Estudios de asociación genómica en poblaciones animales independientes

En mejoramiento genético animal, uno de los principales enfoques para explicar la arquitectura genética de caracteres de importancia económica son los estudios de asociación del genoma completo (GWAS), que no suelen ser particularmente potentes dado el reducido tamaño muestral. Un enfoque para aumentar la potencia de detección de QTL es combinar datos de poblaciones diferentes en un análisis conjunto de asociación (JA). Sin embargo, este enfoque tiene limitaciones tales como la definición de efectos a ser modelados entre poblaciones y la dificultad en el acceso a los genotipos de poblaciones comerciales. Alternativamente, se pueden combinar resultados obtenidos de GWAS independientes mediante el meta-análisis (MA-GWAS). El objetivo central de esta tesis es describir e implementar métodos para GWAS a nivel poblacional y también, combinando datos de varias poblaciones (JA), así como combinando resultados de GWAS independientes (MA-GWAS). La aplicación en datos reales mostró que MA aumentó la potencia para detectar QTL significativos en contraste con los GWAS poblacionales y el JA, considerando la estructura genética, la heterogeneidad de los componentes de varianza entre poblaciones y evitando problemas del JA tales como el acceso a los datos y definición de los efectos fijos. Los resultados del MA fueron usados en la búsqueda de genes candidatos, identificando nuevas posiciones para algunos de los caracteres de calidad de carne porcina evaluados. En conclusión, el trabajo describe métodos novedosos para integrar resultados de evaluaciones genómicas independientes, a fin de detectar asociaciones significativas entre poblaciones e identificar nuevos genes asociados con caracteres de importancia económica.

Inferencia bayesiana sobre los parámetros de dispersión genéticos y ambientales en modelos animales con efectos maternos

Los modelos 'modelos animales con efectos maternos' (MAM)son modelos lineales mixtos que se utilizan para ajustar registros de caracteres bajo la influencia de efectos maternos. Uno de los desafíos más importantes en el marco de los MAM es la estimación de los parámetros de dispersión o 'componentes de (co)varianza' (CVC). En esta tesis se introducen desde una perspectiva bayesiana contribuciones teóricas y metodológicas con relación a la estimación de CVC para MAM sujetos a estructuras de covarianza novedosas. En primer lugar, se describe una implementación del análisis bayesiano jerárquico vía el algoritmo del muestreo de Gibbs. Luego, se considera una especificación conjugada diferente para la distribución a priori de la matriz de covarianza genética, basada en la distribución Wishart invertida generalizada, y se presenta una estrategia para determinar los correspondientes hiperparámetros. Esta estrategia fue comparada contra otras especificaciones a priori mediante un estudio de simulación estocástica, y produjo estimaciones precisas de los parámetros genéticos, con menores errores estándares y mejor tasa de convergencia. En segundo lugar, se presenta una formulación alternativa del MAM que incluye un parámetro de correlación ambiental entre pares de observaciones madre-progenie, y se desarrolla un procedimiento de estimación basado en un algoritmo de muestreo por grilla. El procedimiento fue programado y ejecutado exitosamente, y se obtuvo la primera estimación del parámetro de correlación con datos de campo para peso al destete en bovinos de carne. Por último, se considera el problema de la estimación de CVC en una población multirracial, donde en general es necesario especificar una estructura de covarianza heterogénea para los valores de cría. En particular, se demuestra que el modelo basado en la descomposición de la matriz de covarianza genética es equivalente al que deriva de la teoría genética cuantitativa. Además, se extiende el modelo para incluir efectos maternos y se describe la implementación de un análisis bayesiano jerárquico con el objetivo de estimar los CVC. El procedimiento fue implementado con éxito en datos experimentales de peso al destete y se obtuvieron por primera vez estimaciones para el conjunto completo de CVC.

Estimación de heredabilidades y correlaciones genéticas para caracteres funcionales mediante análisis de supervivencia en Holstein Colombiano.

Las evaluaciones genéticas para caracteres funcionales requieren metodologías como el análisis de supervivencia (SA), que contemplen registros pertenecientes a hembras que no han presentado el evento de interes (descarte o prenez)al momento de la evaluacion. Así, los objetivos de esta tesis fueron: 1)analizar los factores que afectan el riesgo de descarte en vida productiva (VP), y de concepción en días abiertos (DA)e intervalo primer-último servicio (IP), 2)estimar parámetros genéticos de dispersión para los caracteres evaluados. Se emplearon 44652 registros de lactancia de 15706 vacas Holstein Colombiano, ajustando un modelo animal frágil Weibull para VP, con el número de partos (NP), producción de leche (PL)y edad al primer parto (EPP)como efectos fijos. En el caso de DA e IPU se emplearon 14789 servicios de 6205 vacas, ajustando un modelo de datos agrupados con efectos fijos de NP, EPP y número de servicios (SC). En todos los casos se incluyeron efectos aleatorios de animal y de hato. Tanto PL como NP tuvieron gran influencia en la VP, al igual que NP en DA e IPU. Se estimaron valores de h2 de 0,104, 0,086 y 0,1013 para VP, DA, e IPU, respectivamente, asi como correlaciones genéticas simples (rs)entre el nivel de PL con VP y DA de ƒ{0,03 y 0,47, respectivamente. Teniendo en cuenta tanto los valores de cría expresados como riesgo relativo, asi como la magnitud de rs, un aumento en PL conllevaría a disminución en el riesgo de descarte y aumento en el riesgo de concepción, dando lugar a aumentos en la VP y reducción en DA. Las h2s estimadas sugieren la existencia de variabilidad genetica para VP, DA e IPU en Holstein Colombiano, sirviendo de sustento para la implementación de evaluaciones genética de la raza, aprovechando las ventajas de metodologías como SA.

Calidad de aquenio y aceite de girasol : efectos del genotipo, factores ambientales y su interacción y relación con el rendimiento y sus componentes

El objetivo de esta tesis fue estudiar los efectos del genotipo, el ambiente y su interacción sobre peso de cáscara y aptitud al descascarado de los granos; y la composición acídica, contenido de ceras, tocoferoles y fosfolípidos y estabilidad oxidativa del aceite de girasol; así como de las relaciones intrínsecas entre dichos variables con rendimiento en aceite y peso de aquenios, identificando etapas fenológicas de máxima respuesta de estas características de calidad al efecto combinado de factores ambientales, dentro de los cuales se incluyeron a la productividad media y a características de suelo y climáticas, registrados para cada una de las etapas fenológicas de cada cultivar en cada localidad. Se utilizó un diseño de bloques al azar con 5 cultivares sembrados en 11 localidades de Argentina, distribuidas en las áreas NEA, OESTE y SUR. Se aplicaron técnicas de ANAVA factorial, regresión múltiple, análisis de sendero y esquemas de causa-efecto para estimar la importancia relativa de las fuentes de variación e identificar los factores ambientales de mayor efecto sobre estas características. Se utilizó análisis de conglomerados y componentes principales para el estudio de interrelaciones entre las características de calidad y factores ambientales. Aunque se observó variabilidad entre genotipos, el efecto del ambiente sobre la variabilidad total fue superior a la contribución del componente genético para todos los atributos examinados, con la excepción de porcentaje de cáscara y concentración de ceras. No se observó relación entre el rendimiento y las características estudiadas. Los factores ambientales de mayor efecto sobre las características de calidad fueron temperatura mínima, PAR, agua útil, precipitaciones, humedad relativa y nitrógeno, dependiendo el efecto individual, de cada factor, de su interrelación y de la etapa fenológica que se considere. Las condiciones ambientales durante las etapas R1-R5.5 y R5.5+300°Cd lograron explicar gran parte de la variabilidad total.

Control ambiental y genético de la fenología del cultivo de soja : impactos sobre el rendimiento y la adaptación de genotipos

p.63-88

Microsatellite standardization and evaluation of genotyping error in a large multi-partner research programme for conservation of Atlantic salmon (Salmo salar L.).

Microsatellite genotyping is a common DNA characterization technique in population, ecological and evolutionary genetics research. Since different alleles are sized relative to internal size-standards, different laboratories must calibrate and standardize allelic designations when exchanging data. This interchange of microsatellite data can often prove problematic. Here, 16 microsatellite loci were calibrated and standardized for the Atlantic salmon, Salmo salar, across 12 laboratories. Although inconsistencies were observed, particularly due to differences between migration of DNA fragments and actual allelic size ('size shifts'), inter-laboratory calibration was successful. Standardization also allowed an assessment of the degree and partitioning of genotyping error. Notably, the global allelic error rate was reduced from 0.05 ± 0.01 prior to calibration to 0.01 ± 0.002 post-calibration. Most errors were found to occur during analysis (i.e. when size-calling alleles; the mean proportion of all errors that were analytical errors across loci was 0.58 after calibration). No evidence was found of an association between the degree of error and allelic size range of a locus, number of alleles, nor repeat type, nor was there evidence that genotyping errors were more prevalent when a laboratory analyzed samples outside of the usual geographic area they encounter. The microsatellite calibration between laboratories presented here will be especially important for genetic assignment of marine-caught Atlantic salmon, enabling analysis of marine mortality, a major factor in the observed declines of this highly valued species.

Programas de cribado neonatal en España: Actualización y propuestas de futuro. Documento del consenso

Este documento tiene como objetivo principal aportar el conocimiento y la experiencia de los profesionales implicados en el diagnóstico, tratamiento y seguimiento de pacientes con enfermedades metabólicas hereditarias a la prevención de estos defectos. Cuenta con el apoyo incondicional de la Federación Española de Asociaciones de Padres de niños afectados por fenilcetonuria (PKU) y otros trastornos del metabolismo (OTM).

Protein phosphatases acting on the replication checkpoint

A génese de um cancro está dependente da acumulação de mutações genéticas que dão origem a instabilidade genómica, que por sua vez resulta na proliferação descontrolada. Para prevenir a acumulação destas mutações, as células têm mecanismos de controlo (checkpoints) que suspendem o ciclo celular e accionam as vias de reparação do ADN. Estes eventos são muitas vezes regulados por dinâmicas de (des)fosforilação de proteínas. As proteínas fosfatases (PPs), enzimas responsáveis pela remoção do grupo fosfato de resíduos fosforilados, desempenham funções cruciais na regulação de muitos mecanismos celulares. Enquanto que no início do projecto as cinases envolvidas no checkpoint da replicação estavam bem estabelecidas, as PPs envolvidas não eram conhecidas. A Chk1, um componente da maquinaria do checkpoint da replicação, é exemplo dessa regulação por (des)fosforilação, como sejam nos resíduos Ser317 e Ser345. Assim, como primeira abordagem para determinar quais os grupos de PPs envolvidos na regulação do checkpoint da replicação, decidimos investigar o seu papel na regulação da fosforilação da Chk1. A primeira conclusão é que a desfosforilação da Chk1 ao longo do tempo, tanto in vivo como in vitro, ocorre com uma dinâmica bi-fásica. Em segundo, a abordagem in vitro sugere que as famílias PP1, PP2A e PP2C estão envolvidas na desfosforilação da Chk1. Uma vez que a família PP2A foi a que mostrou a maior acção nesta reacção, decidimos investigar outros membros da família in vivo, primeiro com uma abordagem geral (tratando com OA ou sobreexpressando a PME-1), e depois com o knockdown específico da PP4 e PP6 (através de siRNA). Os resultados mostram que a inibição das PPs afectam tanto a desfosforilação como o estado de activação da Chk1 em resposta a tratamento com Hidroxiureia (HU). Todas as PPs testadas in vivo pareceram ser capazes de regular, a níveis diferentes, tanto a fosforilação como a desfosforilação da Chk1. A função das PPs foi também investigada ao nível: da regulação do disparo das origens de replicação, e da recuperação da suspensão da replicação, induzida pela HU. No último caso, os dados indicam que na situação simultânea de knockdown da PP4 com tratamento de HU, há um atraso do ciclo celular na resolução da transição de G2/M. No ensaio de replicação por pulse-chase, os resultamos mostram que tanto o tratamento com OA, como a sobre-expressão de I-2 ou PME-1, atrasam a cronologia do disparo programado das origens de replicação. No entanto, nenhum dos tratamentos efectuados parece desregular o início do checkpoint da replicação. Um rastreio de 2-híbrido de levedura com uma biblioteca de cDNA de testículo humano foi realizado, usando a Chk1 como isco, no sentido de descobrir novos interactores e definir novas possíveis funções para a Chk1 no contexto da meiose. Com base nos resultados do rastreio, duas novas funções são sugeridas: a interacção com a GAGE12 sugere uma função na recombinação genómica/vigilância do genoma durante a meiose, e as interacções com a EEF1α1 e a RPS5 sugerem uma função na regulação da síntese proteíca. Estas experiências fornecem um visão geral para a compreensão da diversidade de funções das proteínas fosfatases envolvidas no checkpoint da replicação, bem como, abre novos caminhos para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento do cancro.

Radiation-induced defects in quantum-size structures of A3B5 semiconductors

As estruturas quânticas de semicondutores, nomeadamente baseadas em GaAs, têm tido nos últimos vinte anos um claro desenvolvimento. Este desenvolvimento deve-se principalmente ao potencial tecnológico que estas estruturas apresentam. As aplicações espaciais, em ambientes agressivos do ponto de vista do nível de radiação a que os dispositivos estão sujeitos, motivaram todo o desenrolar de estudos na área dos defeitos induzidos pela radiação. As propriedades dos semicondutores e dos dispositivos de semicondutores são altamente influenciadas pela presença de defeitos estruturais, em particular os induzidos pela radiação. As propriedades dos defeitos, os processos de criação e transformação de defeitos devem ser fortemente alterados quando se efectua a transição entre o semicondutor volúmico e as heteroestruturas de baixa dimensão. Este trabalho teve como principal objectivo o estudo de defeitos induzidos pela radiação em estruturas quânticas baseadas em GaAs e InAs. Foram avaliadas as alterações introduzidas pelos defeitos em estruturas de poços quânticos e de pontos quânticos irradiadas com electrões e com protões. A utilização de várias técnicas de espectroscopia óptica, fotoluminescência, excitação de fotoluminescência e fotoluminescência resolvida no tempo, permitiu caracterizar as diferentes estruturas antes e após a irradiação. Foi inequivocamente constatada uma maior resistência à radiação dos pontos quânticos quando comparados com os poços quânticos e os materiais volúmicos. Esta resistência deve-se principalmente a uma maior localização da função de onda dos portadores com o aumento do confinamento dos mesmos. Outra razão provável é a expulsão dos defeitos dos pontos quânticos para a matriz. No entanto, a existência de defeitos na vizinhança dos pontos quânticos promove a fuga dos portadores dos níveis excitados, cujas funções de onda são menos localizadas, provocando um aumento da recombinação nãoradiativa e, consequentemente, uma diminuição da intensidade de luminescência dos dispositivos. O desenvolvimento de um modelo bastante simples para a estatística de portadores fora de equilíbrio permitiu reproduzir os resultados de luminescência em função da temperatura. Os resultados demonstraram que a extinção da luminescência com o aumento da temperatura é determinada por dois factores: a redistribuição dos portadores minoritários entre os pontos quânticos, o poço quântico e as barreiras de GaAs e a diminuição na taxa de recombinação radiativa relacionada com a dependência, na temperatura, do nível de Fermi dos portadores maioritários.

Estudo de defeitos em filmes finos de ZnO depositados por Rf-sputtering

Neste trabalho foram estudados diferentes filmes finos de ZnO depositados por Rf-Sputtering. Filmes finos de ZnO com diferentes propriedades óticas foram obtidos intencionalmente variando os parâmetros de deposição. De modo a correlacionar as propriedades óticas e estruturais com os parâmetros de deposição, foram utilizadas diferentes técnicas de caracterização avançadas, tais como, fotoluminescência, microscopia de força atómica, difração de raios- X e retrodispersão de Rutherford. Este trabalho centra-se na discussão e análise das bandas de emissão vermelha, verde e azul, comumente observadas em amostras de ZnO e cuja natureza tem sido objeto de grande controvérsia na literatura. A utilização de técnicas de caracterização estrutural revelou-se de extrema importância para correlacionar as propriedades físicas de composição e estrutura com os centros óticos observados nos filmes. Nesta base, foram propostos e discutidos diferentes modelos de recombinação ótica associados à qualidade estrutural dos filmes, considerando modelos de camadas que descrevem a heterogeneidade lateral e em profundidade. Desta análise verificou-se a presença de heterogeneidade estrutural e composicional, que aumenta a complexidade na compreensão da correlação dos parâmetros de deposição com as propriedades óticas dos filmes. Foi discutida a limitação e validade de diferentes modelos tendo em conta a presença da heterogeneidade existente nos filmes estudados. Este trabalho contribui assim para uma melhor compreensão da complexidade de interação dos diferentes defeitos e o seu efeito nas propriedades óticas, nomeadamente o papel dos defeitos de interface, na superfície, nas fronteiras de grão e junto ao substrato.

Codon ambiguities as a mechanism to alter the genetic code in Saccharomyces cerevisiae

Although the genetic code is generally viewed as immutable, alterations to its standard form occur in the three domains of life. A remarkable alteration to the standard genetic code occurs in many fungi of the Saccharomycotina CTG clade where the Leucine CUG codon has been reassigned to Serine by a novel transfer RNA (Ser-tRNACAG). The host laboratory made a major breakthrough by reversing this atypical genetic code alteration in the human pathogen Candida albicans using a combination of tRNA engineering, gene recombination and forced evolution. These results raised the hypothesis that synthetic codon ambiguities combined with experimental evolution may release codons from their frozen state. In this thesis we tested this hypothesis using S. cerevisiae as a model system. We generated ambiguity at specific codons in a two-step approach, involving deletion of tRNA genes followed by expression of non-cognate tRNAs that are able to compensate the deleted tRNA. Driven by the notion that rare codons are more susceptible to reassignment than those that are frequently used, we used two deletion strains where there is no cognate tRNA to decode the rare CUC-Leu codon and AGG-Arg codon. We exploited the vulnerability of the latter by engineering mutant tRNAs that misincorporate Ser at these sites. These recombinant strains were evolved over time using experimental evolution. Although there was a strong negative impact on the growth rate of strains expressing mutant tRNAs at high level, such expression at low level had little effect on cell fitness. We found that not only codon ambiguity, but also destabilization of the endogenous tRNA pool has a strong negative impact in growth rate. After evolution, strains expressing the mutant tRNA at high level recovered significantly in several growth parameters, showing that these strains adapt and exhibit higher tolerance to codon ambiguity. A fluorescent reporter system allowing the monitoring of Ser misincorporation showed that serine was indeed incorporated and possibly codon reassignment was achieved. Beside the overall negative consequences of codon ambiguity, we demonstrated that codons that tolerate the loss of their cognate tRNA can also tolerate high Ser misincorporation. This raises the hypothesis that these codons can be reassigned to standard and eventually to new amino acids for the production of proteins with novel properties, contributing to the field of synthetic biology and biotechnology.