Produção e caracterização de quitooligossacarídeos produzidos pelo fungo Metarhizium anisopliae e avaliação da citotoxicidade em células tumorais

Chitosan is a natural polymer, biodegradable, nontoxic, high molecular weight derived from marine animals, insects and microorganisms. Oligomers of glucosamine (GlcN) and N-acetylglucosamine (GlcNAc) have interesting biological activities, including antitumor effects, antimicrobial activity, antioxidant and others. The alternative proposed by this work was to study the viability of producing chitooligosaccharides using a crude enzymes extract produced by the fungus Metarhizium anisopliae. Hydrolysis of chitosan was carried out at different times, from 10 to 60 minutes to produce chitooligosaccharides with detection and quantification performed by High Performace Liquid Chromatography (HPLC). The evaluation of cytotoxicity of chitosan oligomers was carried out in tumor cells (HepG2 and HeLa) and non-tumor (3T3). The cells were treated for 72 hours with the oligomers and cell viability investigated using the method of MTT. The production of chitosan oligomers was higher for 10 minutes of hydrolysis, with pentamers concentration of 0.15 mg/mL, but the hexamers, the molecules showing greater interest in biological properties, were observed only with 30 minutes of hydrolysis with a concentration of 0.004 mg/mL. A study to evaluate the biological activities of COS including cytotoxicity in tumor and normal cells and various tests in vitro antioxidant activity of pure chitosan oligomers and the mixture of oligomers produced by the crude enzyme was performed. Moreover, the compound with the highest cytotoxicity among the oligomers was pure glucosamine, with IC50 values of 0.30; 0.49; 0.44 mg/mL for HepG2 cells, HeLa and 3T3, respectively. Superoxide anion scavenging was the mainly antioxidant activity showed by the COS and oligomers. This activity was also depending on the oligomer composition in the chitosan hydrolysates. The oligomers produced by hydrolysis for 20 minutes was analyzed for the ability to inhibit tumor cells showing inhibition of proliferation only in HeLa cells, did not show any effect in HepG2 cells and fibroblast cells (3T3)

O papel do inflamassoma na infecção induzida pelas formas saprofíticas do fungo Fonsecaea pedrosoi

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016.

Efeito do fungo Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. (Deuteromycetes) para Astyanax scabripinnis (Jenyns, 1842) (Pisces: Characidae).

Avaliou-se o efeito de Metarhizium anisopliae (Metsch.) para Astyanax scabripinnis (Jenyns, 1842)(Pisces, Characidae), em condições de laboratório. Suspensões aquosas de conídios recémproduzidos, viáveis (viabilidade mínima 90%) e inviabilizados por meio de autoclavagem (121º C, 20 minutos, a 1 atm), na concentração de 6,5 x 1010 conídios/aquário (equivalente a 5 x 1015 conídios/ ha, que representa 1.000 vezes a concentração recomendada para o controle de cigarrinhas de pastagens, principal praga-alvo deste entomopatógeno no Brasil), foram aplicadas em aquários contendo A. scabripinnis. Foram analisadas amostras de água e dos peixes, dos quais foram dissecados as brânquias e o estômago, em diferentes intervalos de tempo, a fim de se avaliar a presença dos conídios. Observaram-se diariamente o comportamento e a mortalidade de peixes em ambos os tratamentos. Avaliou-se nos peixes sobreviventes a morfologia das células das brânquias e do fígado. Verificou-se que nas brânquias não houve alteração no número de conídios ao longo de 16 dias de contato, sendo que no estômago houve um ligeiro acréscimo inicial seguido de redução constante. A viabilidade dos conídios em todos os locais avaliados decresceu após 24 horas da aplicação. Constatou-se que não houve morte ou quaisquer alterações comportamentais após 30 dias de contato, indicando a ausência de efeitos adversos associados à capacidade do fungo em provocar infecção ou exercer efeitos tóxicos em ambos os organismos-teste.

Avaliação do extrato do fungo caripia montagnei e de agonistas de PPAR - α no processo inflamatório

The mushrooms have been object of intense research in view of its potential raising of application in different sectors of the pharmacology and alimentary industry. Among diverse bioactive composites of polyssacharides nature that exist in the fungus the glucans are much searched. These are polymers of glucose and classified as the type of glicosidic linking [α, β]. Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs), ranscription factors belonging to the family of nuclear receptors that bind themselves o specific agonists, have shown their importance in controlling the inflammatory process. The aim of this study was to perform a chemical characterization of extract rom the mushroom Caripia montagnei, assess its antiinflammatory and antibacterial effect and determine if this effect occurs via PPAR. This mushroom is composed of carbohydrates (63.3±4.1%), lipids (21.4l±0.9%) and proteins (2.2± 0.3%). The aqueous solution resulting from the fractionation contained carbohydrates (98.7±3.3%) and protein (1.3±0.25%). Analyses of infrared spectrophotometry and of nuclear magnetic esonance demonstrated that the extract of mushroom C. montagnei is rich in β-glucans. In hioglycolate-induced peritonitis, the C. montagnei glucans (50 mg/kg) educed the inflammatory process in 65.5±5.2% and agonists, pharmacological igands, for PPAR: Wy-14643 (49.3±6.1%), PFOA (48.9±3.8%) and clofibrate in 45.2±3.2%. Sodium diclofenac showed a reduction of 81.65±0.6%. In the plantar edema, the glucans from C. montagnei (50 mg/kg) and L-NAME reduced the edema to a similar degree 91.4±0.3% and 92.8±0,5 %, respectively. In all the groups tested, nitric oxide (NO), an inflammation mediator, showed a significant reduction in the nitrate/nitrite levels when compared to the positive control (P<0.001). The C. montagnei glucans did not show cytotoxicity in the concentrations tested (2.5, 5.0, 10.0, 20.0 and 40.0 µg/100 µL). Antibacterial activity demonstrated that, unlike total extract, there was no inhibition of bacterial growth. The C. montagnei glucans show great potential for antiinflammatory applications. This effect suggests that it is mediated by PPAR activation and by COX and iNOS inhibition

Bactérias endofíticas do morangueiro antagônicas ao fungo Pestalotiopsis longisetula.

A pestalotiose tem sido, nos últimos três anos, a principal doença da cultura do morango em todas as regiões produtoras do sul de Minas Gerais. A aplicação de fungicidas disponíveis no mercado não tem controlado o fungo Pestalotiopsis longisetula. Isolamento de microrganismos endofíticos de plantas cultivadas em sistemas orgânico e convencional da região foi realizado com o objetivo de selecionar bactérias com potencial antagônico ao fungo patogênico. Como resultados desse estudo foram obtidos 25 isolados capazes de inibir o crescimento daquele fungo. Das bactérias isoladas as mais promissoras foram a P2C1-3 e a P2F1-1 que controlaram o crescimento do fungo em aproximadamente 40%.

Bactérias endofíticas do morangueiro antagônicas ao fungo Pestalotiopsis longisetula.

2008

Inoculação de bactérias diazotroficas e fungos micorrizico-arbusculares na cultura da mandioca

A versatilidade da mandioca (Manihot esculenta Crantz) em adaptar-se a solos de baixa fertilidade, apesar de possuir alto requerimento de nutrientes, tem sido relacionada à ocorrência de associações com os fungos micorrízico-arbusculares (FMA) e a bactérias diazotróficas. Visando avaliar o efeito da inoculação dos FMA e das bactérias diazotróficas, foi conduzido um experimento com plântulas micropropagadas em vasos de 3,5 litros de volume, com solo arenoso desinfestado como substrato. A inoculação das bactérias diazotróficas não apresentou efeito estimulatório, ao passo que inoculações dos FMA isoladamente e em conjunto com bactéria incrementaram todos os parâmetros de crescimento e nutricionais. A inoculação dos FMA, com a Bactéria E, aumentou a parte aérea e as raízes em até 50% e 105%, respectivamente, em relação à inoculação exclusiva com FMA. Efeitos sinergísticos também foram observados no acúmulo de N da parte aérea e das raízes com aumento de até 88% e 173% e no de fósforo em até 83% e 158%, respectivamente. A co-inoculação da Bactéria E com Glomus clarum também aumentou a colonização micorrízica em 40% e a esporulação em 168%, comparada à inoculação do fungo isolado. Estes efeitos benéficos podem ocorrer tanto pela maior absorção de nutrientes pela planta, como pelo estímulo na colonização dos fungos MA.

Resistência de genótipos de sorgo sacarino à mancha de ramulispora foliar causada pelo fungo Ramulispora sorghi, no Estado de Mato Grosso (Cáceres).

2016

Ocorrência de fungos filamentosos termo-resistentes em polpa de tomate envasada assepticamente

This work aimed at determining the occurrence of heat resistant molds during the aseptic processing of tomato pulp (8° BRIX). During tomato harvest, 9 lots were sampled (3 at the beginning, 3 at the apex and 3 at the end of harvest) and other 5 lots were sampled between harvest. For each lot, the enumeration of heat resistant molds was carried out in samples collected during the aseptic process. The mean count of heat resistant molds was relatively low, ranging from <1 to 8CFU/100mL of sample. The higher counts were observed in the raw material and the pre-wash and transportation water. Fifty strains of heat resistant molds detected in the enumeration procedure were isolated, codified and stocked. One-month-old spores of each isolate were submitted to different heat shocks to select the most heat resistant mold. The most heat resistant isolated strain (survived 100° C/25 minutes) was identified as Neosartorya fischeri.

Histopathological events and detection of Metarhizium anisopliae using specific primers in infected immature stages of the fruit fly Anastrepha fraterculus (Wiedemann, 1830) (Diptera: Tephritidae)

The fungus Metarhizium anisopliae is used on a large scale in Brazil as a microbial control agent against the sugar cane spittlebugs, Mahanarva posticata and M. fimbriolata (Hemiptera., Cercopidae). We applied strain E9 of M. anisopliae in a bioassay on soil, with field doses of conidia to determine if it can cause infection, disease and mortality in immature stages of Anastrepha fraterculus, the South American fruit fly. All the events were studied histologically and at the molecular level during the disease cycle, using a novel histological technique, light green staining, associated with light microscopy, and by PCR, using a specific DNA primer developed for M. anisopliae capable to identify Brazilian strains like E9. The entire infection cycle, which starts by conidial adhesion to the cuticle of the host, followed by germination with or without the formation of an appressorium, penetration through the cuticle and colonisation, with development of a dimorphic phase, hyphal bodies in the hemocoel, and death of the host, lasted 96 hours under the bioassay conditions, similar to what occurs under field conditions. During the disease cycle, the propagules of the entomopathogenic fungus were detected by identifying DNA with the specific primer ITSMet: 5' TCTGAATTTTTTATAAGTAT 3' with ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') as a reverse primer. This simple methodology permits in situ studies of the infective process, contributing to our understanding of the host-pathogen relationship and allowing monitoring of the efficacy and survival of this entomopathogenic fungus in large-scale applications in the field. It also facilitates monitoring the environmental impact of M. anisopliae on non-target insects.

Influência da luminosidade e da camada de cera epicuticular de superfícies de folhas de soja na infecção de Phakopsora pachyrhizi

A ferrugem asiática, causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi, apresenta-se como um dos mais graves problemas fitossanitários da cultura da soja no Brasil, principalmente por não existirem, até o presente momento, cultivares com níveis de resistência satisfatórios. Objetivou-se estudar a influência da luminosidade e da camada de cera das superfícies foliares na infecção de folhas de soja por P. pachyrhizi. A superfície adaxial ou abaxial de folíolos do primeiro trifólio de plantas da cultivar BRS 154, estádio fenológico V2, foi inoculada com suspensão de 10(5) urediniósporos/mL-1. As plantas foram mantidas por 24 horas em câmara úmida e temperatura de 23ºC, sob luz ou escuro, em delineamento fatorial. Posteriormente, permaneceram 14 dias em fotoperíodo de 12 horas, sendo em seguida avaliada a densidade de lesões e a severidade da doença. Em um segundo experimento, avaliou-se in vitro , no escuro e na luz, a porcentagem de germinação de urediniósporos e de formação de apressórios. As camadas de cera adaxial e abaxial dos folíolos foram analisadas quantitativamente (extrações com clorofórmio) e estruturalmente (microscopia eletrônica de varredura). A densidade de lesões e a severidade foram maiores quando se inoculou a superfície adaxial de plantas incubadas no escuro, sem interação significativa entre os fatores. A germinação dos esporos no escuro (40,7%) foi significativamente superior à germinação na luz (28,5%). O mesmo ocorreu para a formação de apressórios, no escuro (24,7%) e na luz (12,8%). A quantidade e a estrutura das ceras epicuticulares não apresentaram diferenças entre as duas superfícies.

Larva of Atractocerus Brasiliensis (Lepeletier & Audinet-Serville, 1825) (Lymexylidae, Atractocerinae)

The larva of Atractocerus brasiliensis (Lepeletier & Audinet-Serville, 1825), collected for the first time in Pinus oocarpa Schiede ex Schltdl. (Pinaceae) is described and illustrated. Until now, for Lymexylidae, only the larva of Melittomma sp. (Melittomminae) was known from the neotropical region (Brazil). Biological notes, a comparison with the description of A. brevicornis, the type-species of the genus (recorded from Africa and Madagascar), and history of the known lymexylid larvae are also included.

A new species of the fungus-farming ant genus Mycetagroicus Brandão & Mayhé-Nunes (Hymenoptera, Formicidae, Attini)

The fungus-farming ant genus Mycetagroicus Brandão & Mayhé-Nunes was proposed based on three species from the Brazilian "Cerrado": M. cerradensis, M. triangularis and M. urbanus. Here we describe a new species of Attini ant of the genus Mycetagroicus, M. inflatus n. sp., based on two workers collected in eastern Pará State, Brazil. A new key for species identification, comments on differences among species and new geographical distribution data are furnished.

Resistência natural da madeira de sete espécies de eucalipto ao apodrecimento

A resistência natural ao apodrecimento se constitui numa importante propriedade da madeira. Em se tratando das madeiras provenientes do gênero Eucalyptus, tal atributo se torna ainda mais importante, uma vez que tais madeiras são, na grande maioria das vezes, de difícil tratabilidade pelos métodos de tratamento convencionais. O objetivo do presente trabalho foi determinar a resistência natural da madeira de sete espécies de eucalipto em ensaio acelerado de laboratório ao fungo causador da podridão-parda Gloeophyllum trabeum. Foram ensaiadas madeiras das espécies de Corymbia citriodora, Eucalyptus tereticornis, E. paniculata, E. pilularis, E. cloeziana, E. urophylla e E. grandis com 16 anos de idade, que cresceram na Estação Experimental de Anhembi, em São Paulo, pertencente ao Departamento de Ciências Florestais da ESALQ/USP. No que diz respeito ao apodrecimento causado pelo fungo Gloeophyllum trabeum, a madeira de eucalipto das sete espécies pode ser considerada resistente, uma vez que os valores de perda de massa foram sempre inferiores a 10%.

Influência dos estrativos na resistência ao apodrecimento de seis espécies de madeira

O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da extração da madeira de seis espécies, quatro nativas (candeia, cedro, cerejeira e jacarandá-caviúna) e duas exóticas (E. citriodora e E. gumifera), em diferentes solventes, na resistência ao apodrecimento causado pelo fungo da podridão-parda Gloeophyllum trabeum. O material foi ensaiado na forma de serragem, em face da maior facilidade para os procedimentos de extração. Dentre os resultados, pode-se destacar a baixa perda de massa ocorrida na madeira de cedro (Cedrela fissilis), evidenciando sua elevada resistência natural ao fungo testado e, ainda, à incapacidade dos solventes utilizados na retirada de compostos que conferem resistência ao apodrecimento. As madeiras de candeia (Vanillosmopsis erythropappa), cerejeira (Amburana cearensis), jacarandá-caviúna (Machaerium scleroxylon) e de eucaliptos (Corymbia citriodora e Eucalyptus gummifera) também apresentaram elevada resistência natural, em função da baixa perda de massa ocorrida, quando expostas ao fungo G. trabeum. Essas madeiras, quando totalmente extraídas, apresentaram elevados valores de perda de massa. No que diz respeito ao material extraído por diferentes solventes de forma isolada, observou-se, na candeia, que o solvente mais eficiente na retirada de substâncias que conferem resistência ao apodrecimento foi o diclorometano. Com relação ao cedro, o mais eficiente foi o metanol. Na cerejeira, por meio da mistura de etanol/tolueno retiraram-se mais substâncias, ao passo que no jacarandá-caviúna foi o metanol. Nas madeiras de eucaliptos, o metanol foi mais eficiente na retirada de componentes tóxicos ao fungo utilizado neste estudo, devendo destacar ainda, no E. gummifera, a eficiência da água quente na retirada de tais compostos. No C. citriodora, os valores de perda de massa, em razão das extrações em água fria, em água quente, em diclorometano e ao natural (não-extraída), foram muito baixos.