Implementação e validação do método de deteção de alergénios em alimentos por PCR em tempo real no Laboratório SGS

As alergias alimentares são um grande problema de saúde pública a nível mundial, que ocorre em todas as faixas etárias, tendo maior incidência em crianças. Mediada pelo sistema imunitário, a alergia alimentar é uma reação adversa que ocorre devido à presença de alergénios alimentares, que são identificados erroneamente como sendo um perigo ao organismo. Como é uma patologia que não possui cura, a prevenção é a melhor forma de evitar que ocorram reações alérgicas em indivíduos sensíveis, sendo a rotulagem um componente indispensável para a identificação dos alergénios presentes nos alimentos. Dentro dos métodos utilizados para a deteção de alergénios está a Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real (PCR em tempo real), que é capaz de identificar o gene que codifica a proteína alergénica. Este método possui elevada sensibilidade e especificidade, sendo atualmente utilizado na área alimentar para a deteção de organismos genéticamente modificados e alergénios. Devido a uma grande procura de clientes e consumidores, para identificação de alergénios em alimentos, o objetivo do presente trabalho foi implementar e validar, a partir de análises de sensibilidade, precisão e robustez, o método de PCR em tempo real. Dessa forma, foi testada a deteção qualitativa de oito alergénios em alimentos, sendo estes o aipo, amendoim, avelã, caju, noz, pistáchio, sésamo e soja, no Laboratório da SGS - Société Générale de Surveillance. Destes alergénios, foi possível a validação de sete, demonstrando que o método de PCR em tempo real, para os presentes alergénios, possui elevada precisão e sensibilidade nos resultados obtidos.

RAPD em Pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke): adaptação do método para coleta de amostras in situ, ajuste das condições de PCR e apresentação de um processo para selecionar bandas reprodutíveis

O Pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke) é uma espécie importante economicamente para a Região Amazônica, porque sua madeira é fonte de linalol, insumo utilizado pelas perfumarias. Esta espécie foi explorada durante décadas e, ainda assim, o conhecimento acerca da diversidade genética intra-específica é muito restrito. Foram objetivos deste trabalho: 1) validar um protocolo para coleta de folhas de pau-rosa que permitisse preservar a integridade do DNA até a estocagem em "freezer"; 2) selecionar um protocolo para extração de DNA em quantidade e qualidade adequadas para geração de bandas RAPD e 3) desenvolver um critério para avaliar o grau de reprodutibilidade que pudesse auxiliar a seleção de bandas RAPD úteis para análises de diversidade genética. Imediatamente após a coleta, as folhas foram acondicionadas em tubos de polietileno com sílica gel e aí permaneceram por até 10 dias. Foram testados três protocolos para a extração de ácidos nucléicos destas folhas, condições ideais para as PCR e a reprodutibilidade dos padrões RAPD. Critérios para a eliminação das bandas que mais contribuíram para o afastamento dos resultados do ideal da reprodutibilidade total foram desenvolvidos e a significância estatística das diferenças geradas pela aplicação dos critérios ao conjunto de dados foi testada. DNA com qualidade e em quantidade suficiente para a geração de padrões RAPD, nas condições ideais definidas para as PCRs, foi obtido. A eliminação de bandas com reprodutibilidade menor que 70% não diferiu do controle. A eliminação de bandas com reprodutibilidade menor que 90% diferiu dos demais tratamentos em todos os arranjos testados (P < 5%).

Níveis séricos de interleucina-6 (IL-6), interleucina-18 (IL-18) e proteína C reativa (PCR) na síndrome coronariana aguda sem supradesnivelamento do ST em pacientes com diabete tipo 2

FUNDAMENTO: A aterosclerose é uma doença inflamatória e níveis séricos de marcadores inflamatórios, como a interleucina 6 (IL-6), interleucina-18 (IL-18) e proteína C reativa (PCR), são utilizados para avaliação de pacientes em quadros de coronariopatia. No paciente com diabete do tipo 2, a aterosclerose está relacionada a um maior número de eventos como infarto e morte, quando comparado aos pacientes sem diabete. OBJETIVO: Avaliar a resposta inflamatória nos pacientes com diabete e eventos agudos de instabilidade coronariana. MÉTODOS: Selecionamos primariamente dois grupos de pacientes. O primeiro grupo foi composto por pacientes ambulatoriais diabéticos com angina estável (D-SCC) e presença de coronariopatia ao estudo coronariográfico (n = 36). O segundo grupo foi composto por pacientes diabéticos atendidos no pronto-socorro com quadro de síndrome coronariana aguda (D-SCA) sem supradesnivelamento do ST (n = 38). Como controle, foram utilizados pacientes sem diabete com SCA (n = 22) e SCC (n = 16). As concentrações séricas de PCR, IL-6 e IL-18 foram determinadas pelas técnicas de nefelometria (PCR) e ELISA (IL-6 e IL-18). RESULTADOS: Níveis mais elevados de IL-6 foram observados em pacientes com ou sem diabete e SCA em relação ao grupo com SCC. Por sua vez, pacientes com diabete e SCA apresentaram concentrações maiores de PCR em comparação aos outros grupos. Os níveis séricos de IL-18 não diferiram significativamente entre os pacientes estudados. CONCLUSÃO: Os resultados obtidos sugerem uma maior atividade inflamatória no paciente com quadro de instabilidade coronariana. Essa atividade inflamatória, medida pela PCR, parece ser ainda mais intensa no paciente com diabete.

Níveis de PCR são maiores em pacientes com síndrome coronariana aguda e supradesnivelamento do segmento ST do que em pacientes sem supradesnivelamento do segmento ST

FUNDAMENTO: Há grande interesse no uso de proteína C-reativa de alta sensibilidade (PCR-as) para avaliação de risco. Altos níveis de PCR-as no início da síndrome coronária aguda (SCA), antes da necrose tecidual, pode ser um marcador substituto para comorbidades cardiovasculares. OBJETIVO: Dessa forma, nosso objetivo foi estudar diferentes medidas de seguimento de níveis de PCR-as em pacientes com SCA e comparar as diferenças entre infarto do miocárdio sem elevação do segmento ST (NSTEMI) com pacientes apresentando elevação do segmento ST (STEMI). MÉTODOS: Este é um estudo observacional. Dos 89 pacientes recrutados, 60 apresentavam infarto agudo do miocárdio (IAM). Três níveis seriados de PCR-us, a nível basal na hospitalização antes de 12 horas após inicio dos sintomas, níveis de pico 36-48 horas após hospitalização e níveis de acompanhamento após 4 a 6 semanas foram analisados e comparados entre pacientes com (IAMCSST) e sem supradesnivelamento do segmento ST (IAMSSST). RESULTADOS: Pacientes com IAMCSST tinham IMC significantemente mais alta quando comparados com pacientes IAMSSST. Os níveis de creatino quinase fração MB (CK-MB) e aspartato aminotransferase (AST) eram significantemente mais altos em pacientes com IAMCSST quando comparados com pacientes com IAMSSST (p<0,05). Os níveis de PCR a nível basal e no acompanhamento não diferiram de forma significante entre os dois grupos (p=0,2152 e p=0,4686 respectivamente). Houve uma diferença significante nos níveis de pico de PCR entre os dois grupos. No grupo de pacientes com IAMCSST os níveis foram significantemente mais altos quando comparados aos pacientes com IAMSSST (p=0,0464). CONCLUSÃO: Pacientes com IAMCSST apresentam picos significantemente mais elevados de PCR quando comparados a pacientes IAMSSST. Esses dados sugerem que o processo inflamatório tem um papel independente na patogênese do infarto do miocárdio. Dessa forma, os níveis de PCR podem ajudar na estratificação de risco após o infarto do miocárdio.

Cistatina C, PCR, Log TG/HDLc e Sindrome Metabolica estao Relacionados a Microalbuminuria na Hipertensao

Fundamento: Em pacientes com hipertensão arterial sistêmica, a microalbuminúria é um marcador de lesão endotelial e está associada a um risco aumentado de doença cardiovascular. Objetivo: O objetivo do presente estudo foi determinar os fatores que influenciam a ocorrência de microalbumiúria em pacientes hipertensos com creatinina sérica menor que 1,5 mg/dL. Métodos: Foram incluídos no estudo 133 pacientes brasileiros atendidos em um ambulatório multidisciplinar para hipertensos. Pacientes com creatinina sérica maior do que 1,5 mg/dL e aqueles com diabete mellitus foram excluídos do estudo. A pressão arterial sistólica e diastólica foi aferida. O índice de massa corporal (IMC) e a taxa de filtração glomerular estimada pela fórmula CKD-EPI foram calculados. Em um estudo transversal, creatinina, cistatina C, colesterol total, HDL colesterol, LDL colesterol, triglicerídeos, proteína C-reativa (PCR) e glicose foram mensurados em amostra de sangue. A microalbuminúria foi determinada na urina colhida em 24 horas. Os hipertensos foram classificados pela presença de um ou mais critérios para síndrome metabólica. Resultados: Em análise de regressão múltipla, os níveis séricos de cistatina C, PCR, o índice aterogênico log TG/HDLc e a presença de três ou mais critérios para síndrome metabólica foram positivamente correlacionados com a microalbuminuria (r2: 0,277; p < 0,05). Conclusão: Cistatina C, PCR, log TG/HDLc e presença de três ou mais critérios para síndrome metabólica, independentemente da creatinina sérica, foram associados com a microalbuminúria, um marcador precoce de lesão renal e de risco cardiovascular em pacientes com hipertensão arterial essencial.

Real-time PCR for type-specific identification of herpes simplex in clinical samples: evaluation of type-specific results in the context of CNS diseases.

BACKGROUND: HSV-1 and HSV-2 cause CNS infections of dissimilar clinico-pathological characteristics with prognostic and therapeutic implications. OBJECTIVES: To validate a type-specific real-time PCR that uses MGB/LNA Taqman probes and to review the virologico-clinical data of 25 eligible patients with non-neonatal CNS infections. RESULTS: This real-time PCR was evaluated against conventional PCR (26 CSF and 20 quality controls), and LightCycler assay (51 mucocutaneous, 8 CSF and 32 quality controls) and culture/immunofluorescence (75 mucocutaneous) to assess typing with independent methods. Taqman real-time PCR detected 240 HSV genomes per ml CSF, a level appropriate for the management of patients, and provided unambiguous typing for the 104 positive (62 HSV-1 and 42 HSV-2) out the 160 independent clinical samples tested. HSV type diagnosed by Taqman real-time PCR predicted final diagnosis (meningitis versus encephalitis/meningoencephalitis, p<0.001) in 24/25 patients at time of presentation, in contrast to clinical evaluation. CONCLUSIONS: Our real-time PCR, as a sensitive and specific means for type-specific HSV diagnosis, provided rapid prognostic information for patient management.

Use of Treponema pallidum PCR in Testing of Ulcers for Diagnosis of Primary Syphilis(1.).

Treponema pallidum PCR (Tp-PCR) has been noted as a valid method for diagnosing syphilis. We compared Tp-PCR to a combination of darkfield microscopy (DFM), the reference method, and serologic testing in a cohort of 273 patients from France and Switzerland and found the diagnostic accuracy of Tp-PCR was higher than that for DFM.

Use of PCR for the determination of the frequency of the deltaF508 mutation in Brasilian cistic fibrosis patients

The [Delta]F508 mutation in the cystic fibrosis (CF) gene was studied in a population of 18 Brazilian CF patients and their 17 families by use of PCR and differential hybridization with oligonucleotides. In a total of 34 chromosomes considered, 12 (35%) carried the F508 deletion, a frequency much lower than that reported in most other populations. As a consequence, CF in Brazil would be predominantly caused by mutations different from the F508 deletion

Use of molecular probes and PCR for detection and typing of Leishmania - a mini-review

The use of molecular tools to detect and type Leishmania species in humans, reservoirs or sandflies has been pursued using different approaches. The polymerase chain reaction provided sensitivity to case this task, since the use of hybridization procedures alone employing specifics probes is hampered due to the low detection limit. In this report, we describe the different molecular targets used in our laboratory, aiming at the detection and specific typing of these protozoa. Different kits based on hybridization assays and PCR amplification using kinetoplast and nuclear targets are described and the results obtained from their use are reported.