Integrazione della riduzione della mobilità respiratoria nel trattamento radiante esterno conformazionale

Several methods to reduce respiratory-induced motion have been described in literature, with the goal of increasing accuracy of treatment to minimize normal tissue toxicity or increase dose to the target volume. We analyzed two different techniques of respiratory gating: the deep inspiration breath hold technique and the respiratory gating using the Real-time Position Management (RPM) system. The first method is a self-gating technique in which radiation treatment take place during a phase of breath-holding. The second technique use a reflective marker placed on the patient’s anterior surface. The motion of the marker is tracked using a camera interfaced to a computer. The gating thresholds are set when the tumor is in the desired portion of the respiratory cycle. These thresholds determine when the gating system turns the treatment beam on and off. We compared both techniques with a standard external radiation treatment. The dosimetric analysis has led to considerable advantage of these methods compared to the external radiation treatment, particularly in reducing the dose to the lung.

Bioinformatische, genomweite Analyse genexpressionsregulierender Faktoren in Lebergewebe

Für eine Reihe einzelner genetischer Faktoren und Promotorelemente wurde in der Vergangenheit eine Regulation der Genexpression in der Leber (und auch in anderen Geweben) gezeigt. Mit der Verfügbarkeit des gesamten humanen Genoms sowie dessen Expressionsdaten in großen Microarray- und SAGE-Datenbanken bietet sich die Möglichkeit, solche Regulationsmechanismen in großem, genomweitem Maßstab zu untersuchen. Dabei geht diese Arbeit der Frage nach, ob es übergeordnete, eine Expression speziell in der Leber fördernde oder hemmende Faktoren gibt oder ob jedes Gen von einer unabhängigen Kombination von Faktoren reguliert wird, in dessen Summe die Expression des individuellen Gens in der Leber am stärksten ist. Sollten sich übergeordnete, eine Expression in der Leber stimulierende Faktoren finden, wären diese interessant für die Entwicklung neuer Behandlungskonzepte bei Lebererkrankungen. Zur Untersuchung dieser Fragestellung wurden aus einem Affymetrix Microarray Datenset für 12 Gewebe die Expressiondaten von insgesamt jeweils 15.472 Genen extrahiert. In einem zweiten Schritt wurden zusätzlich die Promotorsequenzen der einzelnen zugehörigen Gene, definiert als eine 1000 bp Region upstream des Transkriptionsstarts, in dieselbe Datenbank abgelegt. Die Promotorsequenzen wurden über den PromotorScan-Algorithmus analysiert. Auf diese Weise wurden Transkriptionsfaktorbindungsstellen auf 7042 der Promotoren identifiziert. Es fand sich eine Gesamtzahl von 241.984 Transkriptionsfaktorbindungsstellen. Anhand der Microarray-Expressionsdaten wurde die Gesamtgruppe der verfügbaren Gene und Promotoren in zwei Gruppen unterteilt, nämlich in die Gruppe der Gene, deren Expression in der Leber deutlich am höchsten gefunden wurde und in die Gruppe der Gene, die in anderen Geweben am höchsten exprimiert waren. Jeder potentiell bindende Transkriptionsfaktor wurde auf unterschiedliches Vorkommen in diesen beiden Gruppen hin untersucht. Dies geschah unter der Vorstellung, dass übergeordnete Faktoren, die eine Expression in der Leber stimulieren in der Gruppe der Gene, die in der Leber am höchsten exprimiert sind, verhältnismäßig wesentlich häufiger zu finden sein könnten. Eine solches häufigeres Vorkommen ließ sich jedoch für keinen einzigen Faktor nachweisen. Transkriptionsfaktorbindungsstellen sind typischerweise zwischen 5 und 15 bp lang. Um auszuschließen, dass mit dem verwendeten PromotorScan-Algorithmus Transkriptionsfaktorbindungsstellen, die bisher nicht bekannt sind, nicht übersehen wurden, wurden die Häufigkeit sämtlicher möglicher 8 bp (48) und 10 bp (410) Nukleotid-Kombinationen in diesen Promotoren untersucht. Biologisch relevante Unterschiede fanden sich zwischen den beiden Gruppen nicht. In gleicher Weise wurde auch die Bedeutung von TATA-Boxen untersucht. TATA-Boxen kommt bei der Transkriptionsinitiierung eine wichtige Rolle zu, indem über sie die Bindung des initialen Transkriptionskomplexes vermittelt wird. Insgesamt 1033 TATA-Boxen wurden ebenfalls mittels PromotorScan vorausgesagt. Dabei waren 57 auf Promotoren von Genen, die in der Leber überexprimiert waren und 976 auf Promotoren von Genen, die in anderen Geweben überexprimiert waren. Der Vergleich dieser beiden Gruppen ließ keine signifikant unterschiedliche Häufigkeit an TATA-Boxen erkennen. Im weiteren wurde die Bedeutung von CpG-Islands für eine potentiell differentielle Regulation untersucht. Insgesamt wurden 8742 CpG-Islands in einem Bereich von bis zu 5 kb upstream des Transkriptionsstarts identifiziert, 364 davon auf Promotoren von Genen, die am höchsten in der Leber exprimiert waren, 8378 auf Promotoren von Genen, die in anderen Geweben am höchsten exprimiert waren. Signifikante Unterschiede in der Verteilung von CpG-Islands auf Promotoren dieser beiden Gengruppen ließen sich nicht nachweisen. Schließlich wurden die RNA- und Proteinsequenzen des Transkriptoms und Proteoms hinsichtlich ihrer Zusammensetzung aus einzelnen Nukleotiden bzw. Aminosäuren analysiert. Auch hierbei fanden sich keine signifikanten Unterschiede in der Verteilung zwischen beiden Gengruppen. Die Zusammenschau der Ergebnisse zeigt, dass die Regulation der einzelnen Gene im Lebergewebe im wesentlichen individuell erfolgt. Im Rahmen der vorgelegten bioinformatischen Analysen fanden sich keine übergeordneten genetischen „Leberfaktoren“, die speziell eine Expression von Genen in der Leber stimulieren. Neue therapeutische Ansätze, die auf eine Regulation der Genexpression in der Leber zielen, werden somit auch weiterhin auf die Beeinflussung individueller Gene fokussiert bleiben.

Genetic analysis of tumour initiation and progression in a Drosophila model of epithelial cancer

Neoplastic overgrowth depends on the cooperation of several mutations ultimately leading to major rearrangements in cellular behaviour. The molecular crosstalk occurring between precancerous and normal cells strongly influences the early steps of the tumourigenic process as well as later stages of the disease. Precancerous cells are often removed by cell death from normal tissues but the mechanisms responsible for such fundamental safeguard processes remain in part elusive. To gain insight into these phenomena I took advantage of the clonal analysis methods available in Drosophila for studying the phenotypes due to loss of function of the neoplastic tumour suppressor lethal giant larvae (lgl). I found that lgl mutant cells growing in wild-type imaginal wing discs are subject to the phenomenon of cell competition and are eliminated by JNK-dependent cell death because they express very low levels of dMyc oncoprotein compared to those in the surrounding tissue. Indeed, in non-competitive backgrounds lgl mutant clones are able to overgrow and upregulate dMyc, overwhelming the neighbouring tissue and forming tumourous masses that display several cancer hallmarks. These phenotypes are completely abolished by reducing dMyc abundance within mutant cells while increasing it in lgl clones growing in a competitive context re-establishes their tumourigenic potential. Similarly, the neoplastic growth observed upon the oncogenic cooperation between lgl mutation and activated Ras/Raf/MAPK signalling was found to be characterised by and dependent on the ability of cancerous cells to upregulate dMyc with respect to the adjacent normal tissue, through both transcriptional and post-transcriptional mechanisms, thereby confirming its key role in lgl-induced tumourigenesis. These results provide first evidence that the dMyc oncoprotein is required in lgl mutant tissue to promote invasive overgrowth in developing and adult epithelial tissues and that dMyc abundance inside versus outside lgl mutant clones plays a key role in driving neoplastic overgrowth.

Role of Notch signalling in human hepatocellular carcinoma

The Notch signalling is a cellular pathway that results conserved from Drosophila to Homo sapiens controlling a wide range of cellular processes in development and in differentiated organs. It induces cell proliferation or differentiation, increased survival or apoptosis, and it is involved in stemness maintainance. These functions are conserved, but exerted with a high tissue and cellular context specificity. Signalling activation determs nuclear translocation of the receptor’s cytoplasmic domain and activation of target genes transcription. As many developmental pathway, Notch deregulation is involved in cancer, leading to oncogenic or tumour suppressive role depending on the functions exerted in normal tissue. Notch1 and Notch3 resulted aberrantly expressed in human hepatocellular carcinoma (HCC) that is the more frequent tumour of the liver and the sixth most common tumour worldwide. This thesis has the aim to investigate the role of the signalling in HCC, with particular attention to dissect common and uncommon regulatory pathways between Notch1 and Notch3 and to define the role of the signalling in HCC. Nocth1 and Notch3 were analysed on their regulation on Hes1 target and involvement in cell cycle control. They showed to regulate CDKN1C/p57kip2 expression through Hes1 target. CDKN1C/p57kip2 induces not only cell cycle arrest, but also senescence in HCC cell lines. Moreover, the involvement of Notch1 in cancer progression and epithelial to mesenchymal transition was investigated. Notch1 showed to induce invasion of HCC, regulating EMT and E- Cadherin expression. Moreover, Notch3 showed specific regulation on p53 at post translational levels. In vitro and ex vivo analysis on HCC samples suggests a complex role of both receptors in regulate HCC, with an oncogenic role but also showing tumour suppressive effects, suggesting a complex and deep involvement of this signalling in HCC.

Glykolytische Aktivität von Ovarialkarzinomzelllinien in vitro und in vivo und die Bedeutung von HIF-1alpha

Ovarialkarzinome stellen eine schwer zu therapierende onkologische Erkrankung mit im Durchschnitt sehr schlechter Prognose dar. Die Notwendigkeit einer weiteren Verbesserung der Therapie dieser Erkrankung ist sehr offensichtlich. Studien an anderen Tumorentitäten haben die große Bedeutung des Glukosestoffwechsels, speziell des Laktats, in der Erken- nung, Kategorisierung und Therapie von onkologischen Erkrankungen gezeigt. In der Kon- trolle des Glukosestoffwechsels, aber auch vieler anderer Funktionen, wie z. B. des Tumor- wachstums und des Zellüberlebens, hat sich der Hypoxia Inducible Factor (HIF) als beson- ders wichtig herausgestellt. In der vorliegenden Arbeit wurde daher der Glukosestoffwechsel in Ovarialkarzinomen und seine Beeinflussung durch eine Herunterregulierung von HIF-1α untersucht. Hierzu wurden die Ovarialkarzinomzelllinien OC 316 und IGROV1 (Wildtyp) und die Zelllinie OC 316 mit einem lentiviralen Vektor zur Herunterregulierung von HIF-1α ver- wendet. Das Wachstumsverhalten, die Laktatproduktion und der Glukoseverbrauch wurden bei diesen Zelllinien in vitro untersucht. Darüber hinaus wurden mithilfe der bildgebenden Biolumineszenz ATP, Laktat, Pyruvat und Glukose in Xenotransplantaten dieser Zelllinien gemessen. Diese in unserer Arbeitsgruppe entwickelte Methode erlaubt die quantitative Er- fassung von Metaboliten in selektiven Gewebsarealen, wie z. B. in vitalen Tumorregionen, in stomatösen Arealen oder im tumornahen Normalgewebe.rnIn dieser Arbeit kann gezeigt werden, dass die glykolytische Aktivität von Ovarialkarzinom- zelllinien mit dem Wachstumsverhalten positiv korreliert ist. Eine Herunterregulierung von HIF-1α führt zu einer deutlichen Verlangsamung des Zellwachstums, wobei allerdings alle HIF-Zielgene betroffen sein können. Des Weiteren wird mit den hier gezeigten Daten die prognostische Bedeutung des Laktats bestätigt. Hohe Laktatwerte in vitro waren mit schnel- lerem Wachstum korreliert. Zusätzlich zeigen die vorliegenden Daten, dass die gewonnenen Befunde in vitro nur näherungsweise auf die in vivo Situation übertragbar sind. Eine Herun- terregulierung von HIF-1α zeigt keine signifikant unterschiedlichen Laktatwerte in den Xe- notransplantaten. Allerdings spiegeln sich zelllinienspezifische Unterschiede in der metabo- lischen Aktivität in vitro im metabolischen Verhalten der entsprechenden Xenografttumoren recht gut wider.rnDie gewonnenen Ergebnisse weisen zum einen auf die prognostische Bedeutung einer Bestimmung von Laktatkonzentrationen aus Tumorbiopsien hin und bestätigen zum anderen die klinische Aussagekraft metabolischer Aktivitätsmessungen mittels PET. Solche Daten könnten dazu dienen Patienten einer individualisierten Therapie zuzuführen. Außerdem wur- de die Effektivität, aber auch die Komplexität einer gegen HIF-1α gerichteten Therapie auf Protein- und Genebene bestätigt. Somit zeigen die erzielten Resultate einerseits Möglichkei- ten einer individualisierten Therapie auf, andererseits unterstreichen sie die große Notwen- digkeit weiterer Grundlagenforschung auf diesem Gebiet.

Untersuchungen zum Einfluss des HMG-CoA-Reduktase-Inhibitors Lovastatin auf die Toxizität ionisierender Strahlung sowie des Anthrazyklinderivats Doxorubicin im Mausmodell

Hintergund: HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren (Statine) sind klinisch etablierte Cholesterinsenker. Über die Inhibition der intrinsischen Cholesterinbiosynthese hinaus zeigen sie sogenannte pleiotrope biologische Effekte. Ein Großteil dieser Wirkungen wird auf die Inhibition kleiner Ras homologer GTPasen (Rho GTPasen) zurückgeführt. In vitro schützt das Statinderivat Lovastatin (Lova) primäre humane Endothelzellen vor der Zytotoxizität von ionisierender Strahlung (IR) und dem Krebsmedikament Doxorubicin (Doxo). Zielsetzung: Die Relevanz dieser Befunde für ein in vivo Mausmodell sollte in der vorliegenden Arbeit überprüft werden. Dafür wurden BALB/c-Mäuse mit IR oder Doxo behandelt und der Einfluss einer Kobehandlung mit Lova auf verschiedene Toxizitätsendpunkte untersucht (24 h nach einer einzelnen hohen Dosis IR (i), 14 Tage nach zwei geringen Dosen IR (ii), 48 h nach einer einzelnen hohen Dosis Doxo (iii), sowie 8 Tage nach drei niedrigen Dosen Doxo (iv)). Eine mögliche gleichzeitige Protektion von Tumorzellen durch die Statingabe wurde in einem Xenotransplantationsexperiment überprüft (v), in dem das gleiche Behandlungsschema wie bei iv angewendet wurde. Ergebnisse: Es konnte gezeigt werden, dass eine Statinbehandlung Normalgewebe vor Doxo- und IR-induzierter Toxizität schützt, ohne gleichzeitig protektiv auf transformierte Zellen zu wirken. Dieser Effekt ist wahrscheinlich von einer Inhibition der kleinen GTPasen Rac1 und RhoA abhängig und einer daraus folgenden Modifizierung der DNA-Schadensantwort. i: Die Statinvorbehandlung der Mäuse hatte keinen Einfluss auf die Bildung von initialen IR-induzierten DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) in der Leber. Die Lova-Behandlung wirkte sich jedoch auf IR-induzierte Stressantworten aus, was sich in einer Minderung der Expression von Inflammations- und Fibrosesurrogatmarkern in Leber und Darm widerspiegelte. ii: In der Lunge der Tiere wurde ein Anstieg von molekularen Inflammations- und Fibrosesurrogatmarkern detektiert, der bei Statinkobehandlung ausblieb. Zudem verhinderte die Kobehandlung mit Lova eine IR-induzierte Abnahme der Thrombozytenzahl, ohne sich auf die durch IR verringerte Leukozytenzahl im Blut auszuwirken. iii: Die Verabreichung einer hohen Dosis Doxo induzierte DSB-Formation in der Leber. Die Statinvorbehandlung reduzierte deren Menge um ca. 50 %. Dieser genoprotektive Effekt war unabhängig von der Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies sowie einer Änderung des Doxo-Imports oder Exports. Die Expression von proinflammatorischen und profibrotischen Genen fiel besonders in der Leber und im Herzen durch die Lova-Kobehandlung geringer aus, als in der nur mit Doxo behandelten Gruppe. Zudem verringerte Lova die durch Doxo induzierte Hochregulation von für den AP1-Komplex kodierenden Genen sowie von Zellzykluskontrollfaktoren. Die Lova-Vorbehandlung führte darüber hinaus im Herzen zu einem reduzierten mRNA-Spiegel der Topoisomerasen II α und β. iv: Es konnten schwere Herz- und Leberschäden detektiert werden (gemessen an Gldh-, Gpt- sowie cTn-I-Serumkonzentrationen), die bei einer Kobehandlung mit dem Statin nicht auftraten. Die Lova-Kobehandlung verhinderte außerdem eine durch die Doxo-Behandlung verringerte Leukozytenzahl. Molekulare Marker für frühe fibrotische Ereignisse, sowie für Inflammation und Hypertrophie waren in der Leber und im Herzen nach der Doxo-Behandlung erhöht. Das Statin war auch hier in der Lage, diese toxischen Wirkungen des Anthrazyklins zu mindern. Auch die Doxo-induzierte Expression von Surrogatmarkern für Zellantworten auf oxidativen Stress wurde in der Leber abgeschwächt. In der Leber und im Herzen wiesen die mit Doxo behandelten Tiere höhere mRNA Spiegel von an Zellzykluskontrolle beteiligten Faktoren sowie von DNA-Reparatur und Fremdstoffmetabolismus assoziierten Genen auf. Am stärksten wurde die Expression von Topoisomerase II alpha - ein molekularer Marker für Zellproliferation und bedeutsame Zielstruktur von Doxo - in der Leber hochreguliert. Die Statin-Kobehandlung verhinderte all diese Doxo-induzierten Expressionsänderungen. Im Gegensatz zur Leber wurde die Top2a-mRNA Menge im Herzen durch die Doxo-Applikation reduziert. Auch hier bewirkte die Kobehandlung mit dem Statin, dass die Expression nahe dem Kontrollniveau blieb. v: Die Kobehandlung mit Lova führte zu keinem Schutz der Tumorzellen vor Doxo, sondern erhöhte sogar dessen antineoplastisches Potential.rnFazit: Die Erkenntnisse aus vorhergegangenen in vitro Versuchen konnten zum großen Teil auf die in vivo Situation im Mausmodell übertragen werden. Sie stehen im Einklang mit Ergebnissen anderer Gruppen, welche die Inhibition kleiner GTPasen mit einer geringeren, durch zytotoxische Substanzen induzierten, Inflammation und Fibrose korrelieren konnten. Eine Kobehandlung mit Lova während einer Krebstherapie erscheint somit als vielversprechende Möglichkeit Doxo- oder IR-induzierte Nebenwirkungen auf Normalgewebe zu mildern.

Glukose-konjugierte Hemmstoffe als Strategie der gezielten Hemmung des DNA-Reparaturproteins O 6 -Methylguanin-DNA-Methyltransferase in Tumorzellen und der Einfluss von ATP-binding cassette Transportern

Das DNA-Reparaturprotein O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase [MGMT] ist der Hauptresistenzfaktor gegenüber der zytotoxischen Wirkung von SN1-alkylierenden Zytostatika in der Tumortherapie. Die Verwendung der MGMT-Hemmstoffe O6-Benzylguanin [O6BG] und O6-(4-Bromothenyl)guanin [O6BTG] führte zu einer Sensibilisierung des Normalgewebes, was eine Dosis-Reduktion der Zytostatika erforderlich machte und die erhoffte Therapieverbesserung verhinderte. Aus diesem Grund ist eine Strategie der selektiven Hemmung des MGMT-Proteins (Targeting-Strategie) erforderlich, um die systemische Toxizität in der Kombinationsbehandlung zu reduzieren. In dieser Arbeit wurde die Anwendbarkeit der Glukose-Konjugation als Targeting-Strategie untersucht, da Tumorzellen einen erhöhten Glukoseverbrauch aufweisen und demzufolge Glukosetransporter überexprimieren. Die Glukose-Konjugate O6BG-Glu und O6BTG-Glu inhibierten MGMT in Tumorzellen und sensibilisierten die Zellen gegenüber den alkylierenden Agenzien Temozolomid [TMZ] und Lomustin [CCNU]. Des Weiteren inaktivierten die Glukose-Konjugate die MGMT-Aktivität im Tumor eines Xenograft-Mausmodells und reduzierten das Tumorwachstum nach einer TMZ-Behandlung im gleichen Ausmass wie die Inhibitoren O6BG und O6BTG. Trotzdem war auch mit den Glukose-Konjugaten keine Steigerung der Zytostatika-Dosis im Mausmodell möglich. Die Untersuchungen der Aufnahme von O6BG-Glu und O6BTG-Glu wiederlegten eine Involvierung der Glukosetransporter. Der Einsatz von spezifischen Glukosetransporter-Inhibitoren und Kompetitions-Experimenten führte zu keiner Verminderung der MGMT-Hemmung oder Aufnahme vom radioaktiven H3-O6BTG-Glu in die Zelle. Dies legt nahe, dass die Glukose-Konjugate über einen unspezifischen Mechanismus (aktiv) in die Zellen gelangen. Der Grund für eine mögliche unselektive Aufnahme könnte im hydrophoben Alkyllinker, der für die Konjugation des Glukosemoleküls verwendet wurde, begründet sein. Dies führt zur Generierung von amphipathischen Konjugaten, die eine initiale Bindung an die Plasmamembran aufweisen und eine Aufnahme über den Flip-Flop-Mechanismus (transbilayer transport) wahrscheinlich machen. Die amphipathische Molekülstruktur der Glukose-Konjugate führte zu einer Partikelbildung in wässrigen Lösungen, die eine Reduktion der Menge an aktiven Monomeren von O6BG-Glu und O6BTG-Glu bewirken, die zur Hemmung von MGMT zur Verfügung stehen. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Rolle von ABC-Transportern hinsichtlich einer Targeting-Strategie von MGMT-Hemmstoffen. Obwohl eine hohe Expression dieser ABC-Transporter in Tumoren zur Resistenzentwicklung gegenüber Zytostatika führt, wurde ihr Einfluss auf MGMT-Hemmstoffe oder einer MGMT-Targeting-Strategie niemals untersucht. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal ein aktiver Efflux von MGMT-Hemmstoffen durch ABC-Transporter nachgewiesen. Die Inhibition von ABC-Transportern bewirkte eine schnellere Inaktivierung von MGMT durch die Glukose-Konjugate. Des Weiteren zeigten Kompetitions-Experimente mit den MGMT-Hemmstoffen eine verminderte Efflux-Rate von Fluoreszenzfarbstoffen, die spezifisch von ABC-Transportern exportiert werden. ABC-Transporter reduzieren die wirksame Konzentration des Hemmstoffes in der Zelle und beeinträchtigen somit die Effektivität der MGMT-Inhibition. Eine simultane Hemmung der ABC-Transporter P-glycoprotein (P-gp), multi resistance protein 1 (MRP1) and breast cancer resistance protein (BCRP) erhöhte die Effektivität der MGMT-Hemmstoffe (O6BG, O6BTG, O6BG-Glu, O6BTG-Glu) und verstärkte auf diese Weise die TMZ-induzierte Toxizität in Tumorzelllinien. Die Involvierung von ABC-Transportern in der intrazellulären Speicherung von MGMT-Hemmstoffen ist wahrscheinlich die Ursache für die beobachteten Unterschiede in der Sensibilisierung verschiedener Tumorzelllinien gegenüber Zytostatika durch das Glukose-Konjugat O6BG-Glu. Eine Strategie, den Einfluss von ABC-Transportern zu reduzieren und zukünftliche MGMT-Targeting-Strategien effizienter umzusetzen, ist die Verwendung von O6BTG als Ausgangssubstanz. Die höhere Inhibitionsfähigkeit der Bromthiophenmoleküle vermindert die erforderliche intrazelluläre Konzentration für eine vollständige MGMT-Hemmung und reduziert auf diese Weise den Einfluss von ABC-Transportern.

Hierarchical clustering of flow cytometry data for the study of conventional central chondrosarcoma

We have investigated the use of hierarchical clustering of flow cytometry data to classify samples of conventional central chondrosarcoma, a malignant cartilage forming tumor of uncertain cellular origin, according to similarities with surface marker profiles of several known cell types. Human primary chondrosarcoma cells, articular chondrocytes, mesenchymal stem cells, fibroblasts, and a panel of tumor cell lines from chondrocytic or epithelial origin were clustered based on the expression profile of eleven surface markers. For clustering, eight hierarchical clustering algorithms, three distance metrics, as well as several approaches for data preprocessing, including multivariate outlier detection, logarithmic transformation, and z-score normalization, were systematically evaluated. By selecting clustering approaches shown to give reproducible results for cluster recovery of known cell types, primary conventional central chondrosacoma cells could be grouped in two main clusters with distinctive marker expression signatures: one group clustering together with mesenchymal stem cells (CD49b-high/CD10-low/CD221-high) and a second group clustering close to fibroblasts (CD49b-low/CD10-high/CD221-low). Hierarchical clustering also revealed substantial differences between primary conventional central chondrosarcoma cells and established chondrosarcoma cell lines, with the latter not only segregating apart from primary tumor cells and normal tissue cells, but clustering together with cell lines from epithelial lineage. Our study provides a foundation for the use of hierarchical clustering applied to flow cytometry data as a powerful tool to classify samples according to marker expression patterns, which could lead to uncover new cancer subtypes.

Preponderance of cells with stem cell characteristics in metastasising mouse mammary tumours induced by deregulated EphB4 and ephrin-B2 expression

We have previously shown that EphB4 and ephrin-B2 are differentially expressed in the mammary gland and that their deregulated expression in the mammary epithelium of transgenic mice leads to perturbations of the mammary parenchyma and vasculature. In addition, overexpression of EphB4 and expression of a truncated ephrin-B2 mutant, capable of receptor stimulation but incapable of reverse signalling, confers a metastasising phenotype on NeuT initiated mouse mammary tumours. We have taken advantage of this transgenic tumour model to compare stem cell characteristics between the non-metastasising and metastasising mammary tumours. We analysed the expression of the proliferation attenuating p21(waf) gene, which was significantly increased in the metastasising tumours. Moreover, we compared the expression of CK-19, Sca-1, CD24 and CD49f as markers for progenitor cells exhibiting a decreasing differentiation grade. Sca-1 expressing cells were the earliest progenitors detected in the non-metastasising NeuT induced tumours. The metastasising NeuT/EphB4 tumours were enriched in CD24 expressing cells, whereas the metastasising NeuT/truncated ephrin-B2 tumours contained in addition significant amounts of CD49f expressing cells. The same cell populations were also enriched in mammary glands of single transgenic MMTV-EphB4 and MMTV-truncated ephrin-B2 females indicating that deregulated EphB4-ephrin-B2 signalling interferes with the homeostasis of the stem/progenitor cell pool before tumour formation is initiated. Since the same cell populations are enriched in the normal tissue, primary mammary tumours and metastases we conclude that these progenitor cells were the origin of tumour formation and that this change in the tumour origin has led to the acquisition of the metastatic tumour phenotype.

A subset of metzincins and related genes constitutes a marker of human solid organ fibrosis

Metzincins and functionally related genes play important roles in extracellular matrix remodeling both in healthy and fibrotic conditions. We recently presented a transcriptomic classifier consisting of 19 metzincins and related genes (MARGS) discriminating biopsies from renal transplant patients with or without interstitial fibrosis/tubular atrophy (IF/TA) by virtue of gene expression measurement (Roedder et al., Am J Transplant 9:517-526, 2009). Here we demonstrate that the same algorithm has diagnostic value in non-transplant solid organ fibrosis. We used publically available microarray datasets of 325 human heart, liver, lung, kidney cortex, and pancreas microarray samples (265 with fibrosis, 60 healthy controls). Expression of nine commonly differentially expressed genes was confirmed by TaqMan low-density arrays (Applied Biosystems, USA) in 50 independent archival tissue specimens with matched histological diagnoses to microarray patients. In separate and in combined, integrated microarray data analyses of five datasets with 325 samples, the previously published MARGS classifier for renal post-transplant IF/TA had a mean AUC of 87% and 82%, respectively. These data demonstrate that the MARGS gene panel classifier not only discriminates IF/TA from normal renal transplant tissue, but also classifies solid organ fibrotic conditions of human pancreas, liver, heart, kidney, and lung tissue samples with high specificity and accuracy, suggesting that the MARGS classifier is a cross-platform, cross-organ classifier of fibrotic conditions of different etiologies when compared to normal tissue.

Clinical course of a malignant peripheral nerve sheath tumor in a Siberian tiger (Panthera tigris altaica)

A 14-year-old male Siberian tiger (Panthera tigris altaica) was admitted with an ulcerating mass on the right thoracic wall. Radiographic and computed tomographic evaluation indicated 2 isolated cutaneous masses without any signs of metastasis. Histology of a Tru-Cut biopsy revealed an anaplastic sarcoma with giant cells. Both tumors were resected with appropriate normal tissue margins. The size of the defect did not allow primary closure of the wound; therefore, a mesh expansion technique was attempted. Three months later, the tiger had to be euthanized due to extensive metastasis to the lungs. Histomorphological features and immunohistochemical results confirmed the diagnosis of malignant peripheral nerve sheath tumor. In contrast to domestic animal experience, the tumor had spread extensively to the lungs without local reccurrence in a short period of time. Correct diagnosis requires various immunohistochemical evaluations of the tumor tissue.

Photodynamic drug delivery enhancement in tumours does not depend on leukocyte-endothelial interaction in a human mesothelioma xenograft model

The pre-treatment of tumour neovessels by low-level photodynamic therapy (PDT) improves the distribution of concomitantly administered systemic chemotherapy. The mechanism by which PDT permeabilizes the tumour vessel wall is only partially known. We have recently shown that leukocyte-endothelial cell interaction is essential for photodynamic drug delivery to normal tissue. The present study investigates whether PDT enhances drug delivery in malignant mesothelioma and whether it involves comparable mechanisms of actions.

Characterization of CDKN2A(p16) methylation and impact in colorectal cancer: systematic analysis using pyrosequencing

Background The aim of this study is to analyse CDKN2A methylation using pyrosequencing on a large cohort of colorectal cancers and corresponding non-neoplastic tissues. In a second step, the effect of methylation on clinical outcome is addressed. Methods Primary colorectal cancers and matched non-neoplastic tissues from 432 patients underwent CDKN2A methylation analysis by pyrosequencing (PyroMarkQ96). Methylation was then related to clinical outcome, microsatellite instability (MSI), and BRAF and KRAS mutation. Different amplification conditions (35 to 50 PCR cycles) using a range of 0-100% methylated DNA were tested. Results Background methylation was at most 10% with ≥35 PCR cycles. Correlation of observed and expected values was high, even at low methylation levels (0.02%, 0.6%, 2%). Accuracy of detection was optimal with 45 PCR cycles. Methylation in normal mucosa ranged from 0 to >90% in some cases. Based on the maximum value of 10% background, positivity was defined as a ≥20% difference in methylation between tumor and normal tissue, which occurred in 87 cases. CDKN2A methylation positivity was associated with MSI (p = 0.025), BRAF mutation (p < 0.0001), higher tumor grade (p < 0.0001), mucinous histology (p = 0.0209) but not with KRAS mutation. CDKN2A methylation had an independent adverse effect (p = 0.0058) on prognosis. Conclusion The non-negligible CDKN2A methylation of normal colorectal mucosa may confound the assessment of tumor-specific hypermethylation, suggesting that corresponding non-neoplastic tissue should be used as a control. CDKN2A methylation is robustly detected by pyrosequencing, even at low levels, suggesting that this unfavorable prognostic biomarker warrants investigation in prospective studies.

Compensability index for compensation radiotherapy after treatment interruptions

Background The goal of our work was to develop a simple method to evaluate a compensation treatment after unplanned treatment interruptions with respect to their tumour- and normal tissue effect. Methods We developed a software tool in java programming language based on existing recommendations to compensate for treatment interruptions. In order to express and visualize the deviations from the originally planned tumour and normal tissue effects we defined the compensability index. Results The compensability index represents an evaluation of the suitability of compensatory radiotherapy in a single number based on the number of days used for compensation and the preference of preserving the originally planned tumour effect or not exceeding the originally planned normal tissue effect. An automated tool provides a method for quick evaluation of compensation treatments. Conclusions The compensability index calculation may serve as a decision support system based on existing and established recommendations.

[Radiotherapy of the prostate gland--old wine in a new bottle?]

The outcome and morbidity in the treatment of prostate cancer by radiation therapy depends on the balance between tumour control and normal tissue damage. Recent technological advances have allowed to reduce the amount of normal tissue included in target treatment volumes. This diminishes morbidity and provides an opportunity for dose escalation, increasing tumour control rates. The new application techniques are discussed along with their integration in treatment concepts. Although there are no randomised studies to provide evidence of increased survival, the available evidence supports the hypothesis that the introduction of novel radiation techniques leads to survival rates equivalent to surgical series with sufficient safety.