Structural studies on enzymes of biotechnological and biomedical interest

Structural studies of proteins aim at elucidating the atomic details of molecular interactions in biological processes of living organisms. These studies are particularly important in understanding structure, function and evolution of proteins and in defining their roles in complex biological settings. Furthermore, structural studies can be used for the development of novel properties in biomolecules of environmental, industrial and medical importance. X-ray crystallography is an invaluable tool to obtain accurate and precise information about the structure of proteins at the atomic level. Glutathione transferases (GSTs) are amongst the most versatile enzymes in nature. They are able to catalyze a wide variety of conjugation reactions between glutathione (GSH) and non-polar components containing an electrophilic carbon, nitrogen or sulphur atom. Plant GSTs from the Tau class (a poorly characterized class) play an important role in the detoxification of xenobiotics and stress tolerance. Structural studies were performed on a Tau class fluorodifen-inducible glutathione transferase from Glycine max (GmGSTU4-4) complexed with GSH (2.7 Å) and a product analogue Nb-GSH (1.7 Å). The three-dimensional structure of the GmGSTU4-4-GSH complex revealed that GSH binds in different conformations in the two subunits of the dimer: in an ionized form in one subunit and a non-ionized form in the second subunit. Only the ionized form of the substrate may lead to the formation of a catalytically competent complex. Structural comparison between the GSH and Nb-GSH bound complexes revealed significant differences with respect to the hydrogen-bonding, electrostatic interaction pattern, the upper part of -helix H4 and the C-terminus of the enzyme. These differences indicate an intrasubunit modulation between the G-and Hsites suggesting an induced-fit mechanism of xenobiotic substrate binding. A novel binding site on the surface of the enzyme was also revealed. Bacterial type-II L-asparaginases are used in the treatment of haematopoietic diseases such as acute lymphoblastic leukaemia (ALL) and lymphomas due to their ability to catalyze the conversion of L-asparagine to L-aspartate and ammonia. Escherichia coli and Erwinia chrysanthemi asparaginases are employed for the treatment of ALL for over 30 years. However, serious side-effects affecting the liver and pancreas have been observed due to the intrinsic glutaminase activity of the administered enzymes. Structural studies on Helicobacter pylori L-asparaginase (HpA) were carried out in an effort to discover novel L-asparaginases with potential chemotherapeutic utility in ALL treatment. Detailed analysis of the active site geometry revealed structurally significant differences between HpA and other Lasparaginases that may be important for the biological activities of the enzyme and could be further exploited in protein engineering efforts.

Studies in offset ink setting

The offset printing process is complex and involves the meeting of two essentially complex materials, printing ink and paper, upon which the final product is formed. It can therefore be expected that a multitude of chemical and physical interactions and mechanisms take place at the ink-paper interface. Interactions between ink and paper are of interest to both the papermakers and ink producers, as they wish to achieve better quality in the final product. The objective of this work is to clarify the combined influence of paper coating structure, printing ink and fountain solution on ink setting and the problems related to ink setting. A further aim is to identify the mechanisms that influence ink setting problems, and to be able to counteract them by changing properties of the coating layer or by changing the properties of the ink. The work carried out for this thesis included use of many techniques ranging from standard paper and printability tests to advanced optical techniques for detection of ink filaments during ink levelling. Modern imaging methods were applied for assessment of ink filament remain sizes and distribution of ink components inside pigment coating layers. Gravimetric filtration method and assessment of print rub using Ink-Surface-Interaction-Tester (ISIT) were utilized to study the influence of ink properties on ink setting. The chemical interactions were observed with the help of modified thin layer chromatography and contact angle measurements using both conventional and high speed imaging. The results of the papers in this thesis link the press operational parameters to filament sizes and show the influence of these parameters to filament size distribution. The relative importance between the press operation parameters was shown to vary. The size distribution of filaments is important in predicting the ink setting behaviour, which was highlighted by the dynamic gloss and ink setting studies. Prediction of ink setting behaviour was also further improved by use of separate permeability factors for different ink types in connection to filtration equations. The roles of ink components were studied in connection to ink absorption and mechanism of print rub. Total solids content and ratio of linseed oil to mineral oil were found to determine the degree of print rub on coated papers. Wax addition improved print rub resistance, but would not decrease print rub as much as lowering the total solids content in the ink. Linseed oil was shown to absorb into pigment coating pores by mechanism of adsorption to pore walls, which highlights the need for sufficient pore surface area for improved chromatographic separation of ink components. These results should help press operators, suppliers of printing presses, papermakers and suppliers to papermakers, to better understand the material and operating conditions of the press as it relates to various print quality issues. Even though paper is in competition with electronic media, high quality printed products are still in demand. The results should provide useful information for this segment of the industry.

Method of numerical correction of errors occasioned by delay of records during the monitoring of environmental variables of interest for animal production

Thermal and air conditions inside animal facilities change during the day due to the influence of the external environment. For statistical and geostatistical analyses to be representative, a large number of points spatially distributed in the facility area must be monitored. This work suggests that the time variation of environmental variables of interest for animal production, monitored within animal facility, can be modeled accurately from discrete-time records. The aim of this study was to develop a numerical method to correct the temporal variations of these environmental variables, transforming the data so that such observations are independent of the time spent during the measurement. The proposed method approached values recorded with time delays to those expected at the exact moment of interest, if the data were measured simultaneously at the moment at all points distributed spatially. The correction model for numerical environmental variables was validated for environmental air temperature parameter, and the values corrected by the method did not differ by Tukey's test at 5% significance of real values recorded by data loggers.

Pohjoiset maisemat : "Eurooppalaisen maisemayleissopimuksen toteuttaminen Pohjois-Kalotin kunnissa" - Konferenssi Inarissa 7.-9.9.2011

Kansainvälinen Eurooppalaisen maisemayleissopimuksen tavoitteiden saavuttamista edistävä konferenssi järjestettiin Inarissa 7.-9.9.2011. Konferenssissa käsiteltiin maisemasopimuksen tavoitteita, tarpeita ja mahdollisuuksia Pohjois-Kalotin alueella. Tähän raporttiin on koottu konferenssissa esiintyneiden asiantuntijoiden laatimat artikkelit aiheesta. Raportin toivotaan helpottavan alueiden käytön suunnittelijoita käytännön työssään ja rohkaisevan kuntia toteuttamaan tulevaisuuden suunnittelua Eurooppalaisen maisemayleissopimuksen tavoitteiden mukaisesti. Raportti on saatavissa viidellä eri kielellä: suomeksi, ruotsiksi, norjaksi, pohjoissaameksi ja englanniksi. Pohjois-Kalotin aluetta yhdistää yhteinen tunnusomainen maisema. Saamelaiskulttuurin sekä poronhoidon muovaamat tunturimaisemat ja upeat jokivarsimaisemat heijastuvat ympäristössä laaja-alaisesti. Alueen maisemalle haasteita tuovat sen moninaiset maankäyttömuodot ja elinkeinot, kuten matkailu, kaivosteollisuus ja energiantuotanto. Arvokkaiden maisemapiirteiden säilyttäminen vaatii erityistä tuntemusta ja tietämystä alueen kunnissa. Maisemansuojelua ja -hoitoa toteutetaan alueiden- ja maankäytön suunnittelun kautta, pääasiallisesti kaavoituksella ja maisemanhoitosuunnitelmilla. Pohjois-Kalotin alueen kunnissa on erilaiset osin toisistaan poikkeavat toimintatavat ja käytännöt maisemanhoidossa. Kuitenkin alueen asukkailla on yhtäläisiä intressejä elinympäristönsä suojeluun ja säilyttämiseen. Maisema nähdään vetovoimatekijänä, jota ei haluta menettää. Lisääntyvät maankäyttötarpeet kunnissa luovat tarpeen entistä moniulotteisemmalle suunnittelulle. Paikallisten tahojen osallistaminen suunnitteluprosesseihin aikaisessa vaiheessa ja monimuotoinen vuorovaikutus, niin toimijoiden, kansalaisten kuin viranomaisten välillä vähentää konfliktien muodostumista. Tutkimustiedon tehokkaampi hyödyntäminen ja valtiorajat ylittävä yhteistyö helpottaa päätöksentekoa ja luo yhteisiä linjoja maisemansuojelutyöhön. Yhteiset kokemukset, käytännöt ja tietotaidon jakaminen sekä laajemman maisemakokonaisuuden hahmottaminen parantaa eurooppalaisen maisemayleissopimuksen tavoitteiden toteutumista. Työn jatkuvuuden varmistamiseksi Pohjois-Kalotin alueelle suunnitellaan perustettavaksi maisemayhteistyöryhmä, jonka tehtävä on maisemapolitiikan kehittäminen ja eteenpäin vieminen.

Northern Landscapes : ʻʻImplementation of the European Landscape Convention In the North Calotte Area Municipalitiesʼʼ - Conference in Inari, Finland 7-9.9.2011

The conference promoting the objectives of the international European Landscape Convention (ELC) was held on 7-9 September 2011 in Inari. The primary aim of the conference was to increase awareness of the ELC and the prospects and requirements it brings to practical planning work, especially at the municipal level. The conference speakers included top experts from Sweden, Norway, Finland, France, Holland and Catalonia. This report is a collection of articles written by the experts in the ELC conference. The report is available in five languages: Finnish, Swedish, Norwegian, Northern Sámi and English. The common characteristics of the North Calotte area, such as the magnificent riverside scenery and the beautiful fell landscapes formed by the Sámi culture and reindeer management are broadly reflected in the environment. Alongside the traditional forms of land use, many other livelihoods and forms of land use now need to be accommodated in the area. Tourism, energy production, mining industry and new infrastructure create new and manifold challenges to the authorities in charge of land use in these areas. Municipalities need information and support for versatile planning in the future, so that the unique and valuable characteristics of the North can be preserved. Landscape protection and management in the landscape areas is executed through areal and land use planning, mainly through town planning and the creation of landscape management plans. The municipalities in the North Calotte region have their own partly divergent methods and practices, based on the various land use processes are executed. The municipalities and inhabitants have a great interest in preserving and protecting their living environment and maintaining and increasing the appeal of the area. Landscape is viewed as one of the most significant appealing factors that cannot be lost. The increasing land use in municipalities, for example due to energy production, mining industry and increasing tourism, create a need for more multidimensional planning. The reconciliation of the wishes of different interest groups, and traditional and new livelihoods will not be easy. Conflict is inevitable. This will lead to a greater need to engage local bodies to the planning processes right from the start of the projects. Close cooperation between different administrative branches, operators, local bodies and landscape research promote the objectives of the convention. To ensure that the work continues, a landscape co-operation group is planned to be established in the North Calotte area. It´s main task is to promote and develop landscape policy in the area.

Landskapet i nord : ”Gjennomføring av Den europeiska Landskapskonvensjonen i kommunene på Nord-Kalotten” – Konferansen 7.-9. 9.2011, Enare, Finland

Kansainvälinen Eurooppalaisen maisemayleissopimuksen tavoitteiden saavuttamista edistävä konferenssi järjestettiin Inarissa 7.-9.9.2011. Konferenssissa käsiteltiin maisemasopimuksen tavoitteita, tarpeita ja mahdollisuuksia Pohjois-Kalotin alueella. Tähän raporttiin on koottu konferenssissa esiintyneiden asiantuntijoiden laatimat artikkelit aiheesta. Raportin toivotaan helpottavan alueiden käytön suunnittelijoita käytännön työssään ja rohkaisevan kuntia toteuttamaan tulevaisuuden suunnittelua Eurooppalaisen maisemayleissopimuksen tavoitteiden mukaisesti. Raportti on saatavissa viidellä eri kielellä: suomeksi, ruotsiksi, norjaksi, pohjoissaameksi ja englanniksi. Pohjois-Kalotin aluetta yhdistää yhteinen tunnusomainen maisema. Saamelaiskulttuurin sekä poronhoidon muovaamat tunturimaisemat ja upeat jokivarsimaisemat heijastuvat ympäristössä laaja-alaisesti. Alueen maisemalle haasteita tuovat sen moninaiset maankäyttömuodot ja elinkeinot, kuten matkailu, kaivosteollisuus ja energiantuotanto. Arvokkaiden maisemapiirteiden säilyttäminen vaatii erityistä tuntemusta ja tietämystä alueen kunnissa. Maisemansuojelua ja -hoitoa toteutetaan alueiden- ja maankäytön suunnittelun kautta, pääasiallisesti kaavoituksella ja maisemanhoitosuunnitelmilla. Pohjois-Kalotin alueen kunnissa on erilaiset osin toisistaan poikkeavat toimintatavat ja käytännöt maisemanhoidossa. Kuitenkin alueen asukkailla on yhtäläisiä intressejä elinympäristönsä suojeluun ja säilyttämiseen. Maisema nähdään vetovoimatekijänä, jota ei haluta menettää. Lisääntyvät maankäyttötarpeet kunnissa luovat tarpeen entistä moniulotteisemmalle suunnittelulle. Paikallisten tahojen osallistaminen suunnitteluprosesseihin aikaisessa vaiheessa ja monimuotoinen vuorovaikutus, niin toimijoiden, kansalaisten kuin viranomaisten välillä vähentää konfliktien muodostumista. Tutkimustiedon tehokkaampi hyödyntäminen ja valtiorajat ylittävä yhteistyö helpottaa päätöksentekoa ja luo yhteisiä linjoja maisemansuojelutyöhön. Yhteiset kokemukset, käytännöt ja tietotaidon jakaminen sekä laajemman maisemakokonaisuuden hahmottaminen parantaa eurooppalaisen maisemayleissopimuksen tavoitteiden toteutumista. Työn jatkuvuuden varmistamiseksi Pohjois-Kalotin alueelle suunnitellaan perustettavaksi maisemayhteistyöryhmä, jonka tehtävä on maisemapolitiikan kehittäminen ja eteenpäin vieminen.

Davviduovdagat : ”Eurohpálaš duovddaoktasašsoahpamuša ollašuhttin Davvikalohta gielddain” Konfereansa čakčamánu 7.-9. beaivve 2011, Anár, Suopma

Kansainvälinen Eurooppalaisen maisemayleissopimuksen tavoitteiden saavuttamista edistävä konferenssi järjestettiin Inarissa 7.-9.9.2011. Konferenssissa käsiteltiin maisemasopimuksen tavoitteita, tarpeita ja mahdollisuuksia Pohjois-Kalotin alueella. Tähän raporttiin on koottu konferenssissa esiintyneiden asiantuntijoiden laatimat artikkelit aiheesta. Raportin toivotaan helpottavan alueiden käytön suunnittelijoita käytännön työssään ja rohkaisevan kuntia toteuttamaan tulevaisuuden suunnittelua Eurooppalaisen maisemayleissopimuksen tavoitteiden mukaisesti. Raportti on saatavissa viidellä eri kielellä: suomeksi, ruotsiksi, norjaksi, pohjoissaameksi ja englanniksi. Pohjois-Kalotin aluetta yhdistää yhteinen tunnusomainen maisema. Saamelaiskulttuurin sekä poronhoidon muovaamat tunturimaisemat ja upeat jokivarsimaisemat heijastuvat ympäristössä laaja-alaisesti. Alueen maisemalle haasteita tuovat sen moninaiset maankäyttömuodot ja elinkeinot, kuten matkailu, kaivosteollisuus ja energiantuotanto. Arvokkaiden maisemapiirteiden säilyttäminen vaatii erityistä tuntemusta ja tietämystä alueen kunnissa. Maisemansuojelua ja -hoitoa toteutetaan alueiden- ja maankäytön suunnittelun kautta, pääasiallisesti kaavoituksella ja maisemanhoitosuunnitelmilla. Pohjois-Kalotin alueen kunnissa on erilaiset osin toisistaan poikkeavat toimintatavat ja käytännöt maisemanhoidossa. Kuitenkin alueen asukkailla on yhtäläisiä intressejä elinympäristönsä suojeluun ja säilyttämiseen. Maisema nähdään vetovoimatekijänä, jota ei haluta menettää. Lisääntyvät maankäyttötarpeet kunnissa luovat tarpeen entistä moniulotteisemmalle suunnittelulle. Paikallisten tahojen osallistaminen suunnitteluprosesseihin aikaisessa vaiheessa ja monimuotoinen vuorovaikutus, niin toimijoiden, kansalaisten kuin viranomaisten välillä vähentää konfliktien muodostumista. Tutkimustiedon tehokkaampi hyödyntäminen ja valtiorajat ylittävä yhteistyö helpottaa päätöksentekoa ja luo yhteisiä linjoja maisemansuojelutyöhön. Yhteiset kokemukset, käytännöt ja tietotaidon jakaminen sekä laajemman maisemakokonaisuuden hahmottaminen parantaa eurooppalaisen maisemayleissopimuksen tavoitteiden toteutumista. Työn jatkuvuuden varmistamiseksi Pohjois-Kalotin alueelle suunnitellaan perustettavaksi maisemayhteistyöryhmä, jonka tehtävä on maisemapolitiikan kehittäminen ja eteenpäin vieminen.

Nordliga landskap : "Tillämpning av den europeiska landskapskonventionen i kommunerna på Nordkalotten" - Konferensen 7.-9.9.2011, Enare, Finland

För att kunna nå de uppsatta målen för den europeiska landskapskonventionen anordnades en internationell europeisk konferens den 7–9 september 2011 i Enare. Konferensen var främst inriktad på att öka kunskapen om den europeiska landskapskonventionen och de möjligheter och behov den ger vad gäller det praktiska planeringsarbetet, särkilt på kommunnivå. Den här rapport är samlat artikel skrev av ledande expertes som var föreläsare i konferensen. Vi hoppas att den här rapport underlättar det praktiska arbetet för planerarna av de här områdena och inspirerar kommunerna att genomföra sina framtidsplaner enligt den europeiska landskapskonventionen. Publikationen finns tillgänglig på fem olika språk: finska, svenska, norska, nordsamiska och engelska. Naturen på Nordkalotten återspeglar på bred front de gemensamma karaktäristiska dragen, såsom de fantastiska älvlandskapen och de vackra fjälltrakterna formade av samekulturen och renskötseln. Turism, energiproduktion, gruvnäring och utbyggnad av infrastruktur leder till nya och mångfacetterade utmaningar för dem som är ansvariga för områdena. Kommunerna behöver kunskap och stöd för att kunna förverkliga de allt mer komplexa planerna i framtiden, så att de unika och värdefulla särdragen kan bevaras. Landskapsskyddet och -vården genomförs i landskapsområdena via områdesplanering och planering av markanvändning, i huvudsak genom planläggning och utarbetande av landskapsvårdsplaner. Kommunerna i Nordkalotten har egna, delvis olikartade metoder och praxis, på basis av vilka olika processer i anslutning till områdesanvändningen sköts. Kommunerna och kommuninvånarna har ett stort intresse att bevara och skydda den egna livsmiljön och att upprätthålla och öka områdets attraktionskraft. Landskapet ses ju i kommunerna som en av de viktigaste attraktionsfaktorerna som man inte vill förlora. Kommunernas ökade markanvändningsbehov med avseende på bland annat energiproduktionen, gruvindustrin och den växande turistnäringen skapar ett välgrundat behov av en planering med ännu fler dimensioner. Det är viktigt att lokala intressegrupper deltar i planeringen redan i början av processen. Mångsidigt samarbete mellan medborgare, aktörer och myndigheter kan minska eller hindra konflikter. En dialog mellan medborgare, organisationer och myndigheter har en stor inverkan på många projekts effekter på landskapet. Med hjälp av forskning får vi mer information om landskapen, deras betydelse och hur olika markanvändningsmetoder påverkar landskapen. Gemensamma erfarenheter och praktik, uppdelningen av kunnande (know-how) samt uppfattningen av bredare landkapshelheten dörbättrar tilsammans de möjligheterna att förverkliga målen som definierats i Europeiska landskapkonventionen.För att säkerställa att arbetet fortsätter upprättas en landskapssamarbetsgrupp på Nordkalottens område, som huvuduppgift är att utveckla landskapspolitiken och driva den framåt.

Conservation laws for non-potential operators

The aim of this work is to study the conservation laws of continuous means mechanics and also to extend the Hamiltonian method for these kind of systems in order to valid for non-potential operators through variational approach. Besides illustrating with various examples of mechanical applications we also introduce in this work the new technique in order to treat such problems as the non-potential problem.

Railways, Airports and Sea Container Operators as Publicly Listed Companies – Financial Performance and Shareholder Value Creation Perspective

Logistics infrastructure and transportation services have been the liability of countries and governments for decades, or these have been under strict regulation policies. One of the first branches opened for competition in EU as well as in other continents, has been air transports (operators, like passenger and freight) and road transports. These have resulted on lower costs, better connectivity and in most of the cases higher service quality. However, quite large amount of other logistics related activities are still directly (or indirectly) under governmental influence, e.g. railway infrastructure, road infrastructure, railway operations, airports, and sea ports. Due to the globalization, governmental influence is not that necessary in this sector, since transportation needs have increased with much more significant phase as compared to economic growth. Also freight transportation needs do not correlate with passenger side, due to the reason that only small number of areas in the world have specialized in the production of particular goods. Therefore, in number of cases public-private partnership, or even privately owned companies operating in these sub-branches have been identified as beneficial for countries, customers and further economic growth. The objective of this research work is to shed more light on these kinds of experiments, especially in the relatively unknown sub-branches of logistics like railways, airports and sea container transports. In this research work we have selected companies having public listed status in some stock exchange, and have needed amount of financial scale to be considered as serious company rather than start-up phase venture. Our research results show that railways and airports usually need high fixed investments, but have showed in the last five years generally good financial performance, both in terms of profitability and cash flow. In contrary to common belief of prosperity in globally growing container transports, sea vessel operators of containers have not shown that impressive financial performance. Generally margins in this business are thin, and profitability has been sacrificed in front of high growth – this also concerns cash flow performance, which has been lower too. However, as we examine these three logistics sub-branches through shareholder value development angle during time period of 2002-2007, we were surprised to find out that all of these three have outperformed general stock market indexes in this period. More surprising is the result that financially a bit less performing sea container transportation sector shows highest shareholder value gain in the examination period. Thus, it should be remembered that provided analysis shows only limited picture, since e.g. dividends were not taken into consideration in this research work. Therefore, e.g. US railway operators have disadvantage to other in the analysis, since they have been able to provide dividends for shareholders in long period of time. Based on this research work we argue that investment on transportation/logistics sector seems to be safe alternative, which yields with relatively low risk high gain. Although global economy would face smaller growth period, this sector seems to provide opportunities in more demanding situation as well.

Fuzzy tolerance/equivalence relations from intersection, union and complement operators and their application to a clustering method

This master thesis work introduces the fuzzy tolerance/equivalence relation and its application in cluster analysis. The work presents about the construction of fuzzy equivalence relations using increasing generators. Here, we investigate and research on the role of increasing generators for the creation of intersection, union and complement operators. The objective is to develop different varieties of fuzzy tolerance/equivalence relations using different varieties of increasing generators. At last, we perform a comparative study with these developed varieties of fuzzy tolerance/equivalence relations in their application to a clustering method.

Nanoparticle-Assisted Immunoassays for Point-of-Care Testing - With Specific Interest in Minimally Interference-Prone Assays for Cardiac Troponin I

Cardiac troponins (cTn) I and T are the current golden standard biochemical markers in the diagnosis and risk stratification of patients with suspected acute coronary syndrome. During the past few years, novel assays capable of detecting cTn‐concentrations in >50% of apparently healthy individuals have become readily available. With the emerging of these high sensitivity cTn assays, reductions in the assay specificity have caused elevations in the measured cTn levels that do not correlate with the clinical picture of the patient. The increased assay sensitivity may reveal that various analytical interference mechanisms exist. This doctoral thesis focused on developing nanoparticle‐assisted immunometric assays that could possibly be applied to an automated point‐of‐care system. The main objective was to develop minimally interference‐prone assays for cTnI by employing recombinant antibody fragments. Fast 5‐ and 15‐minute assays for cTnI and D‐dimer, a degradation product of fibrin, based on intrinsically fluorescent nanoparticles were introduced, thus highlighting the versatility of nanoparticles as universally applicable labels. The utilization of antibody fragments in different versions of the developed cTnI‐assay enabled decreases in the used antibody amounts without sacrificing assay sensitivity. In addition, the utilization of recombinant antibody fragments was shown to significantly decrease the measured cTnI concentrations in an apparently healthy population, as well as in samples containing known amounts of potentially interfering factors: triglycerides, bilirubin, rheumatoid factors, or human anti‐mouse antibodies. When determining the specificity of four commercially available antibodies for cTnI, two out of the four cross‐reacted with skeletal troponin I, but caused crossreactivity issues in patient samples only when paired together. In conclusion, the results of this thesis emphasize the importance of careful antibody selection when developing cTnI assays. The results with different recombinant antibody fragments suggest that the utilization of antibody fragments should strongly be encouraged in the immunoassay field, especially with analytes such as cTnI that require highly sensitive assay approaches.