Enzimas hidrolíticas extracelulares de isolados de rizóbia nativos da Amazônia Central, Amazonas, Brasil

A associação rizóbia x leguminosa contribui para enriquecer o solo com nitrogênio por meio da fixação biológica. Entretanto, pouco se conhece a respeito do perfil enzimático desses microrganismos. Nesse contexto, a presente investigação propõe avaliar a produção de enzimas hidrolíticas extracelulares por isolados de rizóbia nativos da Amazônia Central. Essa triagem constitui o primeiro passo na seleção de microrganismos nativos que são potencialmente exploráveis como produtores de enzimas. Foram testados 67 isolados nativos de rizóbia para as atividades amilolítica, celulolítica, lactolítica, lipolítica, pectinolítica e proteolítica, em meio YMA modificado. A atividade ureolítica foi detectada em meio ágar-uréia. As bactérias isoladas dos nódulos de feijão caupi mostraram maior capacidade em produzir enzimas do que os isolados bacterianos de soja. De todas as enzimas hidrolíticas avaliadas, apenas a pectinase não foi detectada neste estudo. Amilase (32,8%), protease (28,4%), urease (20,9%) e carboximetilcelulase (9,0%) foram as enzimas mais freqüentes produzidas pelos isolados. Neste trabalho, apenas as enzimas amilase e protease variaram significativamente entre os isolados de rizóbia. Os isolados INPA R-926 e INPA R-915 exibiram os maiores índices amilolíticos (IE = 3,1) e proteolíticos (IE = 6,6), respectivamente. Este estudo revelou alguns isolados de rizóbia nativos da Amazônia Central como fontes promissoras de enzimas de importância industrial para uso biotecnológico.

Aproveitamento do resíduo de laranja para a produção de enzimas lignocelulolíticas por Pleurotus ostreatus (Jack:Fr)

Neste trabalho propomos o aproveitamento dos resíduos de laranja gerados após remoção do suco como substrato para a obtenção de enzimas hidrolíticas e oxidativas envolvidas na degradação de materiais lignocelulósicos, tais como: lacase (EC 1.10.3.2), manganês peroxidase (EC 1.11.1.14), xilanase (EC 3.2.1.8) e endo-1,4 glucanase (EC 3.2.1.4), pelo basidiomiceto Pleurotus ostreatus cultivado em estado sólido. O fungo desenvolveu-se bem no resíduo, em diferentes umidades iniciais e sem a necessidade de qualquer suplementação. O meio à base de resíduo de laranja proporcionou a obtenção de elevadas atividades de enzimas com grande potencial de uso industrial, especialmente lacase (74,3 U.g -1 substrato após 15 dias de cultivo) e manganês peroxidase (6,8 U.g -1 substrato após 30 dias de cultivo).

Atividades das enzimas peroxidase (POD) e polifenoloxidase (PPO) nas uvas das cultivares benitaka e rubi e em seus sucos e geléias

A peroxidase e a polifenoloxidase estão relacionadas com o escurecimento de frutas, por isso o controle das atividades destas enzimas é de grande importância para a tecnologia de alimentos. Neste trabalho estudaram-se as atividades dessas enzimas nas uvas frescas das cultivares Benitaka e Rubi, bem como as suas termoestabilidades e as suas atividades enzimáticas residuais no suco e nas geléias (extra e light). Foi também avaliada a qualidade microbiológica dos produtos elaborados. As atividades da enzima POD, tanto da fração solúvel quanto da ionicamente ligada, foram semelhantes nas uvas das duas variedades, Benitaka e Rubi. A atividade da enzima polifenoloxidase foi maior na variedade Rubi. As operações de cocção e pasteurização foram mais eficientes para baixar as atividades enzimáticas residuais da POD e PPO quando aplicadas às geléias de uva, em comparação com o suco. Embora não foram suficientes para a total inativação enzimática, essas operações reduziram-nas consideravelmente, e foram eficientes para garantir seguridade microbiológica dos produtos, geléias e suco.

Estudo da influência de diferentes parâmetros na produção de enzimas líticas

O presente trabalho visou o estudo do efeito de diferentes variáveis na produção de β-1,3 glucanases, proteases e de quitinases pela linhagem Cellulosimicrobium cellulans 191, em meios de cultivo A, B e C, respectivamente. Foram realizados planejamentos fatoriais 2³, e os fatores estudados foram: pH inicial, temperatura e agitação dos frascos. No planejamento experimental para a produção de β-1,3 glucanase em meio de cultivo A foi verificada maior produção da enzima (0,64 U.mL-1) com pH inicial de 8,5 após 24 horas de fermentação a 33 ºC e 200 rpm. Os parâmetros pH, agitação dos frascos e interação entre todos os parâmetros foram estatisticamente significativos. No planejamento experimental para a produção de protease em meio de cultivo B foi verificada maior produção da enzima (4,25 U.mL-1) com pH inicial de 6,5 após 30 horas de fermentação a 20 ºC e 200 rpm. O pH foi o único parâmetro estatisticamente significativo. No planejamento experimental para a produção de quitinase em meio de cultivo C foi verificada maior produção da enzima (7,06 U.mL-1) com pH inicial de 5,5 após 72 horas de fermentação a 25 ºC e 200 rpm. Todos os parâmetros estudados e suas interações foram estatisticamente significativos. Os coeficientes de determinação, as análises de variância e os teste F demonstraram que os modelos de primeira ordem obtidos foram considerados estatisticamente significativos adotando um nível de confiança de 95%.

Palmito de pupunha (Bactris gasipaes Kunth.) composição mineral e cinética de enzimas oxidativas

A análise da presença de enzimas oxidativas como a peroxidase (POD) e a polifenoloxidase (PPO) e o controle da atividade destas enzimas são importantes na preservação e no processamento de alimentos. Este trabalho teve por objetivo determinar a atividade enzimática da polifenoloxidase (PPO) e da peroxidase (POD) do palmito de pupunha, bem como avaliar o comportamento destas enzimas frente ao tratamento térmico e assim calcular a cinética de inativação térmica das mesmas para suas porções termorresistente e termolábil. Para a extração de peroxidase (POD) e polifenoloxidase (PPO) de palmito, utilizou-se solução tampão fosfato de sódio 100 mM com diferentes pHs (5,5; 6,0; 6,5 e 7,0). O melhor pH de extração da POD foi 5,5 e da PPO, 6,5. Estes extratos foram tratados em diferentes temperaturas (65, 70, 75 e 80 °C) por períodos de 1 a 10 minutos. A POD e a PPO sofreram um decréscimo de 70 e 80%, respectivamente, em relação às suas atividades iniciais. As energias de ativação, nas temperaturas estudadas, para a porção termolábil e termorresistente da peroxidase foram 154,0 e 153,0 kJ.mol-1, respectivamente, enquanto que para a polifenoloxidase foram 26,3 e 27,0 kJ.mol-1, respectivamente. Resultados apresentaram valores que estão dentro da faixa de energia de ativação reportada para o processo de inativação térmica de enzimas.

Imobilização de enzimas de milho maltado em gel

Este trabalho objetivou a otimização da imobilização das enzimas amilases extraídas do malte do milho, usando alginato de sódio. A concentração do malte no extrato, a porcentagem de alginato de sódio e o pH foram usados como fatores que influenciam na imobilização das enzimas. Os resultados mostraram que as melhores condições de imobilização foram obtidas quando se usou as soluções de malte de milho em duas faixas de concentrações, uma entre 3,75 a 5 g.L-1 e outra entre 15 a 16,25 g.L-1, em pH entre 4,83 a 6,6 e 4% (m/v) de alginato de sódio, condições nas quais se conseguiu imobilizar 100% das enzimas com baixa perda de atividade. Este trabalho mostrou como se obter amilases de malte de milho imobilizadas por oclusão em alginato de sódio e que podem ser usadas em processos industriais de hidrólise de amido.

Efeito da alta pressão hidrostática na atividade de enzimas da polpa de açaí

O Brasil vem conquistando o mercado externo de sucos de frutos tropicais, com destaque para o açaí, muito procurado por ser conhecido como um alimento funcional, devido à concentração de antocianinas, fibras dietéticas e ácidos graxos monoinsaturados. Entretanto, o açaí é altamente perecível, necessitando de intervenções tecnológicas para prolongar sua vida de prateleira. Nesse caso, o uso da Alta Pressão Hidrostática (APH) pode ser uma alternativa aos processamentos tradicionais, por sua capacidade de ativar ou inativar enzimas. Peroxidases (POD) e polifenoloxidases (PFO) são as principais enzimas responsáveis por alterações indesejáveis das características originais de produtos vegetais e, com a sua inativação pela APH, pode-se evitar o escurecimento enzimático e manter as suas propriedades sensoriais. Com o objetivo de avaliar o efeito da APH em POD e PFO de polpa de açaí, adotaram-se as variáveis de pressão, temperatura e tempo. As atividades enzimáticas expressas em percentuais revelaram a POD mais estável, atingindo percentuais próximos a 100% (controle). As menores atividades foram a 90,74%, e quando se aplicaram 300 e 500 MPa a 25 °C por 5 minutos, as atividades aumentaram (112,34 e 132,98%, respectivamente). A atividade da PFO aumentou até 83,03% em relação ao controle, embora apresentasse inativação na maioria dos processos, evidenciando-se atividade a 35 °C/5 minutos de 53,25 e 53,75% a 300 e 500 MPa, respectivamente. Diante das condições experimentais, a APH mostrou-se eficaz na inativação parcial de oxidases na polpa de açaí.

Efeitos da farinha de folhas de mandioca sobre a atividade das enzimas AST, ALT, FA e lipídios hepáticos de ratos Wistar

Folhas de mandioca possuem substâncias como ligninas e saponinas que podem apresentar efeito hipolipidêmico. Todavia, um estudo recente relatou aumento no peso do fígado de ratos alimentados com dietas contendo farinha de folhas de mandioca (FFM - Manihot esculenta Crantz cv. Cacao), tornando-se necessário um estudo mais aprofundado dos efeitos desta farinha sobre os parâmetros hepáticos. Para este estudo, um ensaio biológico com 32 ratos machos Wistar foi conduzido por um período de 7 semanas, sendo os tratamentos: dieta controle e dietas contendo 5, 10 e 15% de FFM. As dietas contendo FFM não apresentaram efeitos sobre as atividades das enzimas Aspartato Aminotransferase (AST) e Fosfatase Alcalina (FA), mas aumentaram significativamente a atividade da enzima alanina aminotransferase (ALT). O estudo histopatológico revelou vacuolização do citoplasma dos hepatócitos para todos os grupos. No entanto, a freqüência de animais com vacuolização acentuada foi superior nos grupos que receberam dietas com FFM, apresentando também maiores teores de lipídios e colesterol total hepáticos e maior relação peso fígado/peso corporal. Estes resultados indicam que os antinutrientes presentes nas folhas de mandioca, como taninos, cianeto e saponinas, podem ser responsáveis pela redução da função hepática nos animais alimentados com FFM.

Seleção de Basidiomycetes da Amazônia para produção de enzimas de interesse biotecnológico

Os fungos têm sido bastante usados como produtores de diferentes substâncias de interesse econômico, tais como: enzimas, antibióticos, vitaminas, aminoácidos e esteróides. Este estudo teve como objetivo detectar a produção de enzimas por linhagens de Basidiomycetes, oriundas de áreas de floresta da Amazônia. Para a produção de enzimas, os fungos foram cultivados em meio líquido adicionado de substrato indutor (0,5%), pH ajustado para cada enzima e incubados a 28 °C, sob agitação a 140 rpm, durante 96 ou 120 horas. A massa micelial foi separada for filtração e os filtrados foram inoculados em cup plates de 6 mm de diâmetro, perfurados na superfície de meios de cultura sólidos, adequados para a detecção das enzimas amilases, proteases, celulases, fenoloxidases e pectinases em placa de Petri. As placas foram incubadas à temperatura de 28 °C por 24 horas, e reveladas para observação dos halos indicativos da atividade enzimática. Foi verificada também a atividade da amilase e protease produzida pelos fungos, crescidos em meio líquido, com diferentes fontes nutricionais. Foi possível detectar a produção de celulases e proteases por todos os isolados, 40% produziram amilases, 50% produziram fenoloxidases e 10% produziram pectinases. Quanto à atividade da amilase, o substrato farelo de trigo foi o que proporcionou os maiores halos de degradação, destacando-se os fungos Daedalea sp. 4E6 e Daedalea sp. 1A, Stereaceae 22B e Pycnoporus sanguineus 12B. Considerando os substratos testados para produção de proteases, o substrato concentrado protéico de peixe se destacou como a melhor fonte protéica. Os fungos P. sanguineus 12B, Stereaceae 22B e Cantharellus guyanensis 4Bl foram os melhores produtores de protease.

Determinação de inibidores da germinação no espermoderma de sementes de café (Coffea arabica L.)

Sementes de café apresentam germinação lenta, aumentando consequentemente o período de formação das mudas. A causa dessa germinação lenta, ainda não está elucidada. Aparentemente, a difusão de gases e da água tem papel secundário comparadas ao efeito de inibidores presentes. A presente pesquisa foi desenvolvida no Setor de Sementes do Departamento de Agricultura e no Laboratório de Química da Universidade Federal de Lavras. Em uma pesquisa preliminar, utilizando sementes de alface como indicadora de inibidores e extrato aquoso de espermoderma ("película prateada"), ficou evidenciada a presença de inibidores nesse tecido. Em uma segunda etapa o extrato aquoso da película prateada foi submetido a um fracionamento, em teste in vitro. Observou-se, por meio desse teste, que a fração ativa encontrava-se na fase metanólica, a qual foi concentrada sob vácuo e eluída através de coluna de sílica gel com metanol, água destilada e HCl 0,1M. Após concentração sob vácuo da fração ativa originou-se um sólido branco, que se mostrou homogêneo segundo análise por cromatografia em camada fina com placas de sílica gel. Por meio de análise de espectrometria de infravermelho, de massas e de ressonância magnética nuclear de ¹H e de 13C, atribuiu-se a tal sólido a estrutura da cafeína. Conclui-se que o espermoderma pode contribuir para a lenta germinação das sementes de café, possivelmente devido à presença de cafeína.

Detecção de soja geneticamente modificada tolerante ao glifosato por métodos baseados na atividade de enzimas

Avanços na engenharia genética permitiram a obtenção de plantas geneticamente modificadas tolerantes a determinados herbicidas. O uso de sementes de plantas geneticamente modificadas está aumentando rapidamente, havendo a necessidade de desenvolver métodos de identificação e detecção rápidos, práticos e de baixo custo, que possam ser padronizados.O objetivo desta pesquisa foi desenvolver um método bioquímico de deteccção de soja tolerante ao glifosato. Foram comparados dois genótipos de soja, um tolerante ao glifosato e seu parental não geneticamente modificado. As sementes foram submetidas a tratamentos de pré-embebição por 16 horas, em água e em solução de herbicida contendo 0,6% do ingrediente ativo e, mantidas a seguir em germinador à temperatura de 25°C por sete dias. Após, foi realizada a extração e a determinação da atividade da enzima peroxidase pela avaliação dos eletroforegramas e de reação colorimétrica. Os resultados obtidos permitiram concluir que é possível diferenciar cultivares de soja quanto à tolerância ao herbicida glifosato através da reação colorimétrica. Há diferença nos eletroforegramas de atividade da enzima peroxidase entre os cultivares tolerante e suscetível ao glifosato.

Enzimas removedoras de radicais livres e proteínas lea associadas à tolerância de sementes milho à alta temperatura de secagem

Sementes de milho tornam-se tolerantes à dessecação à medida que secam naturalmente no campo e, após a maturidade fisiológica, pré-secagem a 35ºC pode induzir tolerância à temperatura de secagem de 50ºC. Nesse trabalho, sementes da cultivar BRS-3060, colhidas com teor de água de 42,2%, submetidas a períodos crescentes de pré-condicionamento apresentaram tolerância crescenteà temperatura de 50ºC, até atingirem o teor de água de 25,9%, quando exibiram o máximo desempenho fisiológico, avaliado por meio de testes de germinação, vigor e atividade de enzimas a-amilase. O presente trabalho teve o objetivo de investigar o padrão eletroforético de enzimas removedoras de radicais livres e de proteínas lea, em sementes tolerantes e intolerantes a alta temperatura de secagem. As atividades das enzimas removedoras superóxido dismutase, peroxidase e catalase, foram detectadas em hipocótilos de plântulas após cinco dias de germinação e a atividade de proteínas lea detectada em eixos embrionários. Os resultados permitiram concluir que a tolerância de sementes de milho à temperatura de 50ºC está associada à atividade da enzima catalase e pouco relacionada à atividade das enzimas superóxido dismutase e peroxidase. Proteínas lea estavam ausentes em sementes de milho intolerantes e sua presença foi associada ao desempenho fisiológico das sementes tolerantes.

Qualidade fisiológica de sementes de milho, feijão, soja e alface na presença de extrato de tiririca

A espécie Cyperus rotundus (tiririca) é perene e de difícil controle. Os órgãos subterrâneos dessa ciperácea produzem inibidores capazes de interferir na germinação e no crescimento de plântulas e de plantas de várias espécies, fenômeno chamado de alelopatia. A inibição na germinação de sementes pode estar associada à interferência de substâncias alelopáticas na atividade de enzimas chaves no processo de germinação. Nesse trabalho foi avaliada a qualidade fisiológica assim como a atividade de enzimas envolvidas no processo de germinação em sementes de milho, feijão, soja e alface submetidas ao extrato de bulbos de tiririca. As sementes foram germinadas em substrato contendo extrato de bulbos de tiririca, nas concentrações de 10 g L-1 e 100 g L-1 e água destilada. A avaliação da qualidade fisiológica foi feita por meio de testes de germinação e vigor. Avaliou-se a atividade das enzimas superóxido-dismutase e esterase para todas as espécies, catalase para as sementes de milho e feijão, peroxidase e endo-b-mananase para as de alface, glutamato-oxalacetato-transaminase e a-amilase para as de milho e glicose-6-fosfato-desidrogenase para as de soja. Observou-se uma diminuição da germinação das sementes de alface com o aumento da concentração do extrato, inibição da germinação das sementes de milho e de feijão quando submetidas ao extrato na concentração de 10 g L-1 e um estímulo da germinação de sementes de soja na presença do extrato na concentração de 10 g L-1 e uma inibição em extrato na concentração de 100 g L-1. Foi observada redução da atividade das enzimas superóxido-dismutase, endo-b-mananase, peroxidase e a-amilase com o aumento da concentração do extrato. Para glutamato-oxalacetato-transaminase e glicose-6-fosfato-desidrogenase observou-se aumento da atividade da enzima com o aumento da concentração do extrato, indicando a perda da qualidade das sementes. Para esterase foi verificada menor atividade da enzima nas sementes de alface submetidas à germinação em substrato contendo 100 g L-1 e em soja menor atividade dessa enzima foi observada nas concentrações de 0 e 100 g L-1. Para catalase, observou-se padrões diferenciados de bandas sob concentrações de 10 e 100 g L-1 para o milho. O extrato de bulbos de tiririca interfere na qualidade fisiológica na atividade das enzimas envolvidas no processo de germinação de sementes de milho, feijão, soja e alface.

Compostos fenólicos inibidores da germinação em sementes de mamão (Carica papaya)

Sementes de mamão germinam lenta e irregularmente, o que tem sido atribuído à presença da sarcotesta. O trabalho teve como objetivos avaliar o efeito inibitório de extratos de sarcotesta na germinação de sementes de alface e quantificar compostos fenólicos em sementes de mamão. Foram utilizados frutos de mamão do grupo Formosa, híbrido Tainung 01, colhidos em Maio e Setembro/2005, obtendo-se sementes com e sem sarcotesta que foram avaliadas quanto à germinação aos 15 e 30 dias após a semeadura. Realizou-se um bioensaio com sementes de alface, que foram colocadas para germinar em substrato umedecido com água e com soluções obtidas a partir de extrato da sarcotesta de sementes de mamão. Determinou-se, também, o conteúdo de compostos fenólicos nas diferentes estruturas destas (sarcotesta, esclerotesta, endosperma e embrião), utilizando-se o ácido tânico como padrão e para reação de coloração, o reagente Folin-Ciacalteau, com leitura em espectrofotômetro a 765 nm. Verificou-se que o extrato de sarcotesta inibe a germinação e o crescimento da raiz primária das plântulas de alface, devido à presença de compostos fenólicos. Maior quantidade destes compostos foi observada na esclerotesta das sementes de mamão, seguida da sarcotesta, sendo praticamente nula a presença de tais compostos no embrião e no endosperma. Sementes oriundas da colheita de Maio/2005 exibiram dormência, apresentando maior conteúdo de fenóis na sarcotesta quando comparadas às sementes obtidas de frutos colhidos em Setembro/2005, as quais não apresentaram dormência.

Identificação de cultivares de milho, feijão, algodão e soja por meio de enzimas e proteínas resistentes ao calor

Nesta pesquisa foram avaliados o polimorfismo e a estabilidade de isoenzimas e de proteínas resistentes ao calor em sementes de cultivares de milho, feijão, algodão e soja, com diferentes níveis de qualidade fisiológica. As isoenzimas ,álcool desidrogenase, catalase, esterase e superóxido dismutase analisadas conjuntamente, foram eficientes na separação de oito cultivares de milho. Para as cultivares de feijão, pela enzima peroxidase foi possível diferenciar a cultivar Carioca, no entanto, este padrão mostrou-se variável em sementes com baixa germinação. Não foi possível diferenciar as cultivares de algodão pelas enzimas esterase, superóxido dismutase, diaforase e malato desidrogenase. A cultivar Conquista, de soja, foi diferenciada pelos sistemas enzimáticos esterase e superóxido dismutase e a 'BRS-154' pela esterase. Proteínas resistentes ao calor são polimórficas e estáveis para a identificação de cultivares de milho.