAPD扩增体系，利用RAPD标记可以进行紫薇种质的鉴定及探求不同种质间的关系。 4．综合形态学及分子生物学的结论，建立了紫薇种质资源的划分体系，在此基础上，建成了种质资源圃及紫薇种质资源数据库。

云南4个少数民族的随机扩增多态DNA分析

1990年,Williams和Welsh领导的2个小组几乎同时独立地发展起来一项新技术,即随机扩增多态DNA(Random amplified polymorphic DNA,RAPD).该技术通过PCR进行DNA扩增,所用引物是G+C含量为50%—70%的单个随机短引物,这些引物在一定的退火条件下能与基因组DNA中的互补顺序配对,启动DNA的合成.RAPD具有以下特点:(1)无需预先知道受试有机体基因组DNA的序列,因而能应用于所用的生物体;(2)绝大多数

滇金丝猴的随机扩增多态DNA与遗传多样性分析

对6只笼养滇金丝猴(Rhinopithecus bieti)进行了随机扩增多态DNA(RAPD)及遗传多样性分析.用45个10bp随机短引物对每只滇金丝猴的基因组DNA进行了扩增,平均每个个体观察到的RAPD标记约为130个左右,单个引物获得的标记在1～7个之间.80%的RAPD标记表现为无多态的单型性.个体间的遗传距离为0.052,表明笼养滇金丝猴群体的遗传多样性很低.此研究结果与在蛋白多态研究中得到的一致.贫乏的遗传多样性一方面使目前处于濒危境地的滇金丝猴生存情况更加危险,同时其本身也可能是造成目前滇金丝猴濒危的原因之一.另外,通过成对的遗传距离分析,构建了这一群滇金丝猴的谱系关系图,提出了让遗传距离较远的个体间进行交配的笼养繁育计划.