Propidium monoazide (PMA) and ethidium bromide monoazide(EMA) improve DNA array and high-throughput sequencing ofporcine reproductive and respiratory syndrome virus identification

Pan-viral DNA array (PVDA) and high-throughput sequencing (HTS) are useful tools to identify novel viruses of emerging diseases. However, both techniques have difficulties to identify viruses in clinical samples because of the host genomic nucleic acid content (hg/cont). Both propidium monoazide (PMA) and ethidium bromide monoazide (EMA) have the capacity to bind free DNA/RNA, but are cell membrane-impermeable. Thus, both are unable to bind protected nucleic acid such as viral genomes within intact virions. However, EMA/PMA modified genetic material cannot be amplified by enzymes. In order to assess the potential of EMA/PMA to lower the presence of amplifiable hg/cont in samples and improve virus detection, serum and lung tissue homogenates were spiked with porcine reproductive and respiratory virus (PRRSV) and were processed with EMA/PMA. In addition, PRRSV RT-qPCR positive clinical samples were also tested. EMA/PMA treatments significantly decreased amplifiable hg/cont and significantly increased the number of PVDA positive probes and their signal intensity compared to untreated spiked lung samples. EMA/PMA treatments also increased the sensitivity of HTS by increasing the number of specific PRRSV reads and the PRRSV percentage of coverage. Interestingly, EMA/PMA treatments significantly increased the sensitivity of PVDA and HTS in two out of three clinical tissue samples. Thus, EMA/PMA treatments offer a new approach to lower the amplifiable hg/cont in clinical samples and increase the success of PVDA and HTS to identify viruses.

Développement des marqueurs moléculaires spécifiques pour l'identification et la quantification de deux espèces de champignons mycorhiziens arbusculaires en utilisant la PCR en temps réel

Les champignons mycorhizien à arbuscules (CMA) sont des organismes pouvant établir des symbioses avec 80% des plantes terrestres. Les avantages d'une telle symbiose sont de plus en plus caractérisés et exploités en agriculture. Par contre, jusqu'à maintenant, il n'existe aucun outil permettant à la fois l'identification et la quantification de ces champignons dans le sol de façon fiable et rapide. Un tel outil permettrait, entre autres, de mieux comprendre les dynamiques des populations des endomycorhizes dans le sol. Pour les producteurs d'inoculum mycorhiziens, cela permettrait également d'établir un suivi de leurs produits en champs et d'avoir un contrôle de qualité de plus sur leurs inoculants. C'est ce que nous avons tenté de développer au sein du laboratoire du Dr. Hijri. Depuis environ une trentaine d'années, des outils d'identification et/ou de quantification ont été développés en utilisant les profiles d'acides gras, les isozymes, les anticorps et finalement l'ADN nucléaire. À ce jour, ces méthodes d’identification et de quantification sont soit coûteuses, soit imprécises. Qui plus est, aucune méthode ne permet à la fois la quantification et l’identification de souches particulières de CMA. L’ADN mitochondrial ne présente pas le même polymorphisme de séquence que celui qui rend l’ADN nucléaire impropre à la quantification. C'est pourquoi nous avons analysé les séquences d’ADN mitochondrial et sélectionné les régions caractéristiques de deux espèces de champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA). C’est à partir de ces régions que nous avons développé des marqueurs moléculaires sous forme de sondes et d’amorces TaqMan permettant de quantifier le nombre de mitochondries de chacune de ces espèces dans un échantillon d’ADN. Nous avons ensuite tenté de déterminer une unité de quantification des CMA, soit un nombre de mitochondries par spore. C’est alors que nous avons réalisé que la méthode de préparation des échantillons de spores ainsi que la méthode d’extraction d’ADN avaient des effets significatifs sur l’unité de quantification de base. Nous avons donc optimisé ces protocoles, avant d’en e tester l’application sur des échantillons de sol et de racines ayant été inoculés avec chacune des deux espèces cibles. À ce stade, cet outil est toujours semi-quantificatif, mais il permet 9 l’identification précise de deux espèces de CMA compétentes dans des milieux saturés en phosphore inorganique. Ces résultats , en plus d’être prometteurs, ont permis d’augmenter les connaissances méthodologiques reliées à la quantification des CMA dans le sol, et suggèrent qu’à cause de leurs morphologies différentes, l’élaboration d’un protocole de quantification standardisé pour toutes les espèces de CMA demeure un objectif complexe, qui demande de nouvelles études in vivo.

La texture et la granulométrie de la moulée influencent les concentrations d’acide propionique et butyrique de même que la prévalence d’Escherichia coli dans le tractus gastro-intestinal du porc d’engraissement

Certaines stratégies alimentaires sont actuellement considérées pour remplacer l’usage des antimicrobiens dans les fermes porcines. Les objectifs de cette étude étaient d'évaluer l'effet de la granulométrie et de la texture des aliments sur les concentrations d'acides gras volatils intestinaux, la composition des populations pathogènes et commensales d’E. coli et sur les performances de croissance des porcs. Des porcs d'engraissement (n= 840) ont reçu l'une des six diètes suivantes: moulée texturée 500, 750 et 1250 µm et moulée cubée 500, 750 et 1250 µm. Le gain de poids a été mesuré à chaque changement de formulation de moulée. À l'abattoir, les contenus du caecum et du côlon de 165 porcs ont été échantillonnés pour le dénombrement des E. coli par PCR quantitatif (qPCR) et pour la quantification des AGV. Le gène yccT a été utilisé pour dénombrer les E. coli totaux. Une diminution du taux de conversion alimentaire a été associée avec la moulée cubée et/ou la moulée de 500 µm. Les concentrations d’acide propionique et butyrique, et ce tant au niveau du caecum que du côlon, étaient plus élevées chez les porcs recevant de la moulée texturée que chez ceux recevant de la moulée cubée. Du point de vue de la granulométrie, les concentrations caecales et du côlon d’acide butyrique étaient plus élevées chez les porcs alimentés avec de la moulée de 1250 µm que chez ceux recevant de la moulée de 500 µm. D'autre part, les niveaux intestinaux d’E. coli totaux étaient plus élevés pour les porcs nourris avec de la moulée cubée que pour ceux ayant reçu de la moulée texturée. Les résultats ont montré que la moulée texturée est associée à des performances de croissance plus faibles mais à des changements intestinaux favorables.

Deoxynivalenol (DON) naturally contaminated feed impairs the immune response induced by porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) live attenuated vaccine

Cereal commodities are frequently contaminated with mycotoxins produced by the secondary metabolism of fungal infection. Among these contaminants, deoxynivalenol (DON), also known as vomitoxin, is the most prevalent type B trichothecene mycotoxin worldwide. Pigs are very sensitive to the toxic effects of DON and are frequently exposed to naturally contaminated feed. Recently, DON naturally contaminated feed has been shown to decrease porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) specific antibody responses following experimental infection. The objective of this study was to determine the impact of DON naturally contaminated feed on the immune response generated following vaccination with PRRSV live attenuated vaccine. Eighteen pigs were randomly divided into three experimental groups of 6 animals based on DON content of the diets (0, 2.5 and 3.5 mg DON/kg). They were fed these rations one week prior to the vaccination and for all the duration of the immune response evaluation. All pigs were vaccinated intra-muscularly with one dose of Ingelvac® PRRSV modified live vaccine (MLV). Blood samples were collected at day −1, 6, 13, 20, 27 and 35 post vaccination (pv) and tested for PRRSV RNA by RT-qPCR and for virus specific antibodies by ELISA. Results showed that ingestion of DON-contaminated diets significantly decreased PRRSV viremia. All pigs fed control diet were viremic while only 1 (17%) and 3 (50%) out of 6 pigs were viremic in the groups receiving 3.5 and 2.5 mg of DON/kg, respectively. Subsequently, all pigs fed control diet developed PRRSV specific antibodies while only viremic pigs that were fed contaminated diets have developed PRRSV specific antibodies. These results suggest that feeding pigs with DON-contaminated diet could inhibit vaccination efficiency of PRRSV MLV by severely impairing viral replication.

Establishing a Robust In Vitro Embryonic Stem Cell Differentiation Assay to Monitor the Hematopoietic Potential of DELES Clones

Afin d’effectuer des études fonctionnelles sur le génome de la souris, notre laboratoire a généré une bibliothèque de clones de cellules souches embryonnaires (ESC) présentant des suppressions chromosomiques chevauchantes aléatoires – la bibliothèque DELES. Cette bibliothèque contient des délétions couvrant environ 25% du génome murin. Dans le laboratoire, nous comptons identifier de nouveaux déterminants du destin des cellules hématopoïétiques en utilisant cet outil. Un crible primaire utilisant la benzidine pour démontrer la présence d'hémoglobine dans des corps embryoïdes (EBS) a permis d’identifier plusieurs clones délétés présentant un phénotype hématopoïétique anormal. Comme cet essai ne vérifie que la présence d'hémoglobine, le but de mon projet est d'établir un essai in vitro de différenciation des ESC permettant de mesurer le potentiel hématopoïétique de clones DELES. Mon hypothèse est que l’essai de différenciation hématopoïétique publié par le Dr Keller peut être importé dans notre laboratoire et utilisé pour étudier l'engagement hématopoïétique des clones DELES. À l’aide d’essais de RT-QPCR et de FACS, j’ai pu contrôler la cinétique de différenciation hématopoïétique en suivant l’expression des gènes hématopoïétiques et des marqueurs de surface comme CD41, c-kit, RUNX1, GATA2, CD45, β-globine 1 et TER-119. Cet essai sera utilisé pour valider le potentiel hématopoïétique des clones DELES candidats identifiés dans le crible principal. Mon projet secondaire vise à utiliser la même stratégie rétro-virale a base de Cre-loxP utilisée pour générer la bibliothèque DELES pour générer une bibliothèque de cellules KBM-7 contenant des suppressions chromosomiques chevauchantes. Mon but ici est de tester si la lignée cellulaire leuémique humaine presque haploïde KBM-7 peut être exploitée en utilisant l'approche DELES pour créer cette bibliothèque. La bibliothèque de clones KBM-7 servira à définir les activités moléculaires de drogues anti-leucémiques potentielless que nous avons identifiées dans le laboratoire parce qu’elles inhibent la croissance cellulaire dans plusieurs échantillons de leucémie myéloïde aiguë dérivés de patients. Elle me permettra également d'identifier les voies de signalisation moléculaires qui, lorsque génétiquement perturbées, peuvent conférer une résistance à ces drogues.

Regulation of GABA(A) and glutamate receptor expression, synaptic facilitation and long-term potentiation in the hippocampus of prion mutant mice

Background: Prionopathies are characterized by spongiform brain degeneration, myoclonia, dementia, and periodic electroencephalographic (EEG) disturbances. The hallmark of prioniopathies is the presence of an abnormal conformational isoform (PrP(sc)) of the natural cellular prion protein (PrP(c)) encoded by the Prnp gene. Although several roles have been attributed to PrP(c), its putative functions in neuronal excitability are unknown. Although early studies of the behavior of Prnp knockout mice described minor changes, later studies report altered behavior. To date, most functional PrP(c) studies on synaptic plasticity have been performed in vitro. To our knowledge, only one electrophysiological study has been performed in vivo in anesthetized mice, by Curtis and coworkers. They reported no significant differences in paired-pulse facilitation or LTP in the CA1 region after Schaffer collateral/commissural pathway stimulation. Principal Findings: Here we explore the role of PrP(c) expression in neurotransmission and neural excitability using wild-type, Prnp -/- and PrP(c)-overexpressing mice (Tg20 strain). By correlating histopathology with electrophysiology in living behaving mice, we demonstrate that both Prnp -/- mice but, more relevantly Tg20 mice show increased susceptibility to KA, leading to significant cell death in the hippocampus. This finding correlates with enhanced synaptic facilitation in paired-pulse experiments and hippocampal LTP in living behaving mutant mice. Gene expression profiling using Illumina microarrays and Ingenuity pathways analysis showed that 129 genes involved in canonical pathways such as Ubiquitination or Neurotransmission were co-regulated in Prnp -/- and Tg20 mice. Lastly, RT-qPCR of neurotransmission-related genes indicated that subunits of GABA(A) and AMPA-kainate receptors are co-regulated in both Prnp -/- and Tg20 mice. Conclusions/Significance: Present results demonstrate that PrP(c) is necessary for the proper homeostatic functioning of hippocampal circuits, because of its relationships with GABA(A) and AMPA-Kainate neurotransmission. New PrP(c) functions have recently been described, which point to PrP(c) as a target for putative therapies in Alzheimer's disease. However, our results indicate that a "gain of function" strategy in Alzheimer's disease, or a "loss of function" in prionopathies, may impair PrP(c) function, with devastating effects. In conclusion, we believe that present data should be taken into account in the development of future therapies.

Alteraciones en el material genético de pintores de carros expuestos a solventes orgánicos en una localidad de Bogotá

Los solventes orgánicos son sustancias químicas que por sus propiedades físico-químicas son fácilmente inhalados o absorbidos por la piel, pueden causar daños de diversa índole en la salud. En Colombia existen normas que contemplan las medidas de protección, sin embargo persiste la informalidad en el sector de pintores de autos, por lo cual los trabajadores expuestos, a largo plazo pueden ver afectada su salud. En este estudio se analizó la relación entre individuos expuestos laboralmente a los solventes orgánicos versus no expuestos con respecto a la longitud de sus telómeros y formación de fragilidades. Se emplearon muestras de sangre extraídas por venopunción, recolectada en dos tubos: uno con Heparina, destinado al cultivo de linfocitos, para obtener cromosomas metafásicos y evaluar en ellos la presencia de fragilidades; el otro tubo con EDTA, fue empleado para la extracción de ADN y se utilizó para obtener los valores de longitud telomérica mediante la técnica de PCR cuantitativa. Los análisis estadísticos se realizaron aplicando la prueba de rangos de Wilcoxon, en el caso de la presencia de fragilidades se analizó la razón No.Fragilidades/No.Metafases, aplicando el método de Wilcoxon se encontró que existe diferencia estadísticamente significativa entre expuestos y no expuestos (p = 0,036), en donde los expuestos presentan mayor frecuencia de fragilidades. Por otra parte el valor relativo de longitud telomérica del grupo de expuestos fue mayor que el observado en el grupo de no expuestos, esta diferencia fue estadísticamente significativa (Wilcoxon, p = 0.002).

Quantification of ruminal Clostridium proteoclasticum by real-time PCR using a molecular beacon approach

Aims: All members of the ruminal Butyrivibrio group convert linoleic acid (cis-9,cis-12-18 : 2) via conjugated 18 : 2 metabolites (mainly cis-9,trans-11-18 : 2, conjugated linoleic acid) to vaccenic acid (trans-11-18 : 1), but only members of a small branch, which includes Clostridium proteoclasticum, of this heterogeneous group further reduce vaccenic acid to stearic acid (18 : 0, SA). The aims of this study were to develop a real-time polymerase chain reaction (PCR) assay that would detect and quantify these key SA producers and to use this method to detect diet-associated changes in their populations in ruminal digesta of lactating cows. Materials and Results: The use of primers targeting the 16S rRNA gene of Cl. proteoclasticum was not sufficiently specific when only binding dyes were used for detection in real-time PCR. Their sequences were too similar to some nonproducing strains. A molecular beacon probe was designed specifically to detect and quantify the 16S rRNA genes of the Cl. proteoclasticum subgroup. The probe was characterized by its melting curve and validated using five SA-producing and ten nonproducing Butyrivibrio-like strains and 13 other common ruminal bacteria. Analysis of ruminal digesta collected from dairy cows fed different proportions of starch and fibre indicated a Cl. proteoclasticum population of 2-9% of the eubacterial community. The influence of diet on numbers of these bacteria was less than variations between individual cows. Conclusion: A molecular beacon approach in qPCR enables the detection of Cl. proteoclasticum in ruminal digesta. Their numbers are highly variable between individual animals. Signifance and Impact of the Study: SA producers are fundamental to the flow of polyunsaturated fatty acid and vaccenic acid from the rumen. The method described here enabled preliminary information to be obtained about the size of this population. Further application of the method to digesta samples from cows fed diets of more variable composition should enable us to understand how to control these bacteria in order to enhance the nutritional characteristics of ruminant-derived foods, including milk and beef.

Expression of metallothionein genes I and II in bank vole clethrionomys glareolus populations chronically exposed in situ to heavy metals

The expression of two metallothionein genes (Mt-I and Mt-II) in the liver, kidney, and gonad of bank voles collected at four metal-contaminated sites (Cd, Zn, Pb, and Fe) were measured using the quantitative real-time PCR method (QPCR). Relative Mt gene expression was calculated by applying a normalization factor (NF) using the expression of two housekeeping genes, ribosomal 18S and beta-actin. Relative Mt expression in tissues of animals from contaminated sites was up to 54.8-fold higher than those from the reference site for Mt-I and up to 91.6-fold higher for Mt-II. Mt-II gene expression in the livers of bank voles from contaminated sites was higher than Mt-I gene expression. Inversely, Mt-II expression in the kidneys of voles was lower than Mt-I expression. Positive correlations between cadmium levels in the tissues and Mt-I were obtained in all studied tissues. Zinc, which undergoes homeostatic regulation, correlated positively with both Mt-I and Mt-II gene expression only in the kidney. Results showed that animals living in chronically contaminated environments intensively activate detoxifying mechanisms such as metallothionein expression. This is the first time that QPCR techniques to measure MT gene expression have been applied to assess the impact of environmental metal pollution on field collected bank voles.

Expression of target and reference genes in Daphnia magna exposed to ibuprofen

Background: Transcriptomic techniques are now being applied in ecotoxicology and toxicology to measure the impact of stressors and develop understanding of mechanisms of toxicity. Microarray technology in particular offers the potential to measure thousands of gene responses simultaneously. However, it is important that microarrays responses should be validated, at least initially, using real-time quantitative polymerase chain reaction (QPCR). The accurate measurement of target gene expression requires normalisation to an invariant internal control e. g., total RNA or reference genes. Reference genes are preferable, as they control for variation inherent in the cDNA synthesis and PCR. However, reference gene expression can vary between tissues and experimental conditions, which makes it crucial to validate them prior to application. Results: We evaluated 10 candidate reference genes for QPCR in Daphnia magna following a 24 h exposure to the non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) ibuprofen (IB) at 0, 20, 40 and 80 mg IB l(-1). Six of the 10 candidates appeared suitable for use as reference genes. As a robust approach, we used a combination normalisation factor (NF), calculated using the geNorm application, based on the geometric mean of three selected reference genes: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, ubiquitin conjugating enzyme and actin. The effects of normalisation are illustrated using as target gene leukotriene B4 12-hydroxydehydrogenase (Ltb4dh), which was upregulated following 24 h exposure to 63-81 mg IB l(-1). Conclusions: As anticipated, use of the NF clarified the response of Ltb4dh in daphnids exposed to sublethal levels of ibuprofen. Our findings emphasise the importance in toxicogenomics of finding and applying invariant internal QPCR control(s) relevant to the study conditions.

Metallothionein I and II gene expression as a response to metal contamination in bank vole Clethrionomys glareolus

The expression of two metallothionein genes (Mt-I and Mt-II) in the liver, kidney, and gonad of bank voles collected at four metal-contaminated sites (Cd, Zn, Pb, and Fe) were measured using the quantitative real-time PCR method (QPCR). Relative Mt gene expression was calculated by applying a normalization factor (NF) using the expression of two housekeeping genes, ribosomal 18S and beta-actin. Relative Mt expression in tissues of animals from contaminated sites was up to 54.8-fold higher than those from the reference site for Mt-I and up to 91.6-fold higher for Mt-II. Mt-II gene expression in the livers of bank voles from contaminated sites was higher than Mt-I gene expression. Inversely, Mt-II expression in the kidneys of voles was lower than Mt-I expression. Positive correlations between cadmium levels in the tissues and Mt-I were obtained in all studied tissues. Zinc, which undergoes homeostatic regulation, correlated positively with both Mt-I and Mt-II gene expression only in the kidney. Results showed that animals living in chronically contaminated environments intensively activate detoxifying mechanisms such as metallothionein expression. This is the first time that QPCR techniques to measure MT gene expression have been applied to assess the impact of environmental metal pollution on field collected bank voles.

Análise das regiões polimórficas do gene HASPB (K26) de Leishmania infantum em amostras clínicas positivas para leishmaniose visceral e coinfecção LV/HIV

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença grave que afeta a população de vários países, onde o Brasil apresenta a maior prevalência da infecção nas Américas. Com o estudo do gene codificante da proteína B de superfície (HASPB ou K26) de Leishmania infantum é possível identificar as variações polimórficas intraespecíficas e, assim, será possível consolidar a descrição de um perfil polimórfico presente no Estado de Pernambuco. O objetivo do trabalho foi analisar as regiões polimórficas do gene HASPB (K26) de Leishmania infantum em amostras clínicas positivas para leishmaniose visceral e coinfecção LV/HIV. O sistema K26 PCR foi otimizado utilizando concentrações variadas de DNA genômico de L. infantum. Foi realizado o screening de amostras clínicas de DNA através de dois sistemas de PCR simples, kDNA e ITS1/RFLP, para ensaios posteriores com a K26 PCR nas amostras positivas. A curva de dissociação de alta definição (qPCR-HRM) foi empregada na localização de temperaturas de melting específicas para L. infantum. Os amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados as sequencias selecionadas em base de dados. A K26 PCR apresentou limiar de detecção de 1 pg para amplicon de 700 pb. A especificidade dos primers foi avaliada experimentalmente e in silico, apresentando anelamento inespecífico com DNA humano. Em paralelo, foram selecionadas 78 amostras de DNA através dos dois sistemas screening, sendo 17 caracterizadas como L. infantum. Os ensaios com DNA das amostras clínicas para o sistema K26 PCR revelaram bandas espúrias. A análise através qPCR-HRM em DNA genômico do parasita resultou em amplificação com Tm de 88,2 °C, já o ensaio com amostra clínica revelou duas amplificações com distintas temperaturas de melting, 84,6 e 88,2 °C. Três amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados a cinco sequencias da base de dados, indicando 38,2 % de similaridade. Pode-se concluir que o sistema K26 PCR é recomendável para análise dos polimorfismos genéticos, contanto que o DNA seja extraído diretamente de espécies isoladas em meio de cultura.

Diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana utilizando a saliva coletada com swab

As leishmanioses caracterizam-se por um espectro de doenças distribuídas endemicamente em regiões tropicais e subtropicais do mundo. A obtenção de material biológico para análise diagnóstica apresenta cuidados cruciais ao paciente, por se tratar de um processo invasivo, passível de inflamação, e podendo haver reativação da doença, em alguns casos. Diante do avanço das técnicas moleculares e da utilização de alguns fluidos biológicos para o diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), cogitou-se a possibilidade da identificação de DNA de Leishmania spp. em saliva através do método de coleta de swab, sendo contribuinte para o avanço no diagnóstico laboratorial. Assim, o propósito do estudo foi a identificação de DNA de Leishmania spp. a partir do diagnóstico molecular. Foram incluídos no estudo os pacientes que apresentaram lesões ativas, diagnósticos clínicos para LTA, antecedentes epidemiológicos compatíveis e não possuíam lesões cutâneo mucosas. O diagnóstico laboratorial envolveu a abordagem parasitológica através da pesquisa direta do parasito em amostras escarificadas de lesões, enquanto que o molecular compreendeu a extração do DNA das amostras de biópsia e swab salivar, seguidas da reação de PCR convencional (cPCR) e PCR em tempo real (qPCR). Foram investigados 40 pacientes com LTA havendo ocorrência de DNA do parasito em 10 amostras de saliva com cPCR, e 36 amostras utilizando qPCR. Em 28 amostras de biópsias também foi possível a detecção do DNA de Leishmania spp. e em 35 amostras de escarificado de lesão foram encontradas formas amastigotas do parasito, através de pesquisa direta. Na comparação entre os métodos propostos, a biópsia apresentou uma média de 50 por cento de compatibilidade em relação a cPCR e 67,5 por cento para a qPCR. A análise comparativa observou entre o diagnóstico parasitológico e os diagnósticos moleculares uma concordância de 32,5 por cento (14/40) em relação a cPCR, enquanto que a qPCR obteve 75,5 por cento (31/40) de concordância. Considerando a sensibilidade das técnicas de PCR utilizadas e o procedimento de coleta, através de swab advindo de fluidos salivares, os resultados demonstram a viabilidade do método de coleta de Leishmania spp. como uma nova abordagem diagnóstica auxiliar para a LTA, com benefícios à saúde do paciente

Estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na leishmaniose visceral

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania. O trabalho teve como objetivo avaliar estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na LV, que compreenderam a avaliação da eficiência de diferentes métodos de extração de DNA em amostras de urina; a análise do uso da Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) como ferramenta para a detecção do DNA de Leishmania infantum na referida amostra; e a padronização de uma reação duplex qPCR para a detecção simultânea do DNA de L. infantum e do gene G3PD (controle endógeno). Depois da escolha do protocolo de extração de DNA mais apropriado, e após a otimização e a análise de reprodutibilidade, uma qPCR em urina foi padronizada. Em paralelo, após o desenho e a síntese de sondas TaqMan® compatíveis com os sistemas LINF 1B e G3PD1, após otimização e análise de reprodutibilidade, uma duplex qPCR em sangue também foi padronizada. Para avaliação dos protocolos desenvolvidos foram utilizadas técnicas de estatística descritiva. Para análise comparativa com técnicas clássicas de diagnóstico da LV utilizou-se Teste Qui Quadrado de independência ou Teste Exato de Fisher (p<0,05 e p<0,01, respectivamente). Como resultados, após otimização, o limite de detecção alcançado pela qPCR em urina utilizando o protocolo de extração selecionado (kit comercial) foi de 5 fg/microlitros de amostra 0,034 parasitos) A duplex qPCR em sangue alcançou um limite de detecção de 2x102 fg/microlitros de amostra 1,4 (ou ~ 1,4 parasito), após a otimização. A partir dos dados estatísticos obtidos, pôde-se analisar alta concordância percentual entre a qPCR e urina e o conjunto de critérios diagnósticos (sorologia rK39 + qPCR em sangue), bem como entre a duplex qPCR em sangue e a qPCR em sangue, para os Grupos 01 (pacientes com suspeita de LV) e 02 (pacientes HIV positivos co-infectados ou não). Como um conjunto de critérios, os dois novos ensaios obtiveram excelentes concordâncias com o conjunto de técnicas clássicas: 88,89 por cento e 94,74 por cento para os Grupos 01 e 02, respectivamente. Não houve diferenças estatísticas significativas entre os testes. Pôde-se concluir que ambos os ensaios mostraram bom potencial para a incorporação, após validação, ao diagnóstico da LV; em conjunto ou individualmente (quando necessário), trazendo mais conforto, praticidade, confiabilidade e rapidez ao diagnóstico definitivo da patologia

Avaliação de duas técnicas de reação em cadeia da polimerase na detecção do Mycobacterium tuberculosis em diferentes amostras biológicas

A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis e que permanece como um importante problema de saúde pública mundial, sendo a TB pulmonar a forma mais comum de apresentação da doença. O diagnóstico precoce e tratamento adequado são essenciais para a eficácia dos programas públicos de controle da TB. Novos metodologias mais rápidas, sensíveis e específicas, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), vem sendo propostas no diagnóstico da doença. O objetivo desse estudo foi avaliar o desempenho de duas PCR, a PCR em tempo real (qPCR) e a Nested PCR em único tubo (STNPCR), em diferentes amostras biológicas, no diagnóstico da tuberculose pulmonar, além de compará-las com as metodologias convencionais (baciloscopia e cultura) e entre si. Para isso foram analisados 125 pacientes que tiveram amostras de sangue (125 amostras de plasma e 116 amostras de PBMC), urina (n=125) e escarro (n=125) coletadas, totalizando a análise de 491 amostras biológicas. Amostras de escarro e urina foram descontaminadas pelo método de Petroff NAOH 4 por cento modificado e semeadas em meio de cultura Lõwenstein-Jensen (LJ), enquanto as amostras de sangue eram separadas em plasma e PBMC. Após processamento, deu-se a extração de DNA através do kit comercial da Qiagen seguida de amplificação pelas duas metodologias de PCR. Para análise estatística calculou-se a sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo e negativo e índice kappa das técnicas. A STNPCR apresentou, em amostras de sangue, sensibilidade de 26,3 por cento e especificidade de 97,7 por cento. Em amostras de urina observou-se uma S = 7,9 por cento e E = 98,9 por cento e em escarro S = 21,1 por cento e E = 98,9 por cento. Quando analisadas as asmotras em paralelo, a sensibilidade da STNPCR foi igual a 44,7 por cento enquanto sua especificidade foi 97,7 por cento. Já a qPCR, em amostras de sangue, obteve sensibilidade igual a 26,3 por cento e especificidade de 95,4 por cento. Em amostras de urina a sensibilidade obtida foi 47,4 por cento e a especificidade 79,3 por cento e, em escarro, S = 36,8 por cento e E = 95,4 por cento. Quando analisada em paralelo, a sensibilidade da qPCR foi 65,8 por cento e a especificidade foi 79,3 por cento. A baciloscopia de escarro apresentou sensibilidade de 41,7 por cento e especificidade de 100 por cento, enquanto as culturas em urina e escarro apresentaram sensibilidade e especificidade, respectivamente, de 10,5 por cento e 100 por cento e 60,5 por cento e 96,6 por cento. Pode-se concluir que a qPCR apresentou melhor desempenho quando comparada à STNPCR e também bom desempenho quando comparada às metodologias convencionais, e que quando analisa-se mais de um tipo de amostras biológica, a eficácia das técnicas é aumentada. Espera-se que com a utilização dessa técnica molecular, seja possível a melhor elucidação dos casos de TB pulmonar, promovendo maior taxa de tratamento dos pacientes e menor risco de transmissão da doença