994 resultados para signalisation cellulaire
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Langiogense est la formation de nouveaux vaisseaux sanguins partir dun rseau vasculaire existant. Cest un phnomne essentiel pour des processus physiologiques et pathologiques. Lactivation des cellules endothliales est contrle par plusieurs facteurs de croissance. Le VEGF et son rcepteur le VEGFR-2 ont t prouvs comme tant spcifiques et critiques pour la formation des vaisseaux sanguins alors que Tie2, le rcepteur auquel se lie lAng-1, est requis aussi bien dans le dveloppement vasculaire que dans langiogense tumorale. Il est connu que lactivation de Tie2 est ncessaire la stabilisation finale de la vascularisation en inhibant la permabilit vasculaire induite par le VEGFR-2. Nous avons premirement dcouvert que le facteur de croissance pro-angiognique, lAng-1 contrecarre les effets de permabilit cellulaire induits par le VEGF en inhibant la production de NO dans les cellules endothliales. Cet effet inhibiteur de Tie2 intervient directement au niveau de lactivit de lenzyme eNOS. Suite lactivation de Tie2 par lAng-1, eNOS devient fortement phosphoryl sur la Thr497 aprs la phosphorylation et lactivation de la PKC. Nos rsultats suggrent que linhibition, par Tie2, de la permabilit vasculaire durant langiogense serait due, en partie, linhibition de la production de NO. Deuximement nous avons pu distinguer entre deux modes de migration cellulaire endothliale induits par lAng-1 et le VEGF. loppos du VEGF qui promeut une migration individuelle alatoire, lAng-1 induit une migration collective directionnelle. Dans cette tude, nous avons identifi la -catnine comme un nouveau partenaire molculaire de la PKC. Cette association de la PKC la -catnine amne le complexe de polarit Par6-aPKC et le complexe des jonctions dadhrences cellulaires interagir ensemble deux localisations diffrentes au niveau de la cellule endothliale. Au niveau des contacts intercellulaires, le complexe PKC/-catnine maintien la cohsion et ladhsion cellulaire ncessaire pour le processus migratoire collectif. Ce complexe se retrouve aussi au niveau du front migratoire des cellules endothliales afin dassurer la directionalit et la persistance de la migration endothliale en rponse lAng-1. Dune manire intressante, lors de linhibition de la PKC ou de la -catnine on assiste un changement du mode de migration en rponse lAng-1 qui passe dune migration directionnelle collective une migration individuelle alatoire. Ce dernier mode de migration est similaire celui observ chez des cellules endothliales exposes au VEGF. Ces rsultats ont t corrobors in vivo par une polarit et une adhsion dfectueuses au cours de la vasculogense chez le poisson zbre dficient en PKC. En rsum, Ang-1/Tie2 module la signalisation et les rponses biologiques endothliales dclenches par le VEGF/VEGFR-2. Lidentification des mcanismes molculaires en aval de ces deux rcepteurs, Tie2 et VEGFR-2, et la comprhension des diffrentes voies de signalisation actives par ces complexes molculaires nous permettra de mettre la lumire sur des nouvelles cibles thrapeutiques pour le traitement des maladies angiogniques.
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La fibrillation auriculaire (FA) est le trouble du rythme le plus frquemment observ en pratique clinique. Elle constitue un risque important de morbi-mortalit. Le traitement de la FA reste un dfi majeur en lien avec les nombreux effets secondaires associs aux approches thrapeutiques actuelles. Dans ce contexte, une meilleure comprhension des mcanismes sous-jacents la FA est essentielle pour le dveloppement de nouvelles thrapies offrant un meilleur rapport bnfice/risque pour les patients. La FA est caractrise par i) un remodelage lectrique dltre associ le plus souvent ii) un remodelage structurel du myocarde favorisant la rcurrence et le maintien de larythmie. La diminution de la priode rfractaire effective au sein du tissu auriculaire est un lment clef du remodelage lectrique. Le remodelage structurel, quant lui, se manifeste principalement par une fibrose tissulaire qui altre la propagation de linflux lectrique dans les oreillettes. Les mcanismes molculaires impliqus dans la mise en place de ces deux substrats restent mal connus. Rcemment, le rle des microARNs (miARNs) a t point du doigt dans de nombreuses pathologies notamment cardiaques. Dans ce contexte les objectifs principaux de ce travail ont t i) d'acqurir une comprhension approfondie du rle des miARNs dans la rgulation de lexpression des canaux ioniques et ii) de mieux comprendre le rle de ces molcules dans linstallation dun substrat favorable a la FA. Nous avons, dans un premier temps, effectu une analyse bio-informatique combine des approches exprimentales spcifiques afin didentifier clairement les miARNs dmontrant un fort potentiel de rgulation des gnes codant pour lexpression des canaux ioniques cardiaques humains. Nous avons identifi un nombre limit de miARNs cardiaques qui possdaient ces proprits. Sur la base de ces rsultats, nous avons dmontr que laltration de l'expression des canaux ioniques, observe dans diverse maladies cardiaques (par exemple, les cardiomyopathies, lischmie myocardique, et la fibrillation auriculaire), peut tre soumise ces miARNs suggrant leur implication dans larythmognse. La rgulation du courant potassique IK1 est un facteur dterminant du remodelage lectrique auriculaire associe la FA. Les mcanismes molculaires sous-jacents sont peu connus. Nous avons mis lhypothse que l'altration de lexpression des miARNs soit corrle laugmentation de lexpression dIK1 dans la FA. Nous avons constat que lexpression de miR-26 est rduite dans la FA et quelle rgule IK1 en modulant lexpression de sa sous-unit Kir2.1. Nous avons dmontr que miR-26 est sous la rpression transcriptionnelle du facteur nuclaire des lymphocytes T activs (NFAT) et que lactivit accrue de NFATc3/c4, aboutit une expression rduite de miR-26. En consquence IK1 augmente lors de la FA. Nous avons enfin dmontr que linterfrence in vivo de miR-26 influence la susceptibilit la FA en rgulant IK1, confirmant le rle prpondrant de miR-26 dans le remodelage auriculaire lectrique. La fibrose auriculaire est un constituant majeur du remodelage structurel associ la FA, impliquant l'activation des fibroblastes et linflux cellulaire du Ca2 +. Nous avons cherch dterminer i) si le canal permable au Ca2+, TRPC3, jouait un rle dans la fibrose auriculaire en favorisant l'activation des fibroblastes et ii) tudi le rle potentiel des miARNs dans ce contexte. Nous avons dmontr que les canaux TRPC3 favorisent linflux du Ca2 +, activant la signalisation Ca2 +-dpendante ERK et en consquence activent la prolifration des fibroblastes. Nous avons galement dmontr que lexpression du TRPC3 est augmente dans la FA et que le blocage in vivo de TRPC3 empche le dveloppement de substrats relis la FA. Nous avons par ailleurs valid que miR-26 rgule les canaux TRPC3 en diminuant leur expression dans les fibroblastes. Enfin, nous avons montr que l'expression rduite du miR-26 est galement due lactivit augmente de NFATc3/c4 dans les fibroblastes, expliquant ainsi laugmentation de TRPC3 lors de la FA, confirmant la contribution de miR-26 dans le processus de remodelage structurel li la FA. En conclusion, nos rsultats mettent en vidence l'importance des miARNs dans la rgulation des canaux ioniques cardiaques. Notamment, miR-26 joue un rle important dans le remodelage lectrique et structurel associ la FA et ce, en rgulant IK1 et lexpression du canal TRPC3. Notre tude dmasque ainsi un mcanisme molculaire de contrle de la FA innovateur associant des miARNs. miR-26 en particulier reprsente apres ces travaux une nouvelle cible thrapeutique prometteuse pour traiter la FA.
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Ladaptation des cellules leur environnement externe repose sur la transduction adquate de signaux rguls par une plthore d'vnements molculaires. Parmi ces vnements molculaires, les modifications post-traductionnelles (MPT) de protines aident intgrer, traduire et organiser de faon spatiotemporelle ces signaux pour que les cellules puissent ragir aux stimuli externes. Parmi les modifications post-traductionnelles, les petites protines de la famille de lUbiquitine (Ublps, Ubiquitin-like proteins) jouent un rle majeur dans presque toutes les voies de signalisation. Cette thse rapporte des tudes fonctionnelles et structurales des interactions covalentes et non covalentes entre SUMO (Small Ubiquitin related MOdifier), un membre de la famille des Ublps, et trois protines d'chafaudage, TIF1beta, le corpresseur universel des protines KRAB-multidoigt de zinc, PIAS1, une ligase E3 pour SUMO et PML, un suppresseur de tumeur. La premire tude rapporte l'identification et la caractrisation biochimique des sites de SUMOylation de TIF1beta. Nous avons dtermin que la modification covalente de six rsidus lysine par SUMO est essentielle lactivit de rpression de la transcription induit par TIF1beta. En outre, nous prsentons des vidences indiquant que la SUMOylation de TIF1 exige non seulement sa capacit homo-oligomriser, mais est aussi positivement rgule par son interaction avec le domaine KRAB des protines doigts de zinc. Partant de ce constat, nous postulons que les protines KRAB-multidoigt de zinc recrutent leur corpresseur TIF1beta des gnes cibles, mais aussi accentuent son activit rpressive grce l'augmentation de sa SUMOylation. Notre seconde tude rvle quen plus de rprimer la transcription en tant que MPT covalente, SUMO joue aussi un rle important dans la rpression en tant que partenaire non covalent dinteractions protine-protine. Nous avons montr que SUMO interagit simultanment avec deux enzymes de la machinerie de SUMOylation, lunique enzyme de conjugaison E2, UBC9, et la ligase E3 PIAS1 au sein dun complexe ternaire rpresseur. En outre, nous rvlons que la formation du complexe ternaire PIAS1:SUMO:UBC9 est module par le niveau de phosphorylation de rsidus srine juxtaposs un motif dinteraction avec SUMO (SIM) dans PIAS1. Ainsi, SUMO agit comme un adaptateur spcifique qui stabilise les interactions UBC9 E2: E3 PIAS1. Partant de ce constat, nous proposons que les enzymes E2 et E3 des autres systmes Ublps exploitent des mcanismes similaires dans le cadre de leur fonction Enfin, notre troisime tude explore la rgulation des interactions non covalentes de SUMO par la phosphorylation. En utilisant une combinaison d'tudes in vivo et in vitro, nous dmontrons que l'interaction entre SUMO1 et PML est rgi par la phosphorylation dpendant de CK2 sur quatre rsidus srine de PML. Les structures cristallographiques des complexes PML-SIM:SUMO1 rvlent que les phospho-srines de PML contactent des rsidus de la rgion basique de SUMO1. Sachant que la kinase CK2 peut tre induite par des kinases activables par le stress, ces rsultats suggrent que les interactions non-covalentes avec SUMO sont modules par le stress cellulaire. Sur la base de cette constatation, nous postulons que des vnements analogues affectent des protines contenant des squences SIM cibles par CK2. En rsum, cette tude rvle quen plus de son rle de MPT, SUMO peut fonctionner comme un adaptateur permettant des interactions spcifiques entre protines tel que pour les enzymes E3 et E2.
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Dans un contexte o la forte prvalence du cancer du sein chez les femmes demeure depuis plusieurs annes un enjeu de socit majeur, les nouvelles stratgies visant rduire la mortalit associe cette maladie sont le sujet de nombreuses recherches scientifiques. Les facteurs dADP-ribosylation sont des petites protines G monomriques importantes pour la rorganisation du cytosquelette dactine, le remodelage des lipides membranaires et la formation de vsicules. Notre laboratoire a prcdemment montr quARF1 est surexprime dans les cellules hautement invasives du cancer du sein et contribue leur phnotype migratoire accru. Dans le cadre de ce mmoire, nous avons dfini le rle de cette GTPase dans la migration de telles lignes cellulaires. Pour ce faire, nous avons tudi le rle dARF1 dans lactivation de Rac1, un membre de la famille des GTPases Rho connu pour son implication dans la formation de lamellipodes ainsi que dans la migration cellulaire. Globalement, nous avons dtermin que lactivation dARF1 permet lactivation subsquente de Rac1 ainsi que de la voie de signalisation ncessaire au processus de migration. Par une approche dinterfrence lARN dans les cellules MDA-MB-231, nous avons dabord montr la contribution essentielle de Rac1 la migration dpendante dARF1. Puis, de faon tablir le mcanisme derrire cette rgulation, nous avons montr que linhibition de lexpression endogne dARF1 altre lactivation de Rac1 dpendante de lEGF. Nous avons ensuite examin les consquences dune telle inhibition sur les partenaires dinteraction de Rac1. Nous avons dcouvert quARF1 et Rac1 forment un complexe constitutif, puis quARF1est ncessaire lassociation de Rac1 IRSp53, une protine importante dans la formation de lamellipodes. La translocation dpendante de lEGF du complexe Rac1/IRSp53 la membrane plasmique est galement sous le contrle dARF1. En conclusion, cette tude fournit un nouveau mcanisme par lequel ARF1 rgule la migration cellulaire et identifie cette GTPase en tant que cible pharmacologique prometteuse pour freiner le dveloppement des mtastases chez les patients atteints du cancer du sein.
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Lhypertension artrielle est le facteur de risque le plus important dans les maladies cardiovasculaires (MCV) et les accidents vasculaires crbraux (AVC). Lhypertension artrielle essentielle est une maladie complexe, multifactorielle et polygnique. Mme si on a identifi de nombreux facteurs de risque de lhypertension artrielle, on ne comprend pas encore clairement les mcanismes qui la rgissent. Les kinases hpatocytes produisant lrythropotine (Eph) constituent la plus grande famille des rcepteurs tyrosine kinase qui se lient des ligands de surface cellulaire appels phrines sur les cellules avoisinantes. On sait que les interactions de Eph et des phrines sont essentielles aussi bien dans les processus de dveloppement que dans le fonctionnement des organes et des tissus adultes. Cependant on na pas encore tudi la relation entre Eph/phrines et lhypertension artrielle. Nous avons cr des modles de souris knockout (K.O.) Ephb6-/-, Efnb1-/- et Efnb3-/- pour cette tude. Dans le modle EphB6-/-, nous avons observ que les souris K.O. Ephb6 castres, mais pas les femelles, ainsi que les souris mles non castres prsentaient une tension artrielle leve (TA) par rapport leurs homologues de type sauvage (TS). Ceci suggre que Ephb6 doit agir de concert avec lhormone sexuelle mle pour rguler la TA. Les petites artres des mles castrs Ephb6-/- prsentaient une augmentation de la contractilit, une activation de RhoA et une phosphorylation constitutive de la chane lgre de la myosine (CLM) lorsque compares celles de leurs homologues TS. Ces deux derniers rsultats indiquent que la phosphorylation de CLM et de RhoA passe par la voie de signalisation de Ephb6 dans les cellules du muscle lisse de la paroi vasculaire (CMLV). Nous avons dmontr que la rticulation de Efnbs mais non celle de Ephb6 aboutit une rduction de la contractilit des CMLV. Ceci montre que leffet de Ephb6 passe par la signalisation inverse travers Efnb. Dans le modle Efnb1-/- conditionnel spcifique au muscle lisse, nous navons observ aucune diffrence entre Efnb1-/- et les souris de TS concernant la mesure de la TA dans des conditions normales. Cependant, la TA des souris K.O. Efnb1 lors dun stress dimmobilisation est suprieure celle des souris de TS. Dans les petites artres des souris K.O. Efnb1, le rtrcissement et la phosphorylation de CLM taient levs. In vitro, la contractilit et lactivation RhoA de la CMLV des souris TS taient augmentes quand leur Efnb1 tait rticul. Ces rsultats corroborent ceux des souris KO Ephb6 et prouvent que leffet de Ephb6 dans le contrle de la TA se produit au moins par lintermdiaire dun de ses ligands Efnb1 dans les CMLV. Dans le modle Efnb3-/-, on a observ une augmentation de la TA et du rtrcissement des vaisseaux chez les femelles Efnb3-/-, mais non chez les mles; lchographie a aussi rvl une rsistance accrue au dbit sanguin des souris K.O. femelles. Cependant la mutation de Efnb3 ne modifie pas la phosphorylation de la CLM ou lactivation de RhoA in vivo. Dans lexprience in vitro, les CMLV des souris femelles Efnb3-/- ont prsent une augmentation de la contractilit mais pas celle des souris mles Efnb3-/-. La rticulation des CMLV chez les mles ou les femelles de TS avec solide anti-Efnb3 Ab peut rduire leur contractilit. Notre tude est la premire valuer le rle de Eph/phrines dans la rgulation de la TA. Elle montre que les signalisations Eph/phrines sont impliques dans le contrle de la TA. La signalisation inverse est principalement responsable du phnotype lev de la TA. Bien que les Efnb1, Efnb3 appartiennent la mme famille, leur fonction et leur efficacit dans la rgulation de la TA pourraient tre diffrentes. La dcouverte de Eph/Efnb nous permet dexplorer plus avant les mcanismes qui gouvernent la TA.
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Introduction : La prvention de la mort de cellules cardiaques contractiles suite un pisode d'infarctus du myocarde reprsente le plus grand dfi dans la rcupration de la fonction cardiaque. On a dmontr maintes reprises que l'ocytocine (OT), l'hormone bien connue pour ses rles dans le comportement social et reproductif et couramment utilise dans linduction de laccouchement, diminue la taille de l'infarctus et amliore la rcupration fonctionnelle du myocarde bless. Les mcanismes de cette protection ne sont pas totalement compris. Objectif : tudier les effets d'un traitement avec de l'ocytocine sur des cardiomyocytes isols en utilisant un modle in vitro qui simule les conditions d'un infarctus du myocarde. Mthodes : La ligne cellulaire myoblastique H9c2 a t utilise comme modle de cardiomyocyte. Pour simuler le dommage d'ischmie-reperfusion (IR), les cellules ont t places dans un tampon ischmique et incubes dans une chambre anoxique pendant 2 heures. La reperfusion a t accomplie par la restauration du milieu de culture rgulier dans des conditions normales d'oxygne. L'OT a t administre en prsence ou en absence d'inhibiteurs de kinases connues pour tre impliques dans la cardioprotection. La mortalit cellulaire a t value par TUNEL et l'activit mitochondriale par la production de formazan pendant 1 4 heures de reperfusion. La microscopie confocale a servie pour localiser les structures cellulaires. Rsultats : Le modle exprimental de l'IR dans les cellules H9c2 a t caractris par une diminution dans la production de formazan (aux alentours de 50 70 % du groupe tmoin, p < 0.001) et par l'augmentation du nombre de noyaux TUNEL-positif (11.7 4.5% contre 1.3 0.7% pour le contrle). L'addition de l'OT (10-7 a 10-9 M) au commencement de la reperfusion a invers les effets de l'IR jusqu'aux niveaux du contrle (p < 0.001). L'effet protecteur de l'OT a t abrog par : i) un antagoniste de l'OT ; ii) le knockdown de l'expression du rcepteur l'OT induit par le siRNA ; iii) la wortmannin, l'inhibiteur de phosphatidylinositol 3-kinases ; iv) KT5823, l'inhibiteur de la protine kinase dpendante du cGMP (PKG); v) l'ODQ, un inhibiteur du guanylate cyclase (GC) soluble, et A71915, un antagoniste du GC membranaire. L'analyse confocale des cellules traites avec OT a rvl la translocation du rcepteur l'OT et la forme phosphoryle de l'Akt (Thr 308, p-Akt) dans le noyau et dans les mitochondries. Conclusions : L'OT protge directement la viabilit des cardiomyocytes, lorsqu'elle est administre au dbut de la reperfusion, par le dclenchement de la signalisation du PI3K, la phosphorylation de l'Akt et son trafic cellulaire. La cytoprotection mdie par l'OT implique la production de cGMP par les deux formes de GC.
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Les anomalies du tube neural (ATN) sont des malformations congnitales trs frquentes chez lhumain en touchant 1-2 nouveau-ns sur 1000 naissances. Elles rsultent dune fermeture incomplte du tube neural lors de lembryogense. Ltiologie des ATN est complexe impliquant des facteurs environnementaux et des facteurs gntiques. La souris reprsente un outil puissant afin de mieux comprendre la gntique des ATN. Particulirement, la souris modle a impliqu fortement la voie de la polarit cellulaire planaire (PCP) dans ces malformations. Dans cette tude, nous avons identifi et caractris une nouvelle souris mutante, Skam26Jus dans le but didentifier un nouveau gne causant les ATN. Skam26Jus a t gnre par lagent mutagne N-Ethyl-N-Nitrosuera. Cette souris est caractrise par une queue en forme de boucle ou de crochet, soit un phnotype associ aux ATN. La complmentation gntique de la souris Skam26Jus avec une souris mutante dun gne de la voie PCP Vangl2 (Looptail) a montr une interaction gntique entre le gne mut chez Skam26Jus et Vangl2, suggrant que ces deux gnes fonctionnent dans des voies de signalisation semblables ou parallles. Un total de 50% des embryons doubles htrozygotes avec un phnotype de la queue prsentent un spina bifida. La cartographie par homozygotie du gnome entier suivie par un clonage positionnel a permis didentifier Lrp6 comme le gne mut chez Skam26Jus. Une mutation homozygote, p.Ile681Arg, a t identifie dans Lrp6 chez les souris ayant une queue en boucle/crochet. Cette mutation tait absente dans 30 souches gntiques pures indiquant que cette mutation est spcifique au phnotype observ. Une tude de phnotype-gnotype value la pntrance 53 % de la mutation Ile681Arg. Lrp6 est connu pour activer la voie canonique Wnt/-catnine et inhiber la voie non canonique Wnt/PCP. Le squenage de la rgion codante et de la jonction exon-intron de LRP6 chez 268 patients a men lidentification de quatre nouvelles rares mutations faux sens absentes chez 272 contrles et de toutes les bases de donnes publiques. Ces mutations sont p.Tyr306His ; p.Tyr373Cys ; p.Val1386Ile; p.Tyr1541Cys et leur pathognicit prdite in silico indiquent que p.Val1386Ile est bnigne, et que p.Tyr306Hiset p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys sont i possiblement dommageables. Les mutations p.Tyr306His, p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys ont affect lhabilit de LRP6 dactiver la voie Wnt/-catnine en utilisant le systme rapporteur lucifrase de pTOPflash. Nos rsultats suggrent que LRP6 joue un rle dans le dveloppement des ATN chez une petite fraction de patients ayant une ATN. Cette tude prsente aussi Skam26Jus comme un nouveau modle pour tudier les ATN chez lhumain et fournit un outil important pour comprendre les mcanismes molculaires lorigine des A TN.
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Lencphalopathie hypoxique-ischmique cause des milliers de victimes travers le monde chaque anne. Les enfants survivants un pisode hypoxique-ischmique sont risque de dvelopper des problmes neurologiques incapacitants comme une paralysie crbrale, un retard mental, une pilepsie ou des troubles dordre comportemental. Les modles animaux ont amlior nos connaissances sur les mcanismes sous-jacents aux dommages crbraux, mais elles sont encore trop incompltes pour tre capables de prvenir les problmes neurologiques. Ce projet vise comprendre limpact dun pisode asphyxique prinatale associ des convulsions ainsi que lactivation de ladenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) sur les circuits GABAergiques inhibiteurs en dveloppement chez la souris. Dans le but dinvestiguer le sort des neurones inhibiteurs, appels interneurones, suite un pisode asphyxique prinatal associ des convulsions avec des animaux transgniques, nous avons pris avantage dun nouveau modle dhypoxie permettant dinduire des convulsions chez la souris. Deux populations dinterneurones reprsentant ensemble environ 60% de tous les interneurones corticaux ont t tudies, soit les cellules exprimant la parvalbumine (PV) et les cellules exprimant la somatostatine (SOM). Ltude strologique na montr aucune mort neuronale de ces deux populations dinterneurones dans lhippocampe chez les souris hypoxique dge adulte. Par contre, le cortex des souris hypoxiques prsentait des zones compltement ou fortement dpourvues de cellules PV alors que les cellules SOM ntaient pas affectes. Lutilisation dune ligne de souris transgnique exprimant une protine verte fluorescente (GFP) dans les cellules PV nous a permis de comprendre que les trous PV sont le reflet de deux choses : 1) une diminution des cellules PV et 2) une immaturit des cellules PV restantes. Puisque les cellules PV sont spcifiquement affectes dans la premire partie de notre tude, nous avons voulu tudier les mcanismes molculaires sous-jacents cette vulnrabilit. LAMPK est un senseur dnergie qui orchestre le rtablissement des i niveaux dnergie cellulaire dans le cas dune dpltion nergtique en modulant des voies de signalisation impliquant la synthse de protines et lexcitabilit membranaire. Il est possible que lactivation dAMPK suite un pisode asphyxique prinatal associ des convulsions soit nfaste long-terme pour le circuit GABAergique en dveloppement et modifie ltablissement de linnervation prisomatique dune cellule PV sur les cellules pyramidales. Nous avons tudi cette hypothse dans un modle de culture organotypique en surexprimant la forme wild-type (WT) de la sous-unit 2 dAMPK, ainsi quune forme mute dominante ngative (DN), dans des cellules PV individuelles. Nous avons montr que pendant la phase de formation synaptique (jours post-natals quivalents EP 10-18), la surexpression de la forme WT dsorganise la stabilisation des synapses. De plus, labolition de lactivit dAMPK semble augmenter le nombre de synapses prisomatiques faits par la cellule PV sur les cellules pyramidales pendant la phase de formation et semble avoir leffet inverse pendant la phase de maturation (EP 16-24). La neurotransmission GABAergique joue plusieurs rles dans le cerveau, depuis la naissance jusqu lge adulte des interneurones, et une dysfonction des interneurones a t associe plusieurs troubles neurologiques, comme la schizophrnie, lautisme et lpilepsie. La maturation des circuits GABAergiques se fait majoritairement pendant la priode post-natale et est hautement dpendante de lactivit neuronale et de lexprience sensorielle. Nos rsultats rvlent que le lourd fardeau en demande nergtique dun pisode asphyxique prinatal peut causer une mort neuronale slective des cellules PV et compromettre lintgrit de leur maturation. Un des mcanismes sous- jacents possible cette immaturit des cellules PV suite lpisode hypoxique est lactivation dAMPK, en dsorganisant leur profil dinnervation sur les cellules pyramidales. Nous pensons que ces changements dans le rseau GABAergique pourrait contribuer aux problmes neurologiques associs une insulte hypoxique.
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La leucmie aige lymphoblastique de prcurseurs des cellules B (pr-B LAL) est le cancer le plus frquent chez lenfant. La transplantation de cellules souches hmatopotiques (TCSH) est ncessaire dans environ 20 30 % des enfants ayant une pr-B LAL. Les rechutes aprs TCSH sont habituellement rfractaires aux thrapies actuelles, et par consquent, il est important de dvelopper et doptimiser de nouvelles stratgies thrapeutiques. Dans cette tude, nous nous sommes intresss aux cellules cytokine-induced killer (CIK). En effet, ces cellules ont t montres comme hautement cytotoxique contre beaucoup de types de cancers. Cependant, leur activit cytotoxique contre les pr-B LAL nest pas vraiment efficace. Par consquent, nous avons tudi la possibilit de combiner limmunothrapie des cellules CIK avec linterfron alpha (IFN-) afin doptimiser lactivit lytique de ces cellules contre les cellules pr-B LAL. De plus, vu quil a t dmontr que lactivit cytotoxique des cellules CIK provient de la fraction CD56+, plus particulirement les cellules CD3+CD56+, nous avons dcid dutiliser la fraction CD56+ (cellules CD56+) dans lensemble de nos expriences. Nous avons observ in vitro que les cellules CD56+ lysent mieux les lignes cellulaires pr-B LAL comparativement aux cellules CIK non purifies. Aussi, leur activit cytotoxique peut tre augmente par le traitement avec lIFN-. Par ailleurs, nous avons dmontr lefficacit des cellules CD56+ traites par lIFN- contre les lignes cellulaires pr- B LAL in vivo, dans le modle de souris NOD/SCID/gamma c- (NSG). La survie des souris est significativement prolonge lorsquelles reoivent les cellules pr-B LAL avec les cellules CD56+ traites par lIFN-. Nous avons par la suite tudi le mcanisme daction des cellules CD56+ contre les lignes cellulaires pr-B LAL. Nous avons observ que les cellules CD56+ provenant de sang de cordon sont plus efficaces que les cellules CD56+ provenant de sang I priphrique pour tuer les lignes cellulaires pr-B LAL. Nous avons galement montr que les cellules CD56+ utilisent seulement la voie NKG2D ou bien les voies NKG2D et TRAIL selon la ligne cellulaire pr-B LAL cible et selon la provenance de la source des cellules CD56+. Par ailleurs, nous avons remarqu que les cellules CIK sont sensibles lapoptose par Fas, et que cette sensibilit influence leur activit cytotoxique contre les cellules tumorales. En conclusion, les cellules CD56+ sont cytotoxiques contre les lignes cellulaires pr-B LAL, et leur effet lytique est augment par lIFN- aussi bien in vitro quin vivo dans le modle de souris NSG. Ces donnes prcliniques sont encourageantes pour tester cette nouvelle approche dimmunothrapie dans le traitement contre la pr-B LAL.
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La snescence est un mcanisme de dfense antiprolifratif dont la cellule est munie afin de prvenir laccumulation de mutations pouvant mener sa transformation et lventuel dveloppement dune tumeur. Ce programme consiste en un arrt permanent du cycle cellulaire. Il peut tre activ par de nombreux stimuli tels que le raccourcissement des tlomres, le stress oxydatif, ou lexpression dun oncogne constitutivement actif. Sa rgulation requiert lactivation de protines appeles des suppresseurs de tumeur dont les plus importants sont p53 et RB. De manire plus spcifique, les snescences induites par lexpression des oncogne RASV12 ou STAT5A(1*6) sont respectivement caractrises par laugmentation de lexpression des protines PML et CHES1/FOXN3. Le but de cette thse est, dans un premier temps, de mettre en vidence le mcanisme de rgulation de la snescence par PML. PML est un suppresseur de tumeur dont lexpression dans des cellules diplodes normales est suffisante pour induire la snescence. Cette protine forme des corps nuclaires sphriques au sein desquels est recrut, parmi dautres molcules, la protine du rtinoblastome RB. RB est un rgulateur ngatif du cycle cellulaire capable de lier et inhiber les facteurs de transcription E2F dont les gnes cibles sont ncessaires la prolifration. Nos travaux dmontrent que le mcanisme dinduction de la snescence par PML implique le recrutement du complexe RB/E2F aux corps de PML afin de renforcer linhibition de lactivit des E2F par RB. galement, les E2F sont recruts aux corps de PML en compagnie de leurs promoteurs ce qui favorise la formation dhtrochromatine au niveau de ces gnes, aidant leur rpression et donc ltablissement de la snescence. Dautre part, cette thse a pour but de caractriser le rle de CHES1/FOXN3 dans la rgulation du cycle cellulaire. CHES1 est un facteur de transcription de la famille des Forkheads. Son expression dans des cellules cancreuses provoque un ralentissement de leur prolifration. Afin de comprendre son mcanisme de fonctionnement, une analyse sur micropuce dADN de lexpression des gnes de cellules cancreuses exprimant CHES1 a t ralise. Cette analyse a montr que, dans la cellule, CHES1 joue un rle de rpresseur transcriptionnel. Plus prcisment, CHES1 rprime, entre autres, lexpression de gnes ncessaires la synthse des protines tels que PIM2 et DYRK3. De manire intressante, la rexpression de PIM2 dans des cellules cancreuses exprimant CHES1 permet de rtablir partiellement la prolifration cellulaire. galement, lanalyse sur micropuce a rvl que CHES1 rgule lexpression de nombreux gnes impliqus dans la formation des cilia dont lune des fonctions semble tre de moduler la synthse protique. Pris ensemble, ces rsultats suggrent que le mcanisme antitumoral de CHES1 consiste en une inhibition de la synthse de protines.
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Dock1 (aussi nomm Dock180) est le membre prototypique de la famille Dock dactivateurs des petites GTPases de la famille Rho. Dock1 agit au sein dune voie de signalisation conserve au cours de lvolution et des tudes gntiques ont dmontr que les orthologues de Dock1, myoblast city (mbc) chez la drosophile et Ced-5 chez le nmatode, activent Rac dans divers processus biologiques. Notamment, mbc est un important rgulateur de la fusion des myoblastes lors de la formation des fibres musculaires de drosophile. Mbc est aussi essentiel la migration collective dun groupe de cellules, appeles cellules de bordures, lors de leur migration dans la chambre de loeuf suite lactivation de rcepteurs activit tyrosine kinase (RTK). La migration collective des cellules de bordures rcapitule certains des vnements observs lorsque des cellules tumorales envahissent le tissu environnant lors de la formation de mtastases. Chez les mammifres, des tudes ralises en lignes cellulaires suggrent que Dock1 est aussi un rgulateur du cytosquelette lors de la migration cellulaire. De plus, certaines tudes ont dmontr que la voie Dock1/Rac agit en aval de RTKs lors de linvasion de cellules de glioblastome. Nanmoins, les fonctions in vivo de Dock1 chez les mammifres demeurent mconnues et le but de cette thse est didentifier et de caractriser certaines de ses fonctions. Guids par la fonction de mbc, nous dmontrons dans lobjectif no 1 un rle essentiel pour ce gne au cours du dveloppement embryonnaire grce la caractrisation dune souris Dock1 knock-out. Des dfauts svres de fusion des myoblastes sont observs en absence de lexpression de Dock1 et ils contribuent la rduction de la masse musculaire des souris mutantes. De plus, nous avons constat une contribution du gne Dock5, un membre de la famille Dock proche de Dock1, au dveloppement des fibres musculaires. Dans lobjectif no 2, nous avons observ que des hauts niveaux dexpression de DOCK1 corrlent avec un mauvais pronostic chez les patientes atteintes de cancer du sein possdant une forte expression du gne codant pour le RTK HER2. Une surexpression ou une amplification du locus codant pour le rcepteur HER2 est associe prs de 20% des cas de cancer du sein. Les cancers de ces patientes dveloppent frquemment des mtastases et sont associs un mauvais pronostic. Des tudes biochimiques ont rvl que DOCK1 interagit avec le rcepteur HER2 dans des cellules de cancer du sein. De plus, DOCK1 est essentiel lactivation de RAC et la migration cellulaire induite par HER2 dans ces cellules. Lutilisation dun modle de cancer du sein mdi par HER2 chez la souris combin avec linactivation du gne Dock1 dans les glandes mammaires, nous a permis didentifier Dock1 et Rac comme de nouveaux effecteurs de la croissance tumorale et de la formation de mtastases rgules par loncogne HER2. Nous concluons que lutilisation de diffrents modles de souris knock-out pour le gne Dock1 nous a permis didentifier des fonctions cls de ce gne. Tout comme son orthologue mbc, Dock1 joue un rle important lors du dveloppement embryonnaire en rgulant notamment la fusion des myoblastes. Nos tudes ont galement contribu dmontrer un important degr de conservation des mcanismes molculaires de fusion entre les espces. De plus, DOCK1 agit en aval du RTK HER2 et son expression dans les cellules pithliales de glandes mammaires contribue au dveloppement tumoral et la formation de mtastases induits par cet oncogne.
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Les rcepteurs coupls aux protines G (RCPGs) reprsentent la plus grande famille de cibles thrapeutiques pour le traitement dune panoplie de pathologies humaines. Bien que plusieurs dcennies de recherche aient permis de faonner nos connaissances sur ces protines membranaires, notre comprhension des dterminants molculaires de leur activit signaltique reste encore limite. De ces domaines de recherche, une avance rcente a mis jour un nouveau phnomne, appel slectivit fonctionnelle des ligands, qui a boulevers les paradigmes dcrivant leu fonctionnement de ces rcepteurs. Ce concept mane dobservations montrant que lactivit pharmacologique de certains ligands nest pas ncessairement conserve sur tout le rpertoire signaltiques connu du rcepteur et peu se restreindre l'activation slective dun sous-groupe de voies de signalisation.Ce nouveau modle pharmacologique de l'activation des RCPG ouvre de nouvelles possibilits pour la dcouverte de mdicaments plus efficace et sr, ciblant les RCPGs. En effet, il permet la conception de molcules modulant spcifiquement les voies signaltiques dintrt thrapeutique, sans engager les autres voies qui pourraient mener des effets secondaires indsirables ou de la tolrance. Cette thse dcrit l'utilisation d'une nouvelle approche sans marquage, base sur la mesure du changement l'impdance cellulaire. Par la mesure des changements cellulaires, comme la morphologie, ladhsion et/ou la redistribution des macromolcules, cette approche permet de mesurer de faon simultane l'activit de plusieurs voies de signalisation impliqus dans ces rponses. Utilisant le rcepteur 2-adrnergique (2AR) comme modle, nous avons dmontr que les variations dans limpdance cellulaire taient directement lies lactivation de multiples voies de signalisation suite la stimulation du rcepteur par son ligand. Lagoniste type du 2AR, lisoprotrnol, sest avr induire une rponse dimpdance dose-dpendante constitue, dans le temps, de plusieurs caractristiques distinctes pouvant tre bloques de faon comptitive par lantagoniste ICI118,551 Par lutilisation dinhibiteurs slectifs, nous avons t en mesure de dterminer la contribution de plusieurs voies signaltiques canoniques, comme les voies dpendantes de Gs et Gi, la production dAMPc et lactivation de ERK1/2, sur ces changements. De plus, la dissection de la rponse dimpdance a permis didentifier une nouvelle voie de mobilisation du Ca2+ contribuant la rponse globale des changements initis par la stimulation du 2AR. Dans une autre tude, nous avons rapport que la rponse calcique induite par le 2AR serait attribuable une transactivation Gs-dpendant du rcepteur purinergique P2Y11, lui-mme coupl la protine Gq. La mesure dimpdance permettant de distinguer et de dcrire une pliade dactivits signaltiques, nous avons mis lhypothse que des ligands arborant des profils signaltiques diffrents gnreraient des rponses dimpdance distinctes. Le criblage dune librairie de ligands spcifiques au 2AR a rvl une grande varit de signatures dimpdance. Grce au dveloppement dune approche computationnelle innovatrice, nous avons t en mesure de regrouper ces signatures en cinq classes de composs, un regroupement qui sest avr hautement corrl avec le profil signaltique des diffrents ligands. Nous avons ensuite combin le criblage de composs par impdance avec lutilisation dinhibiteurs slectifs de voies signaltiques afin daugmenter la rsolution du regroupement. En valuant limpact dune voie signaltique donne sur la signature dimpdance, nous avons t en mesure de rvler une plus grande varit de textures parmi les ligands. De plus, cette mthode sest avre efficace pour prdire le profil signaltique dune librairie de composs non caractriss, ciblant le 2AR. Ces travaux ont men llaboration dune mthode permettant dexprimer visuellement la slectivit fonctionnelle de ligands et ont rvl de nouvelles classes de composs pour ce rcepteur. Ces nouvelles classes de composs ont ensuite t testes sur des cardiomyocytes humains, confirmant que les composs regroups dans diffrentes classes produisent des effets distincts sur la contractilit de ces cellules. Globalement, ces travaux dmontrent la pertinence de lutilisation de limpdance cellulaire pour une valuation prcise des diffrences fonctionnelles parmi les composs ciblant les RCPGs. En fournissant une reprsentation pluridimensionnelle de la signalisation manant des RCPGs laide dun seul essai ne requrant pas de marquage, les signatures dimpdance reprsentent une stratgie simple et innovante pour lvaluation de la fonctionnalit slective des ligands. Cette mthode pourrait tre dune grande utilit dans le processus de dcouverte de nouveaux mdicaments.
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Le CD40 est une glycoprotine transmembranaire de type I, appartenant la famille des TNFRs, exprime la surface des cellules immunitaires, hmatopotiques, vasculaires, pithliales, et dautres types de cellules, y compris les cellules tumorales. Le CD40 ne possdant pas de domaine kinase, pour induire un signal il interagit directement ou indirectement avec des protines adaptatrices telles que les TRAFs et les JAKs. Linteraction du CD40 avec son principal ligand, le CD154, joue un rle primordial dans la rgulation de la rponse immunitaire et le maintien de lhomostasie. Lactivation du CD40 la surface des cellules B augmente leur capacit de prsentation dantigne, en plus dinduire la prolifration, la commutation isotypique et lapoptose. Les patients souffrant de mutations au niveau du gne codant pour le CD40 ou de son ligand sont immunosupprims et sensibles des infections opportunistes. Des tudes ont montr que le CD40 comme dautres membres de la famille des TNFRs est capable de former des homodimres. Plus rcemment, on a montr que la formation du CD40 homodimre est le rsultat de son engagement sur les cellules B. En plus, cette homodimrisation du CD40 est importante pour la phosphorylation de lAkt. Linteraction CD40/CD154 peut avoir un rle direct dans limmunothrapie par linduction de lapoptose de certaines cellules cancreuses ou un rle indirect en activant les cellules prsentatrices dantignes (CPA) afin d'augmenter lefficacit de lactivation des cellules T cytotoxiques. Nos rsultats montrent que linduction de la mort cellulaire par le CD40 requiert la permabilisation du lysosome, la libration de la cathepsine B, la prsence de ROS et une interaction avec le TRAF6, cette mort cellulaire programme est plus importante en prsence de la forme monomrique du CD40, mut au niveau de la cystine 238. Par ailleurs, lhomodimrisation du CD40 requerrait sa translocation vers les radeaux lipidiques et ncessiterait la prsence des ROS. Cette homodimrisation du CD40 semble tre importante pour lactivation des cellules B par le biais de linduction de lexpression du CD23, CD69 et CD80. De plus, nos rsultats montrent pour la premire fois une implication du CD40 homodimre dans linduction du CD23 par le biais du TLR4. Nos rsultats soulignent limportance du CD40 homodimre dans certaines voies de signalisation. Ainsi, ils mettent en vidence le rle de la Cys-238 dans la coopration entre des rcepteurs de la rponse immunitaire inne et adaptative. Toutes ces donnes permettraient une meilleure comprhension de certaines voies de signalisation impliques dans plusieurs maladies auto-immunes et faisant objet de plusieurs essais thrapeutiques.
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La rponse cellulaire aux ultra-violets (UV), ou rponse UV, est une rponse complexe et spcialise dans ladaptation et la tolrance des dommages aux UV. Celle-ci est initie par un grand nombre dvnements molculaires et de signalisation nuclaire mais aussi au niveau de la membrane plasmique ou du cytoplasme. Limportance et linfluence exactes de ces vnements sur la rparation par excision de nuclotides (NER) des dommages UV lADN sont encore mal comprises et doivent encore tre mthodiquement dmontres. Dans cette thse, grce lutilisation dune mthode sensible danalyse de la rparation NER base sur la cytomtrie en flux, il est montr, dans un premier temps, que lactivit des voies MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases), qui sont des voies de signalisation de stress UV dorigine cytoplsamique, ne participent pas lefficacit de rparation NER des dommages UV dans les cellules humaines. En effet, labrogation de la signalisation MAPK, par inhibition pharmacologique, par utilisation de mutants dominant-ngatifs ou par inhibition de leur expression endogne, ne rvlent aucun changement de la cintique de rparation des dommages UV par excision de nuclotides. Cependant, lutilisation de cette mme mthode de rparation, mais cette fois, applique pour ltude de rparation NER en fonction du cycle cellulaire, a permis de mettre en vidence la ncessit fonctionnelle de lADN polymrase translsionnelle eta (Pol ) dans la rparation NER des dommages UV, uniquement en phase S. Cette observation fut initialement caractrise dans les cellules de patients affects du syndrome variant de xrodermie pigmentaire (XP-V) puis, confirme ensuite par linhibition de lexpression de Pol endogne ou par la complmentation avec des mutants non-fonctionnels dans les cellules XP-V. Ces rsultats indiquent que, contrairement la rponse UV MAPK cytoplasmique, les vnements nuclaires comme la synthse translsionnelle, peuvent influencer lefficacit de rparation NER en phase S. Plus particulirement, ces donnes tablissent un lien possible entre la rparation NER en phase S et les niveaux de stress rplicatifs, rvl ici par la dficience fonctionnelle Pol ou ATR. Les observations, prsentes dans cette thse, renforcent un rle du point de contrle S aux UV sur lefficacit de la rparation NER et suggrent que linhibition NER, observe en phase S dans les cellules XP-V, est module par le stress rplicatif. Un tel moyen de contrle pourrait avoir une action plutt protectrice pendant cette phase critique du cycle cellulaire. Mots cls: UV, translsionnelle, eta, MAPK, NER, CPD, cytomtrie, phase-S, tolrance.
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La vasculopathie du greffon est une pathologie caractrise par un rtrcissement progressif et oblitrant des vaisseaux sanguins menant une ischmie et une perte de fonction du greffon. Le rtrcissement vasculaire est d une accumulation de matrice extracellulaire (MEC) et de cellules mononucles positives pour lactine musculaire lisse alpha (alphaSMA) dont les cellules souches msenchymateuses, le tout formant une nointima oblitrante. Cette pathologie est la cause principale de la perte des greffons rnaux et cardiaques long terme. Le rejet vasculaire aigu est un prdicteur de la vasculopathie du greffon. Lquipe du Dr Hbert a dmontr que lapoptose endothliale, qui joue un rle important dans le dveloppement du rejet vasculaire, initie la libration de LG3, un fragment du protoglycan perlcan. Les taux sanguins et urinaires de LG3 sont augments chez les receveurs dallogreffe rnale avec rejet vasculaire et vasculopathie du greffon. Les rsultats obtenus en laboratoire durant ma matrise ont permis de mieux caractriser limpact du LG3 sur un type cellulaire important participant la formation de nointima : les cellules souches msenchymateuses. Mes travaux ont dmontr que le LG3 induit la fois la migration horizontale des MSC et la transmigration des MSC. Cette migration est dpendante de la voie de signalisation dERK1/2, prcdemment identifie comme voie centrale dans la formation de nointima. De plus, nos rsultats dmontrent que la kinase Src est active en amont de lactivation de la voie MAPK. La migration horizontale et la transmigration induites par le LG3 sont aussi dpendantes des intgrines alpha2beta1, ainsi que lactivation de la voie MAPK. Dans un modle de transplantation murin, nous avons galement dmontr que linjection srique de LG3 recombinant favorise laccumulation de cellules positives pour alphaSMA dans la nointima. En outre, lorsque le receveur est dficient pour lintgrine alpha2, mais que le greffon est sauvage, la formation de nointima induite par linjection de LG3 est diminue dans le greffon suggrant que les cellules du receveur jouent un rle important dans la formation de la nointima. Enfin, nous avons dmontr que linjection de LG3 augmente aussi le nombre de cellules positives pour la forme phosphoryle dERK1/2 (p-ERK1/2) dans la nointima du greffon et que cette accumulation est dpendante de la prsence des intgrines 2 1 chez les cellules du receveur.Lorsque le receveur est sauvage, il y a une augmentation du nombre de cellules positives pour p-ERK1/2. Linvestigation de ces mcanismes dans le remodelage vasculaire expose de nouvelles opportunits pour inhiber la rponse cellulaire qui mne au remodelage inadapt lors dun dommage vasculaire chronique et ainsi prolonger la survie du greffon.
