Glukose-konjugierte Hemmstoffe als Strategie der gezielten Hemmung des DNA-Reparaturproteins O 6 -Methylguanin-DNA-Methyltransferase in Tumorzellen und der Einfluss von ATP-binding cassette Transportern

Das DNA-Reparaturprotein O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase [MGMT] ist der Hauptresistenzfaktor gegenüber der zytotoxischen Wirkung von SN1-alkylierenden Zytostatika in der Tumortherapie. Die Verwendung der MGMT-Hemmstoffe O6-Benzylguanin [O6BG] und O6-(4-Bromothenyl)guanin [O6BTG] führte zu einer Sensibilisierung des Normalgewebes, was eine Dosis-Reduktion der Zytostatika erforderlich machte und die erhoffte Therapieverbesserung verhinderte. Aus diesem Grund ist eine Strategie der selektiven Hemmung des MGMT-Proteins (Targeting-Strategie) erforderlich, um die systemische Toxizität in der Kombinationsbehandlung zu reduzieren. In dieser Arbeit wurde die Anwendbarkeit der Glukose-Konjugation als Targeting-Strategie untersucht, da Tumorzellen einen erhöhten Glukoseverbrauch aufweisen und demzufolge Glukosetransporter überexprimieren. Die Glukose-Konjugate O6BG-Glu und O6BTG-Glu inhibierten MGMT in Tumorzellen und sensibilisierten die Zellen gegenüber den alkylierenden Agenzien Temozolomid [TMZ] und Lomustin [CCNU]. Des Weiteren inaktivierten die Glukose-Konjugate die MGMT-Aktivität im Tumor eines Xenograft-Mausmodells und reduzierten das Tumorwachstum nach einer TMZ-Behandlung im gleichen Ausmass wie die Inhibitoren O6BG und O6BTG. Trotzdem war auch mit den Glukose-Konjugaten keine Steigerung der Zytostatika-Dosis im Mausmodell möglich. Die Untersuchungen der Aufnahme von O6BG-Glu und O6BTG-Glu wiederlegten eine Involvierung der Glukosetransporter. Der Einsatz von spezifischen Glukosetransporter-Inhibitoren und Kompetitions-Experimenten führte zu keiner Verminderung der MGMT-Hemmung oder Aufnahme vom radioaktiven H3-O6BTG-Glu in die Zelle. Dies legt nahe, dass die Glukose-Konjugate über einen unspezifischen Mechanismus (aktiv) in die Zellen gelangen. Der Grund für eine mögliche unselektive Aufnahme könnte im hydrophoben Alkyllinker, der für die Konjugation des Glukosemoleküls verwendet wurde, begründet sein. Dies führt zur Generierung von amphipathischen Konjugaten, die eine initiale Bindung an die Plasmamembran aufweisen und eine Aufnahme über den Flip-Flop-Mechanismus (transbilayer transport) wahrscheinlich machen. Die amphipathische Molekülstruktur der Glukose-Konjugate führte zu einer Partikelbildung in wässrigen Lösungen, die eine Reduktion der Menge an aktiven Monomeren von O6BG-Glu und O6BTG-Glu bewirken, die zur Hemmung von MGMT zur Verfügung stehen. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Rolle von ABC-Transportern hinsichtlich einer Targeting-Strategie von MGMT-Hemmstoffen. Obwohl eine hohe Expression dieser ABC-Transporter in Tumoren zur Resistenzentwicklung gegenüber Zytostatika führt, wurde ihr Einfluss auf MGMT-Hemmstoffe oder einer MGMT-Targeting-Strategie niemals untersucht. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal ein aktiver Efflux von MGMT-Hemmstoffen durch ABC-Transporter nachgewiesen. Die Inhibition von ABC-Transportern bewirkte eine schnellere Inaktivierung von MGMT durch die Glukose-Konjugate. Des Weiteren zeigten Kompetitions-Experimente mit den MGMT-Hemmstoffen eine verminderte Efflux-Rate von Fluoreszenzfarbstoffen, die spezifisch von ABC-Transportern exportiert werden. ABC-Transporter reduzieren die wirksame Konzentration des Hemmstoffes in der Zelle und beeinträchtigen somit die Effektivität der MGMT-Inhibition. Eine simultane Hemmung der ABC-Transporter P-glycoprotein (P-gp), multi resistance protein 1 (MRP1) and breast cancer resistance protein (BCRP) erhöhte die Effektivität der MGMT-Hemmstoffe (O6BG, O6BTG, O6BG-Glu, O6BTG-Glu) und verstärkte auf diese Weise die TMZ-induzierte Toxizität in Tumorzelllinien. Die Involvierung von ABC-Transportern in der intrazellulären Speicherung von MGMT-Hemmstoffen ist wahrscheinlich die Ursache für die beobachteten Unterschiede in der Sensibilisierung verschiedener Tumorzelllinien gegenüber Zytostatika durch das Glukose-Konjugat O6BG-Glu. Eine Strategie, den Einfluss von ABC-Transportern zu reduzieren und zukünftliche MGMT-Targeting-Strategien effizienter umzusetzen, ist die Verwendung von O6BTG als Ausgangssubstanz. Die höhere Inhibitionsfähigkeit der Bromthiophenmoleküle vermindert die erforderliche intrazelluläre Konzentration für eine vollständige MGMT-Hemmung und reduziert auf diese Weise den Einfluss von ABC-Transportern.

The DNA repair protein O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) is the main factor in the resistance of tumors to the cytotoxic effect of O6-alkylating anticancer drugs such as temozolomide (TMZ), dacarbazine, carmustine and lomustine (CCNU). There have been numerous attempts to inactivate MGMT with different inhibitors like O6-benzylguanine (O6BG) or O6-(4-bromothenyl)guanine (O6BTG). Clinically applied, however, MGMT inhibitors have thus far failed to produce the expected therapeutic results. The reason being is that they inhibit MGMT in normal tissue as well as in tumor tissue, leading to general sensitization, which in turn, requires a dose-reduction of anticancer drugs. Since these inhibitors increase the bone marrow toxicity of alkylating agents, application of targeting strategies for MGMT inhibitors should improve chemotherapy by selective inhibition of MGMT. A successful targeting strategy could be glucose conjugation, facilitated by the fact that tumors have a high glucose consumption and, therefore, overexpress certain glucose transporters. This work analysed the effectiveness of an MGMT targeting strategy, relying on conjugating the MGMT inhibitors O6BG and O6BTG to ß-glucose (the conjugates are O6BG-Glu and O6BTG-Glu) in order to enrich cancer cells with these inhibitors and inhibit MGMT primarily in tumors. The glucose-conjugates O6BG-Glu and O6BTG-Glu were efficient at inhibiting MGMT on enzyme level, consequently leading to sensitization of cancer cells against alkylating agents in vitro and reduced melanoma growth in a mouse xenograft model after treatment with TMZ. As with the non-conjugated MGMT inhibitors, the maximum tolerated dose of O6-alkylating anticancer drugs with glucose-conjugates was also limited by toxicity in vivo. The uptake of O6BG-Glu and O6BTG-Glu was not dependent on glucose transporters, since their inhibition using specific inhibitors or by competition with glucose did not abolish MGMT inhibition or accumulation of tritium labelled O6BTG-Glu into cells. So far, the complex uptake mechanism is unknown, however, there is evidence to suggest an unspecific mechanism how the glucose-conjugates enter various cell types. The use of the hydrophobic linker between glucose and the inhibitor molecule could be the reason for unselective uptake, due the fact that it has amphipathic characteristics. The amphipathic properties enabled an initial binding at the plasma membrane and probably allowed the uptake of the glucose conjugates via transbilayer transport (flip-flop). The amphipathic properties of the glucose conjugates also led to formation of micelles-like particles in aqueous solution, consequently reducing the number of active monomers of O6BG-Glu and O6BTG-Glu that are available for MGMT inhibiton. The second part of the work dealt with the function of ATP-binding cassette (ABC) transporters on MGMT targeting strategies. Expression of certain efflux transporter mediates resistance in tumors against various chemotherapeutics. However, their effects on MGMT inhibitors or MGMT targeting strategies were never analyzed. For the first time, this work confirmed an active efflux of MGMT inhibitors via ABC transporters. Inhibition of ABC transporters led to faster inactivation of MGMT by the glucose conjugates and competition with MGMT inhibitors reduced active efflux of fluorescent dyes, which represent substrates for specific ABC transporters. Pharmacological inhibition of the ABC transporters P-glycoprotein (P-gp), multi resistance protein 1 (MRP1) and breast cancer resistance protein (BCRP) increased the induction of cell death in the combination treatment of MGMT inhibitors (O6BG, O6BTG, O6BG-Glu, O6BTG-Glu) and TMZ in vitro. Consequently, maximal sensitization of cancer cells with MGMT inhibitors was dependent on efflux mechanisms that control the intracellular concentration of the therapeutics. Probably, active efflux of the glucose conjugated MGMT inhibitor O6BG-Glu by ABC transporter was the cause of difference in sensitization of cancer cells against alkylating anticancer drugs. Strategies to overcome the influence of ABC transporters are necessary for successful MGMT targeting. A combination treatment of inhibitors for certain ABC transporters with selective MGMT inhibitors could be a useful approach to improve MGMT targeting strategies. Another possibility is the use of O6BTG as parental MGMT inhibitor for a targeting strategy via conjugation. The higher affinity of MGMT will diminish the required steady state concentration in the cell for a complete MGMT inhibition, reducing the influence of active efflux and enable a more successful MGMT targeting strategy.