Resistance to last-resort antibiotics in natural environments

Last-resort antibiotics are the final line of action for treating serious infections caused by multiresistant strains. Over the years the prevalence of resistant bacteria has been increasing. Natural environments are reservoirs of antibiotic resistance, highly influenced by human-driven activities. The importance of aquatic systems on the evolution of antibiotic resistance is highlighted from the assumption that clinically-relevant resistance genes have originated in strains ubiquitous in these environments. We hypothesize that: a) rivers are reservoirs and disseminators of antibiotic resistance; b) anthropogenic activities potentiate dissemination of resistance to last-resort antibiotics. Hence, the main goal of the work is to compare the last-resort antibiotics resistome, in polluted and unpolluted water. Rivers from the Vouga basin, exposed to different anthropogenic impacts, were sampled. Water quality parameters were determined to classify rivers as unpolluted or polluted. Two bacterial collections were established enclosing bacteria resistant to cefotaxime (3rd generation cephalosporin) and to imipenem (carbapenem). Each collection was characterized regarding: phylogenetic diversity, antibiotic susceptibility, resistance mechanisms and mobile genetic elements. The prevalence of cefotaxime- and imipenem-resistant bacteria was higher in polluted water. Results suggested an important role in the dissemination of antibiotic resistance for Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Aeromonas. The occurrence of bacteria resistant to non-beta-lactams was higher among isolates from polluted water as also the number of multiresistant strains. Among strains resistant to cefotaxime, extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) genes were detected (predominantly blaCTX-M-like) associated to mobile genetic elements previously described in clinical strains. ESBL-producers were often multiresistant as a result of co-selection mechanisms. Culture-independent methods showed clear differences between blaCTX-M-like sequences found in unpolluted water (similar to ancestral genes) and polluted water (sequences identical to those reported in clinical settings). Carbapenem resistance was mostly related to the presence of intrinsically resistant bacteria. Yet, relevant carbapenemase genes were detected as blaOXA-48-like in Shewanella spp. (the putative origin of these genes), and blaVIM-2 in Pseudomonas spp. isolated from polluted rivers. Culture-independent methods showed an higher than the previously reported diversity of blaOXA-48-like genes in rivers. Overall, clear differences between polluted and unpolluted systems were observed, regarding prevalence, phylogenetic diversity and susceptibility profiles of resistant bacteria and occurrence of clinically relevant antibiotic resistance genes, thus validating our hypotheses. In this way, rivers act as disseminators of resistance genes, and anthropogenic activities potentiate horizontal gene transfer and promote the constitution of genetic platforms that combine several resistance determinants, leading to multiresistance phenotypes that may persist even in the absence of antibiotics.

Micro/nanoreservoirs for controlled release of active species in smart functional coatings

This work reports one possible way to develop new functional coatings used to increase the life time of metallic structures. The functionalities selected and attributed to model coatings in the frame of this work were corrosion protection, self-sensing and prevention of fouling (antifouling). The way used to confer those functionalities to coatings was based on the encapsulation of active compounds (corrosion inhibitors, pH indicators and biocides) in micro and nanocontainers followed by their incorporation into the coating matrices. To confer active corrosion protection, one corrosion inhibitor (2-mercaptobenzothiazole, MBT) was encapsulated in two different containers, firstly in silica nanocapsules (SiNC) and in polyurea microcapsules (PU-MC). The incorporation of both containers in different models coatings shows a significant improvement in the corrosion protection of aluminum alloy 2024 (AA2024). Following the same approach, SiNC and PU-MC were also used for the encapsulation of phenolphthalein (one well known pH indicator) to introduce sensing properties in polymeric coatings. SiNC and PU-MC containing phenolphthalein acted as corrosion sensor, showing a pink coloration due to the beginning of cathodic reaction, resulting in a pH increase identified by those capsules. Their sensing performance was proved in suspension and when integrated in coatings for aluminium alloy 2024 and magnesium alloy AZ31. In a similar way, the biocide activity (antifouling) was assigned to two polymeric matrices using SiNC for encapsulation of one biocide (Dichloro-2-octyl-2H-isothiazol-3-one, DCOIT) and also SiNC-MBT was tested as biocide. The antifouling activity of those two encapsulated compounds was assessed through inhibition and consequent decrease in the bioluminescence of modified E. coli. That effect was verified in suspension and when incorporated in coatings for AISI 1008 carbon steel. The developed micro and nanocontainers presented the desired performance, allowing the introduction of new functionalities to model coatings, showing potential to be used as functional additives in the next generation of multifunctional coatings.

Plano de segurança da água: caso de estudo: sistema de abastecimento público de água de Castro Verde

A maneira mais eficaz de garantir uma água distribuída, ao consumidor, em segurança é através de uma boa avaliação e gestão de riscos, envolvendo todo o sistema de abastecimento de água (captação, tratamento e distribuição). O presente estudo teve como objectivos caracterizar os riscos associados aos perigos encontrados e avalia-los através de uma metodologia de priorização de riscos, propor novas medidas de controlo para os perigos encontrados, estabelecer limites de controlo relacionados com as medidas de controlo e propor uma monitorização ao longo de todo o sistema de abastecimento de água. Este estudo foi efectuado no sistema de abastecimento público de água de Castro Verde. A principal metodologia foi a priorização de riscos. Foram classificados vários riscos com diferentes classificações associados aos perigos encontrados, encontrando-se dez pontos de controlo críticos. Uma vez que a monitorização neste sistema é insuficiente em alguns pontos tornou-se necessário propor novos locais sendo eles no local de preparação de reagentes, antes e depois da filtração e em todos os reservatórios de água tratada. Os perigos do sistema podem ser reduzidos ou eliminados através de uma boa e adequada gestão de riscos.

Desempenho da flotação por ar dissolvido na remoção de cianobactérias de diferentes morfologias

A presença de cianobactérias em reservatórios utilizados para produção de água para consumo humano representa um elevado risco para a saúde pública. Estes organismos contribuem para a redução da qualidade da água e têm a capacidade de produzir cianotoxinas que podem afectar a saúde humana e animal. Existem casos em todo o mundo de intoxicação letal de diversos animais por consumo de água de lagos contaminados com cianobactérias, e mesmo casos de morte de humanos, atribuídas à exposição de cianotoxinas. De modo a fazer face a este crescente problema é necessário desenvolver e implementar tecnologias de tratamento de água nas ETA que permitam fazer face a uma florescência de cianobactérias num reservatório de água destinado ao abastecimento humano. Neste trabalho avaliou-se a capacidade do processo C/F/DAF na remoção cianobactérias de diferentes morfologias, células e colónias de M. aeruginosa e filamentos de P. rubescens, em águas sintéticas hidrofóbicas e hidrofílicas, com concentração de DOC moderada e moderada/elevada. Assim como da sequência C/F/DAF→NF na remoção de células e de toxinas de cianobactérias. A remoção de NOM e o seu efeito na remoção de cianobactérias foram também avaliados. Concluiu-se que o processo C/F/DAF é eficiente na remoção de cianobactérias de diferentes morfologias, com remoções entre 78 e 100% de MC intra. No entanto, a morfologia que apresentou remoções mais elevadas foram os filamentos, enquanto as colónias apresentaram valores mais baixos. Globalmente, verificou-se que o aumento da concentração de NOM facilita a remoção de cianobactérias, sendo que as águas hidrofóbicas apresentaram-se mais fáceis de tratar por C/F/DAF. Por sua vez, o tratamento C/F/DAF→NF, é uma opção eficiente para fazer face a um eventual bloom de cianobactérias em ETA, uma vez que a remoção de cianobactérias (em MC intra e chl_a) foi de 100% e a remoção de microcistina extracelular de 95%, aproximadamente.

Cytogenetic and histological studies of the brook trout (Salvelinus fontinalis) x arctic charr (Salvelinus alpinus) hybrids

In aquaculture, application of fish hybrids has increased. This technique permits improvement of the fish production by providing specimens showing better growth rate when compared to the parental species. Indeed, sterile individuals are highly demanded because quite frequently parental fish mature before they reach the market size, which impairs their growth and decrease their economic value. Throughout the last years, the commercial and scientific interest in salmonids has increased rapidly, among them, the brook trout (Salvelinus fontinalis), Arctic charr (Salvelinus alpinus) are species that can be crossed to produce hybrids that might by cultured in the fish farms. In the present thesis, we have assessed chromosome numbers and evaluate gonadal sex in the brook trout X Arctic charr hybrid progenies. In our populations, the karyotype of the brook trout comprises 84 chromosomes: 16 bi-armed chromosomes (meta-submetacentric) and 68 one-armed chromosomes (telo-acrocentrics) and the chromosome arm number, NF= 100. Arctic charr karyotype shows variation related to the chromosome number (2n= 81-82) and stable chromosome arm number (NF= 100). 2n= 81 chromosomes consisted of 19 bi-armed and 62 one-armed chromosomes, while 2n= 82 karyotype was organized into 18 meta-submetacentric and 64 acrocentrics. The cytogenetic and histological analysis of the brook trout X Arctic charr hybrids (sparctics) was carried out to asses chromosome and chromosome arm number and gonadal sex of the studied specimens. Diploid chromosome number in the hybrids varied from 81 to 84 and individuals with 83 and 84 chromosomes were predominant. Most of the fish had chromosome arm number equal to 100. Robertsonian fusion in the Arctic charr and chromosome behaviour in the hybrid fish cells might lead to the observed variation in chromosome numbers in the hybrids. Among studied fish, 12 were males, 3 were females and 9 had intersex gonads. No correlation between chromosome number and disturbances in the gonadal development was found. This might suggest that intersex gonads might have been developed as a consequence of disturbances in the genetic sex determination process. Genetic sex determination acts properly in the parental species but in the hybrids this may not be as efficient.

Comparing Zostera and Spartina environments in relation to carbon burial: a sedimentary and geochemical approach from Ria Formosa

Dissertação de mestrado, Biologia Marinha, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

Accessing Planktothrix species diversity and associated toxins using quantitative real-time PCR in natural waters

Tese de Doutoramento em Biologia apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, 2015.

Avaliação da infecção de megacariócitos e plaquetas pelo VHC e sua influência na fisiopatologia da hepatite C

Pós-graduação em Pesquisa e Desenvolvimento (Biotecnologia Médica) - FMB

Lubrificação de compressores que aspiram fluido frigorigéneo a temperaturas inferiores a -30° C

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Mecânica

Caracterização molecular da resistência a antimicrobianos em Escherichia coli produtoras de β-lactamases de espectro alargado isoladas em cães e estudo da partilha de clones bacterianos entre animais de companhia e coabitantes humanos

A pressão seletiva originada pelo uso excessivo de antimicrobianos na medicina humana e veterinária tem contribuído para a emergência de estirpes bacterianas multirresistentes, sendo os estudos mais escassos relativamente à sua presença nos animais de companhia. Porque os animais e os seus proprietários partilham o mesmo espaço habitacional, apresentando comportamentos de contacto próximo, existe uma hipótese elevada de transferência microbiana inter-espécie. Ante esta possibilidade é importante escrutinar o papel dos animais de companhia enquanto reservatórios de estirpes e de genes de resistência, bem como a sua envolvência na disseminação de estirpes bacterianas multirresistentes. Importa também, investigar o papel das superfícies e objetos domésticos partilhados por ambos, como potenciadores deste fenómeno. O objetivo deste trabalho foi, identificar o filogrupo e fazer a caracterização molecular dos genes que conferem resistência aos β-lactâmicos e às quinolonas, em quarenta isolados de Escherichia coli produtoras de β-lactamases de espectro alargado (ESBL), obtidas em zaragatoas fecais de cães consultados no Hospital Veterinário do ICBAS-UP. Complementarmente pretendeu-se inferir sobre a partilha de clones de Escherichia coli e Enterococcus spp. com elevadas resistências, em cinco agregados familiares (humanos e seus animais de companhia) assim como avaliar a potencial disseminação de estirpes multirresistentes no ambiente doméstico. Previamente foram recolhidas zaragatoas de fezes, pelo e mucosa oral dos animais e em alguns casos, dos seus proprietários, e ainda do ambiente doméstico. As zaragatoas foram processadas e as estirpes isoladas com base em meios seletivos. Foram realizados testes de suscetibilidade antimicrobiana de modo a estabelecer o fenótipo de resistência de cada isolado. O DNA foi extraído por varias metodologias e técnicas de PCR foram utilizadas para caracterização de filogrupos (Escherichia coli) e identificação da espécie (Enterococcus spp.). A avaliação da proximidade filogenética entre isolados foi efetuada por ERIC PCR e PFGE. No conjunto de quarenta isolados produtores de ESBL e/ou resistentes a quinolonas verificou-se que 47,5% pertenciam ao filogrupo A, havendo uma menor prevalência do filogrupo D (25,0%), B1 (17,5%), e B2 (10,0%).A frequência de resistência nestes isolados é factualmente elevada, sendo reveladora de uma elevada pressão seletiva. Com exceção de dois isolados, os fenótipos foram justificados pela presença de β-lactamases. A frequência da presença de genes foi: 47% blaTEM, 34% blaSHV, 24% blaOXA , 18% blaCTX-M-15, 8% blaCTX-M-2, 3% blaCTX-M-9. Nos isolados resistentes às quinolonas verificou-se maioritariamente a presença de mutações nos genes cromossomais gyrA e parC, e em alguns casos a presença de um determinante de resistência mediado por plasmídeo – qnrS. Nos cinco “agregados familiares” (humanos e animais) estudados foi observada uma partilha frequente de clones de E. coli e Enterococcus faecalis com múltiplas resistências, isolados em fezes e mucosa oral de cães e gatos e fezes e mãos dos respetivos proprietários, evidenciando-se assim uma possível transferência direta entre coabitantes (agregados A, C, D, E). Ficou também comprovado com percentagens de similaridade genotípica superiores a 94% que essa disseminação também ocorre para o ambiente doméstico, envolvendo objetos dos animais e de uso comum (agregados A, E). Os resultados obtidos reforçam a necessidade de um uso prudente dos antimicrobianos, pois elevados padrões de resistências terão um impacto não só na qualidade de vida dos animais mas também na saúde humana. Adicionalmente importa sensibilizar os proprietários para a necessidade de uma maior vigilância relativamente às formas de interação com os animais, bem como para a adoção de medidas higiénicas cautelares após essa mesma interação.

Aproveitamento de águas pluviais para rega

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Civil na Área de Especialização de Hidráulica

Tratamento de água subterrânea contaminada por compostos orgânicos voláteis: considerações sobre o dimensionamento e simulação de colunas de arrastamento por ar

A água subterrânea representa cerca de 97% de água doce existente na terra. A sua global disponibilidade, aliada às suas qualidades naturais e à inexistência de fontes superficiais de abastecimento em largas áreas continentais, tem feito, ao longo dos tempos, com que a sua utilização, nomeadamente doméstica, tenha vindo a ser uma constante. No entanto, estes tipos de reservatórios subterrâneos - aquíferos - são de uma vulnerabilidade extrema no que se refere à contaminação por poluentes. Não só são facilmente contamináveis, como se tornam difícil e morosamente recuperáveis. As normas que definem a qualidade de determinada água impõem limitações específicas para os determinados usos (no nosso país vigora o Dec.Lei nº74/90 de 7 de Março).

PCR em tempo real para caracterização de fontes alimentares de flebotomíneos (Diptera: Psychodidae)

Os flebotomíneos são insetos hematófagos de grande importância médica e veterinária atuando como vetores de parasitas como Leishmania. O estudo do padrão alimentar desses vetores pode ajudar a compreender a sua interação com potenciais reservatórios de Leishmania. Neste estudo, desenvolvemos ensaios de PCR em tempo real para identificação de sangue em flebotomíneos. Seis pares de primers foram desenhados com base no gene citocromo b de sequencias disponíveis no GenBank dos seguintes hospedeiros potenciais: cão, gato, cavalo, galinha, rato e humano. Primeiramente, os ensaios de PCR em tempo real utilizando SYBR Green foram conduzidos usando uma curva padrão com oito concentrações diferentes (i.e., 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg e 1 fg por 2 µl) de amostras do DNA extraído do sangue com EDTA a partir de cada espécie de animal. Em seguida, o DNA foi extraído de 100 fêmeas de flebotomíneos ingurgitadas de campo pertencentes a três espécies (i.e., Lutzomyia longipalpis, L. migonei e L. lenti) foram testadas pelos protocolos aqui padronizados. Fêmeas de flebotomíneos foram experimentalmente alimentadas em um rato (Rattus rattus) e utilizadas para avaliar a detecção do ensaio. Os protocolos funcionaram de forma eficiente com limites de detecção de 10 pg a 100 fg. Fêmeas de flebotomíneos ingurgitadas coletadas no campo estavam alimentadas de humanos (73 por cento), galinhas (23 por cento), cães (22 por cento), cavalos (15 por cento), ratos (11 por cento) e gatos (2 por cento). Curiosamente, 76,1 por cento das fêmeas de L. longipalpis foram positivas para o sangue humano. No total, 48 por cento das fêmeas testadas estavam alimentadas em uma única fonte, 31 por cento em duas e 12 por cento em três. A análise do curso de tempo mostrou que a técnica de PCR em tempo real visando o DNA de roedor foi capaz de detectar pequenas quantidades de DNA do hospedeiro até 5 dias após o repasto sanguíneo. Esses protocolos representam ferramentas promissoras para a identificação da fonte alimentar de flebotomíneos de campo

Análise de critérios de outorga do uso da água na bacia do rio Santa Maria, RS

Este trabalho apresenta o desenvolvimento de uma metodologia para a avaliação de critérios de outorga do uso da água na bacia do rio Santa Maria. A escolha da bacia do rio Santa Maria se deve ao fato da existência de conflitos pelo uso da água, principalmente durante o verão, quando surge a demanda de água para o cultivo do arroz. A carência de dados hidrológicos, a existência de um grande número de pequenos reservatórios e a sazonalidade das demandas fazem da bacia do rio Santa Maria um caso interessante de ser estudado. É comentado o processo de evolução da outorga através das legislações, a situação atual em que se encontra a implementação deste instrumento, quais as tendências e fica estabelecida uma forma de comparação de diferentes critérios. A análise é feita de forma sistêmica (admitindo a bacia hidrográfica como unidade de planejamento) com o uso de modelos matemáticos de avaliação e gestão, particularmente modelos de simulação hidrológica, em conjunto com dados experimentais sobre o efeito de água no rendimento das culturas. A avaliação de diversos valores de outorga levando em consideração bases econômicas como custos de plantio, preços de mercado dos produtos e recorrência das falhas de atendimento associada à probabilidade de ocorrência de rendimentos líquidos não negativos revela um modelo de utilização otimizado dos recursos hídricos superficiais da bacia.

Detecção de salmonella sp. em psitacídeos de cativeiro através da reação em cadeia da polimerase (PCR)

O interesse da Medicina Veterinária nas espécies silvestres tem aumentado gradativamente, principalmente no estudo dos contextos ecológicos de saúde. Dentro desse contexto, autores realizaram estudos com o objetivo de conhecer a importância de Salmonella sp. na saúde das aves silvestres e seu potencial de transmissão para humanos e outros animais. Informações sobre a prevalência e distribuição dos sorovares de salmonelas na população de animais silvestres e domésticos são essenciais para relacionar os possíveis reservatórios que possam ser responsáveis pela transmissão dessa zoonose. Este trabalho teve como objetivo a detecção de Salmonella sp. em psitacídeos clinicamente sadios por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Foram coletados suabes cloacais de 280 psitacídeos mantidos em cativeiro no Estado do Rio Grande do Sul, pertencentes a treze espécies, provenientes de um zoológico, um criadouro conservacionista e um criadouro comercial. O DNA das amostras foi extraído pelo método de fenol-clorofórmio e examinados pela PCR com a utilização de um par de iniciadores que amplifica um fragmento de 284 pb do gene invA pertencente ao gênero Salmonella, resultando em 37 amostras positivas. Não houve diferença na prevalência de salmonela entre os três plantéis nem entre as 13 espécies analizadas. Não foi possível a detecção desse patógeno pela PCR com iniciadores para a identificação de S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Pullorum e S. Gallinarum, nem através da Técnica Microbiológica Convencional nas amostras detectadas pela PCR genérica, provavelmente devido a maior sensibilidade e especificidade da PCR genérica. De acordo com a revisão bibliográfica realizada, este foi o primeiro trabalho de detecção direta de Salmonella em psitacídeos utilizando a PCR. Os resultados indicaram que aproximadamente 13,2% dos psitacídeos mantidos em cativeiro eram portadores assintomáticos ou eram transientemente infectados pelo gênero Salmonella.