Genetic analysis of superoxide dismutase 1 gene in murrah river buffalo

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

HLA-E coding and 3' untranslated region variability determined by next-generation sequencing in two West-African population samples

HLA-E is a non-classical Human Leucocyte Antigen class I gene with immunomodulatory properties. Whereas HLA-E expression usually occurs at low levels, it is widely distributed amongst human tissues, has the ability to bind self and non-self antigens and to interact with NK cells and T lymphocytes, being important for immunosurveillance and also for fighting against infections. HLA-E is usually the most conserved locus among all class I genes. However, most of the previous studies evaluating HLA-E variability sequenced only a few exons or genotyped known polymorphisms. Here we report a strategy to evaluate HLA-E variability by next-generation sequencing (NGS) that might be used to other HLA loci and present the HLA-E haplotype diversity considering the segment encoding the entire HLA-E mRNA (including 5'UTR, introns and the 3'UTR) in two African population samples, Susu from Guinea-Conakry and Lobi from Burkina Faso. Our results indicate that (a) the HLA-E gene is indeed conserved, encoding mainly two different protein molecules; (b) Africans do present several unknown HLA-E alleles presenting synonymous mutations; (c) the HLA-E 3'UTR is quite polymorphic and (d) haplotypes in the HLA-E 3'UTR are in close association with HLA-E coding alleles. NGS has proved to be an important tool on data generation for future studies evaluating variability in non-classical MHC genes.

Molecular characterization of interferon regulatory factor 1 in Bubalus bubalis

Interferon regulatory factor 1 (IRF1) is functionally diverse in the regulation of immune response and is considered to be an important candidate gene for studying disease susceptibility in mammals. In this paper, we characterized the whole sequence of the IRF1 gene in river buffalo (Bubalus bubalis) and compared genomic and the amino acid sequences between different species. The buffalo IRF1 gene was 7099 bp long and organized into 10 exons and nine introns. Its molecular structure showed exactly the same number of exons (10) and introns (nine) in bovids, mice, horses, humans, and chickens. However, rats did not have exon 5, but had the largest exon 4, which suggests that exon 5 was incorporated into exon 4. The coding and the amino acid sequences of the gene showed that identity varied from 73 to 99% at the coding sequence level and from 61 to 100% at the amino acid level when compared with other mammals and chickens. Comparative analysis of the gene sequence between two different buffalo breeds, Murrah and Mediterranean, revealed six potential SNPs that are primarily located in the 5' and 3'UTRs.

Genetic evaluation and activity of antifungal against clinical isolate Candida albicans biofilms

Candida yeasts are common in the oral cavity and can cause candidosis in the presence of predisposing factors, especially diabetes. The manifestation of the disease is related to this set of local factors such as the presence of dental prostheses, salivary pH, salivary flow and tobacco and the ability to form biofilms. Biofilms are specific and organized communities of cells under the control of signaling molecules rather than random accumulations of cells resulting from cell division and frequently are drugs resistance. Aim: The objectives of this study were to determine the genetic patterns of these C. albicans isolates and to evaluate the in vitro activity amphotericin B and caspofungin against C. albicans biofilms. Methods: Microbial samples were collected from subgingival sites and seeded in CHROMagar for subsequent identification of C. albicans by PCR. Genotypes were defined based on the identification of the transposable introns in the 25S rDNA by PCR. Results: In this study, 6 strains were identified as C. albicans and of these, 3 strains were genotype A and 3 were genotype B. The results showed that both amphotericin B and caspofungin exhibited strong antifungal activities against C. albicans biofilm formation and inhibiting the biofilm formation ranging from 70.8 – 95.3% and 77.7 - 88.7%, respectively. The antifungals studied had low inhibitory effect on preformed biofims, ranging from 39.5 - 50.8% for amphotericin B and from 23.1 - 36.9% for caspofungin at the same concentration. The activity of the two drugs was most effective in inhibit biofilm formation.

Multiple independent origins of mitochondrial control region duplications in the order Psittaciformes

mitochondrial genomes are generally thought to be under selection for compactness, due to their small size, consistent gene content, and a lack of introns or intergenic spacers. As more animal mitochondrial genomes are fully sequenced, rearrangements and partial duplications are being identified with increasing frequency, particularly in birds (Class Ayes). In this study, we investigate the evolutionary history of mitochondrial control region states within the avian order Psittaciformes (parrots and cockatoos). To this aim, we reconstructed a comprehensive multi-locus phylogeny of parrots, used PCR of three diagnostic fragments to classify the mitochondrial control region state as single or duplicated, and mapped these states onto the phylogeny. We further sequenced 44 selected species to validate these inferences of control region state. Ancestral state reconstruction using a range of weighting schemes identified six independent origins of mitochondrial control region duplications within Psittaciformes. Analysis of sequence data showed that varying levels of mitochondrial gene and tRNA homology and degradation were present within a given clade exhibiting duplications. Levels of divergence between control regions within an individual varied from 0-10.9% with the differences occurring mainly between 51 and 225 nucleotides 3' of the goose hairpin in domain I. Further investigations into the fates of duplicated mitochondrial genes, the potential costs and benefits of having a second control region, and the complex relationship between evolutionary rates, selection, and time since duplication are needed to fully explain these patterns in the mitochondrial genome. (C) 2012 Elsevier Inc. All rights reserved.

Sequence features responsible for intron retention in human

Abstract Background One of the least common types of alternative splicing is the complete retention of an intron in a mature transcript. Intron retention (IR) is believed to be the result of intron, rather than exon, definition associated with failure of the recognition of weak splice sites flanking short introns. Although studies on individual retained introns have been published, few systematic surveys of large amounts of data have been conducted on the mechanisms that lead to IR. Results TTo understand how sequence features are associated with or control IR, and to produce a generalized model that could reveal previously unknown signals that regulate this type of alternative splicing, we partitioned intron retention events observed in human cDNAs into two groups based on the relative abundance of both isoforms and compared relevant features. We found that a higher frequency of IR in human is associated with individual introns that have weaker splice sites, genes with shorter intron lengths, higher expression levels and lower density of both a set of exon splicing silencers (ESSs) and the intronic splicing enhancer GGG. Both groups of retained introns presented events conserved in mouse, in which the retained introns were also short and presented weaker splice sites. Conclusion Although our results confirmed that weaker splice sites are associated with IR, they showed that this feature alone cannot explain a non-negligible fraction of events. Our analysis suggests that cis-regulatory elements are likely to play a crucial role in regulating IR and also reveals previously unknown features that seem to influence its occurrence. These results highlight the importance of considering the interplay among these features in the regulation of the relative frequency of IR.

Genome mapping and expression analyses of human intronic noncoding RNAs reveal tissue-specific patterns and enrichment in genes related to regulation of transcription

Abstract Background RNAs transcribed from intronic regions of genes are involved in a number of processes related to post-transcriptional control of gene expression. However, the complement of human genes in which introns are transcribed, and the number of intronic transcriptional units and their tissue expression patterns are not known. Results A survey of mRNA and EST public databases revealed more than 55,000 totally intronic noncoding (TIN) RNAs transcribed from the introns of 74% of all unique RefSeq genes. Guided by this information, we designed an oligoarray platform containing sense and antisense probes for each of 7,135 randomly selected TIN transcripts plus the corresponding protein-coding genes. We identified exonic and intronic tissue-specific expression signatures for human liver, prostate and kidney. The most highly expressed antisense TIN RNAs were transcribed from introns of protein-coding genes significantly enriched (p = 0.002 to 0.022) in the 'Regulation of transcription' Gene Ontology category. RNA polymerase II inhibition resulted in increased expression of a fraction of intronic RNAs in cell cultures, suggesting that other RNA polymerases may be involved in their biosynthesis. Members of a subset of intronic and protein-coding signatures transcribed from the same genomic loci have correlated expression patterns, suggesting that intronic RNAs regulate the abundance or the pattern of exon usage in protein-coding messages. Conclusion We have identified diverse intronic RNA expression patterns, pointing to distinct regulatory roles. This gene-oriented approach, using a combined intron-exon oligoarray, should permit further comparative analysis of intronic transcription under various physiological and pathological conditions, thus advancing current knowledge about the biological functions of these noncoding RNAs.

Isolation and functional characterization of Hrp65-binding proteins in Chironomus tentans

It is well-established that the organization of nuclear components influences gene expression processes, yet little is known about the mechanisms that contribute to the spatial co-ordination of nuclear activities. The salivary gland cells of Chironomus tentans provide a suitable model system for studying gene expression in situ, as they allow for direct visualization of the synthesis, processing and export of a specific protein-coding transcript, the Balbiani ring (BR) pre-mRNA, in a nuclear environment in which chromatin and non-chromatin structures can easily be distinguished. The RNAbinding protein Hrp65 has been identified in this model system as a protein associated with non-chromatin nucleoplasmic fibers, referred to as connecting fibers (CFs). The CFs associate with BR RNP particles in the nucleoplasm, suggesting that Hrp65 is involved in mRNA biogenesis at the post-transcriptional level. However, the function of Hrp65 is not known, nor is the function or the composition of CFs. In the work described in this thesis, we have identified by yeast two-hybrid screening and characterized different proteins that bind to Hrp65. These proteins include a novel hnRNP protein in C. tentans named Hrp59, various isoforms of Hrp65, the splicing- and mRNA export factor HEL/UAP56, and a RING-domain protein of unknown function. Immuno-electron microscopy experiments showed that Hrp59 and HEL are present in CFs, and in larger structures in the nucleoplasm of C. tentans salivary gland cells. Hrp59 is a C. tentans homologue of human hnRNP M, and it associates cotranscriptionally with a subset of pre-mRNAs, including its own transcript, in a manner that does not depend quantitatively on the amount of synthesized RNA. Hrp59 accompanies the BR pre-mRNA from the gene to the nuclear envelope, and is released from the BR mRNA at the nuclear pore complex. We have identified the preferred RNA targets of Hrp59 in Drosophila cells, and we have shown that Hrp59 binds preferentially to exonic splicing enhancer sequences. Hrp65 self-associates through an evolutionarily conserved domain that can also mediate heterodimerization of Hrp65 homologues. Different isoforms of Hrp65 interact with each other in all possible combinations, and Hrp65 can oligomerize into complexes of at least six molecules. The interaction between different Hrp65 isoforms is crucial for their intracellular localization, and we have discovered a mechanism by which Hrp65-2 is imported into the nucleus through binding to Hrp65-1. Hrp65 binds to HEL/UAP56 in C. tentans cells. We have analyzed the distribution of the two proteins on polytene chromosomes and in the nucleoplasm of salivary gland cells, and our results suggest that Hrp65 and HEL become associated during posttranscriptional gene expression events. HEL binds to the BR pre-mRNP cotranscriptionally, and incorporation of HEL into the pre-mRNP does not depend on the location of introns along the BR pre-mRNA. HEL accompanies the BR mRNP to the nuclear pore and is released from the BR mRNP during translocation into the cytoplasm.

Funktionale Analyse des CpY/DmX Gens aus Chironomus und Drosophila melanogaster

Zusammenfassung: Funktionale Analyse des CpY/DmX Gens aus Chironomus und Drosophila melanogaster Bei CpY und DmX handelt es sich um homologe neuartige Gene aus den Dipteren Chironomus piger und Drosophila melanogaster. CpY und DmX bestehen aus 15 Exons, die für eine mRNA von ca. 11,5 kb kodieren.Das Gen hat eine genomische Länge von ca. 15 kb. Die abgeleiteten Genprodukte sind durch eine hohe Anzahl von WD-Repeats gekennzeichnet.WD-Proteine besitzen in der Regel regulatorische Funktionen in allen möglichen Bereichen. Ein Strukturvergleich mit homologen Genen legt die Vermutung nahe, daß sich sowohl am N- als auch am C-Terminus eine WD-Propellerstruktur befindet. CpY aus Chironomus piger ist in einem hromosomalen Abschnitt lokalisiert, der den Kern eines evolvierendenGeschlechtschromosoms darstellt. Dieses Gen besitzt im Gegensatz zu DmX geschlechtsspezifisch in Introns integrierte Transposons und wird quantitativ geschlechtsspezifisch gespleißt. DmX ist auf dem X-Chromosom im Bereich 5D6-5E1 lokalisiert, es konnte jedoch kein geschlechtsspezifisches Expressionsmuster diagnostiziert werden. Die Transkriptionsanalyse ergab,daß DmX während der Oogenese und der gesamten Embryonalentwicklung transkribiert wird. Dabei wird neben einer ubiquitären Grundexpression DmX in einer gewebespezifischen Weise exprimiert. Die DmX-Transkriptewandern offensichtlich - wie die CpY-Transkripte - in großer Menge in die reifende Oozyte. Bei DmX/CpY könnte es sich also um ein maternales Effektgen handeln. Während der Embryogenese können zunächst DmX-Transkripte am posterioren Pol nachgewiesen werden. Danach färben die vorderen und hinteren Mitteldarmvorläufer, dann spezifische Zellen im ZNS und in reifen Embryonen das gesamte ZNS, Sinnesorgan-Anlagen im Kopf, sowie der Enddarm. Das dem DmX benachbarte Gen DmSPX, welchen mit diesem einen gemeinsamen 174 bp großen bidirektionalen Promoter besitzt, zeigt ein von DmX unterschiedliches Transkriptionsmuster. Mit einer Reihe von Keimbahntransformationen konnten die für eine ordnungsgemäße Expression hinreichenden regulatorischen Bereiche identifiziert werden. In Versuchen, mittels verschiedener 'Antisense'-Strategien einen Phänotyp zu generieren, konnte kein spezifischer Phänotyp nachgewiesen werden. Durch die erfolgreiche Keimbahntranformationeines Rettungsvektors, welcher ein intaktes DmX-Gen enthält, konnte der Phänotyp von EMS-DmX-Mutanten identifiziert werden: Nach anfänglich normaler Embryonalentwicklung werden die Larven im Laufe des L1-Stadiums schlaff und inaktiv, jedoch nicht paralytisch und stellen Bewegung und Nahrungsaufnahme ein. Kurz nachdem wildtypische Larven das L2-Stadium erreichen, sterben die Mutanten ab. Der Phänotyp wei'st starke Ähnlichkeit zu Synaptotagmin I-Mutanten und zu alpha-Adaptin-Mutanten auf. Das Transkriptionsmuster ähnelt dem von alpha-Adaptin und AP50. Alle diese Gene spielen in der Endozytose eine Rolle

Primär- und Genstruktur des Hämocyanins der Schnecke Haliotis tuberculata

Als erste komplette Sequenz eines Gastropoden-Hämocyanins wurde das Hämocyanin von Haliotis tuberculata über cDNA vollständig kloniert und sequenziert. Die Primärstruktur besteht aus 3404 Aminosäuren mit einer errechneten Molekülmasse von 392 kDa. Neben der vollständigen Primärstruktur des sezernierten Proteins ist in der cDNA eine Signalsequenz kodiert. Mit Hilfe spezifischer Primer wurde die Genstruktur des HtH1-Gens zwischen der Signalsequenz und dem 3´-UTR über PCR aus genomischer DNA ermittelt. Dies ist die erste bekannte Genstruktur eines Schnecken-Hämocyanins. Das Gen umfaßt etwa 28,6 kb und besteht aus 17 Exons und 16 Introns. Die kodierende Sequenz des Signalpeptids und der acht FUs sind in den Linker-Regionen durch Introns (Linker-Introns) getrennt. Die Signalsequenz von bislang 48 Nukleotiden sowie die Sequenz der funktionellen Domänen HtH1-a, HtH1-f und HtH1-g sind durch 'interne' Introns in zwei bis vier Exons unterteilt. Von der Untereinheit HtH2 wurde über cDNA und genomische PCR die vollständige kodierende Sequenz der funktionellen Domänen HtH2-b bis HtH2-h und ein großer Teil von HtH2-a sequenziert. Die partielle Primärstruktur umfaßt 3307 Aminosäuren. Es fehlen noch etwa 100 Aminosäuren aus dem N-terminalen Bereich von HtH2-a. Das Fragment des HtH2-Gens von 18,3 kb besteht aus 15 Exons und 14 Introns. Die Exon-Größen und die Positionen sowie Phasen der Introns entsprechen exakt den Verhältnissen im HtH1-Gen. Multiple Sequenzalignments und daraus erstellte phylogenetische Stammbäume mit den abgeleiteten Aminosäuresequenzen von HtH1, HtH2 und anderen Mollusken-Hämocyaninen zeigen die Verwandtschaftsverhältnisse der Mollusken-Hämocyanine. Auf der Annahme basierend, daß eine 'molekulare Uhr' existiert, läßt sich mit Hilfe einer Distanzmatrix die Phylogenie der Mollusken-Hämocyanine rekapitulieren und die einzelnen Aufspaltungsereignisse im Verlauf der Evolution der Mollusken datieren.

Die molekulare Evolution der Hämoglobin-Genfamilie in Chironomus tentans

Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden 74736 bp genomischer DNA-Sequenzder Hämoglobingen-Gruppe D aus der Chironomiden Art Chironomus tentansentschlüsselt und analysiert. Durch Datenbankrecherchen undSequenz-Vergleiche wurden 29 vollständige Hämoglobin-Geneidentifiziert und klassifiziert. Es zeigt sich, daß alle derzeitbekannten Hämoglobin-Gene der Chironomiden auch in Chironomus tentansvorhanden sind. Zusätzlich konnten in Chironomus tentans sechs neueHämoglobin-Varianten identifiziert werden, die bislang weder aufProtein- noch auf Gen-Ebene in anderen Spezies nachgewiesenwurden. Die Hämoglobin-Gene liegen in dichter Abfolge innerhalbdes Clusters, wobei durchschnittlich etwa alle 2 kb ein Gen zufinden ist. Die Abfolge der Hämoglobin-Gene innerhalb derGengruppe wird nur an einer Stelle durch ein interspergiertes Genaus der Familie der Glukosetransporter unterbrochen. Desweiterenkonnten zwei retrotransponierbare Elemente der SINE-Klasse (CP1)innerhalb des Hämoglobingen-Clusters identifiziert werden. AlleGene besitzen die für ihre Expression erforderlichenSignalsequenzen, so daß es sich höchstwahrscheinlich um aktiveGene handelt. Die abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen weisen alleCharakteristika sauerstofftransportierender Moleküle auf. Da es sich bei den Hämoglobinen um eine sehr alte Genfamiliehandelt, kann die vergleichende Analyse derHämoglobin-Genstruktur bei Vertebraten, Invertebraten, Pflanzenund Protozoen zur Rekonstruktion der Intron-Evolution genutztwerden. Die Konservierung von Intronpositionen in homologen Genenverschiedener Taxa gilt dabei als Maß für das relativestammesgeschichtliche Alter der Introns. Eine Vielzahl derHämoglobin-Gene von Invertebraten weisen ein Intron im zentralenGenbereich auf. Auch bei einigen Chironomiden-Arten konntendiese 'zentralen Introns' nachgewiesen werden. DieHämoglobin-Gene von Chironomus tentans galten hingegen bislang als intronlos.Die vorliegende Untersuchung zeigt, daß auch zweiHämoglobin-Gene dieser Spezies je ein kurzes Intron aufweisen.Der Vergleich der Intronverteilung in den Hämoglobin-Genen derChironomiden führt zu dem Ergebnis, daß alle vorhandenen Intronsam sparsamsten (im Sinne des 'maximum parsimony'-Prinzips) durchunabhängige Insertionen in ein intronlosesVorläufer-Hämoglobin-Gen erklärt werden können. Alle bislangin Chironomiden beschriebenen Introns sind mit großerWahrscheinlichkeit nicht ortholog (Hankeln et al., 1997; dieseArbeit). Das Vorläufer-Hämoglobin-Gen in Chironomiden besaßdaher vermutlich kein 'zentrales Intron'. Die in Chironomidengefundenen Verhältnisse stellen somit die von Go (1981)formulierte Hypothese der Ursprünglichkeit des 'zentralenIntrons' in Hämoglobin-Genen in Frage. Die in Invertebraten undPflanzen beschriebenen 'zentralen Introns' sind vermutlich nichthomolog und dementsprechend auch nicht auf ein Intron imanzestralen Globin zurückzuführen. Vielmehr implizieren die inhohem Maße variablen Positionen der 'zentralen Introns' beiPflanzen und Invertebraten ihre unabhängige Insertion in diejeweiligen Globin-Gene nach der Aufspaltung der Taxa. Grundsätzlich können zwei Klassen von Hämoglobin-Genen inChironomiden unterschieden werden. Die überwiegende Mehrzahl derHämoglobine wird von Genen kodiert, die nur in einer Kopie imGenom vorliegen. Sie werden dementsprechend als 'single copy'Varianten bezeichnet. Für andere Hämoglobin-Varianten konntehingegen eine Vielzahl leicht unterschiedlicher Gene beschriebenwerden. Diese bilden sogenannte Gen-Subfamilien. In Chironomus tentans konntegezeigt werden, daß neben den 7B-Genen auch die 7A-Gene eineeigene Subfamilie bilden. Die 'single copy' Varianten zeichnensich im Interspezies-Vergleich durch ihre konservierteNukleotid-Sequenz aus: Sie unterliegen während ihrer Evolutionoffenbar einer stabilisierenden Selektion, d.h. Veränderungenihrer Protein-Sequenzen werden nur in geringem Maße toleriert.Auch ihre räumliche Anordnung innerhalb der Gengruppe istzwischenartlich konserviert. Der Vergleich der 'single copy'Varianten innerhalb einer Art zeigt, daß diese sehr deutlicheSequenz-Unterschiede zueinander aufweisen. Sie bilden somit einkonserviertes Sortiment an Hämoglobin-Genen, das weitgehend vorder Radiation der Arten entstanden ist und eine über dieArtgrenzen hinweg unveränderte 'Hämoglobin-Grundausstattung'gewährleistet. Im Gegensatz hierzu zeichnen sich die Mitglieder vonHämoglobin-Gen-Sub-familien durch eine hohe Variabilität aus:Nukleotid-Sequenz, Anzahl und Organisation der Gene innerhalb derGenfamilie weisen im zwischenartlichen Vergleich zahlreicheUnterschiede auf. Es ist daher nur selten möglich allein aufGrundlage der Nukleotid-Sequenzen orthologe Genpaare zuidentifizieren. Die orthologen Gene der 7B-Subfamilie aus Chironomus tentansund chth konnten ausschließlich anhand korrespondierenderIntergen-Sequenzen einander zugeordnet werden. Somit sind dieGen-Subfamilien präferenziell an der Entstehung einesspeziesspezifischen Gen-Repertoires beteiligt. Variationen derNukleotid-Sequenz, Gen-Anzahl und Gen-Organisation innerhalb derSubfamilie werden im Gegensatz zu den 'single copy' Varianten ineinem hohen Maße toleriert. Aufgrund der hohen Sequenz-Übereinstimmungen zwischen denMitgliedern der Gen-Subfamilien unterliegen diese einer Vielzahlvon Rearrangements, die in Gen-Duplikationen, Deletionen undSequenz-Homogenisierungen resultieren. So führten beispielsweiseGenduplikationen durch ungleiches, homologes Crossing-over mitgroßer Wahrscheinlichkeit zur Entstehung und Expansion der7A-Subfamilie. Auch die Gene Cte12-1 und Cte 12-2 sind vermutlichdas Ergebnis eines rezenten Duplika-tions-Ereignisses. DerMechanismus der Retrotransposition, der zu einer Duplika-tioneines 3`-untranslatierten Bereichs innerhalb der 7A-Subfamilieführte, scheint für die Entstehung derHämoglobin-Multiplizität in Chironomiden hingegen wenigerbedeutsam zu sein. Innerhalb der 7A-Subfamilie ist eineAngleichung der Gene durch konzertierte Sequenz-Evolution zubeobachten. Der nukleotidweise Vergleich von Gen-Sequenzen zeigtam Beispiel der Gene 7A7 und 7A8, daß die konzertierte Evolutiondieser Gen-Varianten auf dem Mechanismus der Genkonversionberuht. Auch die Gen-Subfamilie 7B unterliegt offenbar in hohemMaße einer solchen Sequenz-Homogenisierung. Im Sinne einer molekularen Uhr sollten synonyme Basenaustauscheweitgehend neutral sein und sich proportional zur Zeit in denGenen anhäufen. Der Vergleich der Hämoglobin-Gen-Sequenzenzeigt, daß große Unterschiede in der Anzahl der synonymenBasenaustausche zwischen orthologen Genen nicht zwangsläufig dasErgebnis einer frühen Trennung dieser Gene sind. Die Übertragungvon Sequenzen zwischen paralogen Genen kann die Anzahl dersynonymen Basenaustausche orthologer Gene in kürzester Zeitverändern und den tatsächlichen Zeitpunkt der Trennung zweierorthologen Gene überdecken. Werden Genkonversionen nichterkannt, weil beispielsweise nicht alle Gene der Gruppevollständig erfaßt werden konnten, führt der Vergleichorthologer Gen-Sequenzen zwangsläufig zu falschen evolutionärenGendistanzen. Da die Mitglieder der Hämoglobin-Genfamiliebesonders häufig Rekombinations-Prozessen unterliegen, sind siedaher möglicherweise weniger nützliche Kanditaten für dieErmittlung evolutionärer Distanzen zwischen den verschiedenenChironomiden-Arten. Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, daß anhanddetaillierter phylogenetischer Analysen sich die Evolution derHämoglobin-Multigenfamilie von Chironomiden umfassendbeschreiben läßt. Ob einzelne, besonders gut konservierteGen-Varianten (wie z. B. die Gene Cte 8 und Cte W) einespezifische physiologische Funktion erfüllen oder ob dieGen-Subfamilien, die ein speziesspezifisches Genrepertoirebilden, an der Einnischung der verschiedenen Arten beteiligtsind, sollte durch weiterführende Untersuchungen (z. B. derGenexpression sowie der physiologischen Eigenschaften einzelnerVarianten) ermittelt werden können.

Klonierung, Charakterisierung und Funktion der beiden SAPK-Mitglieder JNK und p38 MAPK des marinen Schwamms S. domuncula

Zusammenfassung der Dissertation von Markus Böhm 'Klonierung, Sequenzierung und Funktion der beiden SAPK-Mitglieder JNK und p38 MAPK des marinen Schwamms S. domuncula' am Fachbereich Biologie der Johannes Gutenberg-Universität Mainz: Da Schwämme zu den einfachsten Metazoen gehören, eignen sie sich gut zur Erforschung von Signaltransduktionsprozessen. Die SAPKs stellen hoch konservierte Signalmoleküle dar, die durch viele Zellstress-auslösende Faktoren aktiviert werden und in zahlreichen biologischen Prozessen involviert sind.Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei SAPK-Gene aus S. domuncula isoliert. Ihre abgeleiteten Aminosäuresequenzen wiesen die höchsten Homologien zu den Mitgliedern der SAPK1/JNK- und SAPK2/p38 MAPK-Subfamilie der Metazoen auf. Die geringste Übereinstimmung existierte gegenüber der einzigen SAPK der Hefe (HOG1). Beide Gene des Schwamms besaßen zudem eine außerordentlich hohe Übereinstimmung hinsichtlich ihrer Exon/Intron-Strukturen. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass die SAPKs der multizellulären Tiere durch Duplikation eines HOG1-verwandten Vorläufergens entstanden sind. Durch den Vergleich der Intronpositionen mit denen von SAPK-Genen aus D. melanogaster, C. elegans und H. sapiens wurde ersichtlich, dass die Positionen der nichtkodierenden Sequenzbereiche dieser Gene hoch konserviert sind. Western Blot-Analysen demonstrierten, dass beide Schwamm-Kinasen durch hyperosmotischen Stress, LPS und den Phosphataseinhibitor Okadainsäure aktiviert werden. Außerdem wurde durch Versuche mit HOG1-defizienten Hefemutanten gezeigt, dass sie die Funktion des HOG1-Proteins in S. cerevisiae vollständig übernehmen können. Da die aktivierten Kinasen des Schwamms wie HOG1 im Nukleus der Hefezellen akkumuliert werden, müssen die Kerntransportmechanismen der SAPKs ebenfalls evolutionär erhalten sein.

Identifizierung und Charakterisierung T-zellerkannter Tumorantigene im Melanommodell MZ7

Die Kenntnis immunogener Tumorantigene ist Grundlage für die rationale Entwicklung immunologisch orientierter Therapieverfahren. In der vorliegenden Arbeit wurden im autologen Melanommodell MZ7 drei neue T-zellerkannte Tumorantigene vorgestellt. Während nahezu alle bisher beschriebenen Tumorantigene mit Hilfe von T-Zellklonen (CTL) entdeckt wurden, die aus tumorreaktiven MLTCs (gemischte Lymphozyten/Tumor-Zellkulturen) generiert worden waren, wurde in dieser Arbeit versucht, wenige Wochen stimulierte MLTCs direkt zur Antigensuche zu verwenden. Als sensitives Nachweissystem wurde der IFNg-ELISPOT-Assay eingesetzt. Die Motivation dazu waren einerseits praktische Erwägungen, da CTL-Klonierungen material- und zeitaufwendig sind. Andererseits wurde vermutet, dass die Etablierung von CTL-Klonen in Langzeitkultur neben Zufallsprozessen auch Selektionsprozessen unterliegt, die CTL mit bestimmten Eigenschaften favorisieren. Eventuell eröffnete sich durch den Einsatz der MLTCs die Möglichkeit, Antigene zu entdecken, die mit Hilfe permanent kultivierter CTL aus den MLTCs nicht gefunden würden.Um beispielsweise Schwankungen im Proliferationsverhalten und in Effektorfunktionen permanent kultivierter T-Zellen zu umgehen, wurden für die Versuche in dieser Arbeit in Portionen eingefrorene T-Zellen verwendet, die zuvor zu ausreichender Menge expandiert worden waren. Es ließ sich zeigen, dass durch die Kryokonservierung der T-Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt nach einer Restimulation mit den Tumorzellen der Aktivierungszustand der T-Zellen konserviert wurde, und dass die T-Zellen nach dem Auftauen in ELISPOT-Assays ohne wesentliche Einbußen spezifisch auf einen erneuten Antigenkontakt reagierten. Bei der Testung von mehreren, unabhängig generierten MLTCs gegen bekannte Tumorantigene wurden T-Zellantworten gegen gp100/HLA-B7.2, Tyrosinase/HLA-A26.1, SIRT2P182L/HLA-A3.1 und, deutlich stärker, gegen die Melanomzelllinie festgestellt. Nachfolgend wurde mit Hilfe bereits etablierter CTL-Klone die peptidkodierende Region von gp100 über die Transfektion von gp100-Fragmenten in COS-7-Zellen eingegrenzt und anschließend ein synthetisches Peptid identifiziert, das von den CTL-Klonen erkannt wurde. Das zweite identifizierte Tumorantigen, Tyrosinase/HLA-A26.1, wurde nur in einer von sechs neu generierten, unabhängigen MLTCs entdeckt. Da keine Tyrosinase/HLA-A26.1-reaktiven CTL-Klone zur Verfügung standen, wurden die zur Eingrenzung der peptidkodierenden Region transfizierten COS-7-Zellen mit der MLTC selbst getestet. Anschließend wurde ein synthetisches Peptid identifiziert, das von der MLTC erkannt wurde.Die Reaktivität der MLTCs gegen die Melanomzelllinie war bei weitem nicht durch die bis dahin gefundenen T-Zellantworten erklärbar. Daher wurde mit einer der MLTCs versucht, durch cDNA-Expressionsklonierung ein neues Antigen in der cDNA-Bank aus dem MZ7-Melanom zu identifizieren. Die Reaktivität der MLTC gegen den Tumor war hauptsächlich durch einen Antikörper gegen HLA-A3 blockierbar. Daher wurde HLA-A*03011-cDNA für das „Screening“ kotransfiziert. Das Verfahren führte zur Identifizierung eines weiteren punktmutierten Tumorantigens: GPNMBG181D (GPNMBmutiert). Die Mutation führte dazu, dass ein Teil eines ungespleißten Introns Bestandteil der im Tumor entdeckten cDNA war. Ein aus der Exon/Intron-Region kodiertes synthetisches Peptid mit der ausgetauschten Aminosäure wurde von der MLTC deutlich erkannt. Durch RT-PCR-Analysen wurde im MZ7-Melanom, in fast allen getesteten weiteren Melanomen sowie in einem Teil der überprüften Nierenzellkarzinome eine Variante der GPNMB-cDNA entdeckt, in der ebenfalls das erwähnte Intron enthalten war, ohne dass die Mutation vorlag (GPNMB/INT4). Diese Spleißvariante wurde nicht in EBV-B-Zelllinien und anderen Tumorzelllinien gefunden. Zusätzlich zu dem bereits zuvor charakterisierten Tumorantigen SIRT2P182L wurden drei weitere T-zellerkannte Antigene im Melanommodell MZ7 identifiziert. T-Zellreaktivität gegen das Antigen GPNMBG181D entwickelte sich, im Gegensatz zu den anderen Antigenen, in allen getesteten MLTCs. Dies spricht für eine immunologische Dominanz des Antigens im Melanommodell MZ7. Die Tatsache, dass das „stärkste“ Antigen mit Hilfe einer MLTC identifiziert wurde, bietet die Aussicht, evtl. weitere dominante Antigene mit dem Verfahren identifizieren zu können. Die Verwendung von kurzzeitstimulierten MLTCs anstelle von permanent kultivierten CTL-Klonen stellt einen ersten Schritt auf dem Weg zur Beschleunigung der Suche nach Tumorantigenen dar. Die Verfahrensbeschleunigung ist die Voraussetzung dafür, in Zukunft Antigene nicht nur in archivierten Modellen zu suchen, sondern in Patienten zu einem frühen Zeitpunkt der malignen Erkrankung. Dann bestünde die Chance, dass die Kenntnis individueller Tumorantigene in immuntherapeutische Konzepte eingeht.

Das Hämocyanin zweier lebender Fossilien: Nautilus pompilius und Nucula nucleus

Als erste vollständige cDNA-Sequenz eines Muschel-Hämocyanins wurde das Nucula nucleus-Hämocyanin (NnH) sequenziert. Es besteht aus den beiden Isoformen NnH1 und NnH2, die eine Identität von etwa 61 % aufweisen. Beide sind aus acht funktionellen Domänen a-h aufgebaut, von denen die C-terminale Domäne h jeweils eine Extension von etwa 100 Aminosäuren besitzt. Auf Sequenzebene weist das Muschel-Hämocyanin eine eigentümliche Deletion im Bereich der ersten Kupferbindungsstelle und eine auffällig niedrige Anzahl an potentiellen N-Glykosylierungsstellen auf. Genomische Teilsequenzen bestätigen die Konservierung der Linkerintrons in Phase und Position, was bei den internen Introns nicht zu erkennen ist. Letztere konnten in den für die Domänen NnH1-d, NnH1-e und NnH2-c codierenden Genabschnitten nachgewiesen werden. Einen neuen Aspekt lieferte das interne Intron in NnH2-c, da es nur in einer der beiden Isoformen vorkommt. Das zweite sequenzierte Hämocyanin stammt von dem „lebenden Fossil“ Nautilus pompilius (NpH). Es wurde sowohl auf cDNA- als auch auf genomischer Ebene vollständig sequenziert und besteht aus sieben funktionellen Domänen, wobei die C-terminale Domäne h fehlt. Zu seinen Eigentümlichkeiten gehört neben 13 potentiellen N-Glykosylierungsstellen, von denen sich zwei innerhalb von Linkerregionen befinden, eine Deletion im Bereich der ersten Kupferbindungsstelle von NpH-g. Neben den konservierten Linkerintrons liegt ein Intron innerhalb des Signalpeptids sowie in den Genabschnitten für NpH-a und NpH-g. Dagegen ist weder zwischen dem Signalpeptid und NpH-a noch innerhalb der 3’UTR ein Intron vorhanden. Anhand der neuen Sequenzdaten wurde eine phylogenetische Analyse durchgeführt, in der sich die funktionellen Domänen von NnH als Schwestergruppe zu den korrespondierenden Domänen der Gastropoden anordnen. Den Erwartungen entsprechend stellt sich NpH basal innerhalb der Klasse der Cephalopoden. Phylogenetische Analysen mit der vollständigen Hämocyanin-Sequenz lösen die Verwandtschaftsverhältnisse der Klassen zueinander nicht auf, was auf schnelle Radiation schließen lässt. Die Gruppierungen innerhalb der Klassen werden dagegen sehr gut unterstützt. Mittels einer Distanzmatrix wurde eine molekulare Uhr berechnet, für deren Eichpunkt die Cephalopoden-Gastropoden-Aufspaltung vor 520 Millionen Jahren gewählt wurde. Die Entstehung der Acht-Domänen-Untereinheit fand danach vor 732 (± 33) Millionen Jahren statt. Die Trennung der Gastropoda und Protobranchia erfolgte vor 494 (± 50) Millionen Jahren, was mit Fossilfunden der Nuculidae aus dem Ordovicium übereinstimmt. Vor 396 (± 55) Millionen Jahren gingen aus einer Genduplikation die beiden Isoformen des Nucula nucleus-Hämocyanins hervor. Innerhalb der Cephalopoden wurde die Trennung zwischen Nautiloidea und Coleoidea auf 415 (± 24) Millionen Jahre zurückdatiert. Nach Fossildaten liegt der Trennungszeitraum der beiden Gruppen 470 - 400 Millionen Jahre zurück, was gut zu den Hämocyanin-Daten passt.

Differentielle Expression und molekulare Evolution von Mollusken-Hämocyanin

Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen an den zwei Gastropoden-Arten Haliotis tuberculata und Haliotis asinina zeigten, dass diese jeweils zwei unterscheidbare Hämocyanin-Isoformen (HtH1/HaH1 und HtH2/HaH2) besitzen, die in unterschiedlichen Mengen in der Hämolymphe vorkommen. In situ-Hybridisierungsversuche an H. asinina ergaben, dass die beiden Hämocyanin-Isoformen sowohl entwicklungsspezifisch als auch gewebsspezifisch exprimiert werden. Die Transkription der Hämocyanin-Gene setzt bereits 9 Stunden nach der Befruchtung ein und ist von diesem Zeitpunkt an in allen Stadien der Larvalentwicklung nachweisbar. Während dieser Entwicklungsphase sind die Expressionsmuster der beiden Isoformen weitgehend überlappend, wohingegen in adulten Tieren in verschiedenen Geweben isoformspezifische Expressionsmuster auftreten. Diese Ergebnisse deuten auf funktionelle Unterschiede der beiden Hämocyanin-Isoformen hin, und somit darauf, dass Hämocyanin neben dem Transport von Sauerstoff noch weitere Funktionen ausüben könnte (Streit et al., 2005). Weiterhin wurden Untersuchungen zur Primär- und Sekundärstruktur der Hämocyanine aus H. tuberculata und zwei weiteren Arten (Megathura crenulata und Aplysia californica) durchgeführt. Von den Vetigastropoden M. crenulata und H. tuberculata konnten die für die beiden Hämocyanin-Isoformen kodierenden cDNA-Sequenzen vervollständigt werden. Von HtH1 und HtH2 wurden zudem die Gensequenzen komplettiert. Die Sequenzen des KLH1-Gens wurden bis auf 24 bp der 5’UTR und die für das Signalpeptid 1 kodierenden 33 bp ermittelt. Erstmals ist es gelungen, Promotorsequenzen von Mollusken-Hämocyanin-Genen zu sequenzieren. Für HtH2 wurden 181 bp und für KLH2 906 bp des Promotors analysiert. Beide Gensequenzen weisen das konservierte Sequenzmotiv der TATA-Box auf. Wie bei H. tuberculata treten auch bei M. crenulata die beiden Isoformen in unterschiedlichen Mengenverhältnissen in der Hämolymphe auf. In den bisher analysierten Sequenzen dieser beiden Gastropoden konnten keine regulatorischen Elemente identifiziert werden, welche die differentielle Expression bedingen könnten. Die Genstruktur des Hämocyanins von A. californica konnte ebenfalls aufgeklärt werden. Die kodierenden Bereiche des AcH-Gens werden durch insgesamt 45 interne Introns fragmentiert. Im Gen liegen neun Insertionspositionen vor, in denen paraloge Introns inserieren. Zudem sind neun Introns ortholog zu internen Introns anderer Mollusken-Hämocyanin-Gene. Im Fall der paralogen und orthologen Introns handelt es sich um sehr ursprüngliche Introns, die bereits vor der Radiation der Mollusken inserierten. Damit widerlegen diese Ergebnisse die bisherige Annahme („Intron late”-Hypothese), der zufolge die Insertion interner Introns erst nach der Trennung der Gastropoden und Cephalopoden eingesetzt haben soll. Im Zuge dieser Sequenzanalysen ergaben sich zudem Hinweise auf die Existenz einer weiteren AcH-Isoform, da 13 Fragmente ermittelt wurden, die in den kodierenden Bereichen Sequenzunterschiede von bis zu 20% zu AcH 1 aufweisen. Die detaillierten Studien der Haliotis-Hämocyanine deckten einen weitreichenden phylogenetischen Informationsgehalt der Hämocyanin-Sequenzen auf. In weiterführenden Analysen wurden Teilsequenzen der Hämocyanin-Gene von 12 verschiedenen Haliotis-Arten amplifiziert. Der daraus rekonstruierte Stammbaum liefert entsprechend spezifischer Indels eine deutliche Auftrennung der Haliotidae in eine nordpazifische und eine europäischaustralasische Abstammungslinie. Anhand dieser Analyse lassen sich der phylogeographische Ursprung der Haliotiden aufzeigen (Streit et al., 2006) und deren Wanderungsbewegungen nachvollziehen. Hämocyanin-Daten wurden des Weiteren für phylogenetische Analysen auf höherem taxonomischem Niveau eingesetzt. Innerhalb der Klasse der Polyplacophoren wurden interfamiliäre Verwandtschaftsverhältnisse rekonstruiert. Für diese Analyse wurden Teilsequenzen der Hämocyanin-Gene 17 unterschiedlicher Arten ermittelt. Die phylogenetische Untersuchung zeigt, dass sich die Polyplacophoren eindeutig in die beiden Ordnungen der Lepidopleurida und Chitonida auftrennen, da die Chitonida eine spezifische „Deletion” aufweisen. Anhand dieses Merkmals kann auch Callochiton bouveti, der diese „Deletion” besitzt und dessen phylogenetische Einordnung bisweilen umstritten war, eindeutig den Chitonida zugeordnet werden. Innerhalb der Chitonida bilden sowohl die Chitonina als auch die Acanthochitonina monophyletische Gruppen.