Estudo do desenvolvimento e da produtividade lipídica da levedura Rhodotorula glutinis NCYC 921 em culturas descontínuas monitorizadas por citometria de fluxo

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia

UMA ABORDAGEM YEAST TWO-HYBRID PARA O ESTUDO DA REPLICAÇÃO E PATOGÉNESE DO VÍRUS DA HEPATITE DELTA

O vírus da hepatite delta (HDV) é o agente etiológico de uma das formas mais graves de hepatite viral e é ainda endémico em diversas regiões do globo, nomeadamente em África, na Amazónia e no Extremo Oriente. O HDV co-infecta ou super-infecta hepatócitos infectados com o vírus da hepatite B (HBV) aumentando em cerca de 10 vezes o risco de cirrose e hepatite fulminante. A associação clínica entre os dois vírus deve-se ao facto do invólucro do HDV ser constituído pelos antigénios de superfície do HBV (HBsAgs) que são necessários para a propagação da infecção. O genoma do HDV é constituído por uma molécula de RNA de cadeia simples, circular, com cerca de 1.7 Kb, que possui cerca de 70% de emparelhamento interno. Foi identificada uma única grelha de leitura aberta (ORF) no RNA viral que codifica para o antigénio delta (HDAg). A ocorrência de um mecanismo de editing do RNA, resulta na expressão de duas formas do HDAg, a pequena (S-HDAg) e a grande (L-HDAg). Várias funções essenciais para a replicação do HDV têm sido atribuídas a ambas as formas do HDAg, sendo a S-HDAg essencial para a acumulação de RNA viral e a L-HDAg responsável pela interacção com os HBsAgs para formar partículas virais. No entanto, dada a simplicidade dos seus componentes, admite-se que a replicação viral depende das interacções estabelecidas entre os HDAgs e factores celulares do hospedeiro. Apesar do número considerável de factores celulares descritos como interactores dos HDAgs ou RNA virais, a importância de muitas destas interacções não foi elucidada e muitas etapas do ciclo de replicação do HDV permanecem pouco claras. Para além disso, dado o número limitado de factores do hospedeiro que estão envolvidos na sua replicação, é muito provável que um número elevado de interactores do HDV permaneça por identificar. Este trabalho teve como objectivo a identificação de proteínas de fígado humano capazes de interagir com os HDAgs, utilizando o sistema yeast Two-Hybrid (YTH). Identificaram-se trinta proteínas com capacidade de interagir com a S-HDAg no sistema YTH, sendo que estas proteínas se encontram envolvidas em diferentes processos celulares. Com base nas características funcionais, foram seleccionadas três destas proteínas e as suas interacções com a S-HDAg foram investigadas com maior detalhe. As três proteínas seleccionadas foram a ribonucleoproteína nuclear heterogénea C (hnRNPC), a embryonic lethal abnormal vision like1 (ELAVL1/HuR) e a proteína 2 de ligação a EBNA1 (EBP2). As duas primeiras são proteínas de ligação a RNA, previamente descritas como envolvidas em processos de replicações de outros vírus com genoma RNA, enquanto a EBP2, é uma proteína de localização preferencialmente nucleolar, tal como por vezes acontece com os HDAgs. As interacções foram analisadas recorrendo a vários ensaios bioquímicos. No caso da hnRNPC e da HuR, após validação no sistema YTH, a capacidade de interacção com a S-HDAg foi confirmada quer in vitro por blot overlay quer in vivo por co-imunoprecipitação em células de hepatoma humano. Nas mesmas células, observou-se uma co-localização considerável entre os HDAgs e os RNAs virais. Finalmente, de modo a investigar a contribuição das proteínas hnRNPC e HuR na replicação do HDV, procedeu-se ao silenciamento destas proteínas pela utilização de short hairpin RNAs (shRNAs) específicos para os mRNAs correspondentes Observou-se que o silenciamento de ambas as proteínas hnRNPC e HuR endógenas, individualmente resultou numa diminuição acentuada nos níveis de expressão dos HDAgs. No que respeita à EBP2, a interacção com a S-HDAg foi confirmada em condições in vitro com recurso a ensaios de blot overlay e de cromatografia de afinidade. A análise por imunofluorescência indirecta e microscopia confocal revelou co-localização elevada entre os HDAgs e a EBP2, principalmente nos nucléolos de células de hepatoma humano. Finalmente, foi ainda utilizado o sistema YTH para estudar os mecanismos de importação dos HDAgs. Assim, este sistema foi utilizado com o propósito de identificar proteínas celulares capazes de interagir com um domínio específico dos HDAgs, o sinal de localização nuclear (NLS). Na pesquisa YTH realizada obtiveram-se 161 clones positivos, sendo que um deles mostrou codificar para a carioferina α4 (KPNA4). A interacção da KPNA4 com a S-HDAg foi reproduzida em condições in vitro através de um ensaio de cromatografia de afinidade tendo sido utilizadas formas recombinantes das duas proteínas. Este trabalho permitiu identificar várias proteínas celulares que interagem com a S-HDAg. Obtiveram-se evidências sugestivas de que algumas das proteínas identificadas podem desempenhar funções importantes no ciclo de replicação do HDV e que abrem novas perspectivas para o estudo do ciclo de replicação do vírus.

The role of complex chromosome translocations in leukemia

Resumo A tumorigénese é um processo de transformação celular que se desenrola tipicamente em várias etapas. Os diferentes níveis de evolução tumoral resultam da acumulação sucessiva de mutações genéticas numa célula normal que lhe conferem uma vantagem selectiva no respectivo meio tecidular. As mutações podem manifestar-se sob a forma de alterações nucleotídicas pontuais ao nível da sequência de DNA, levando a uma desregulação da função proteíca ou à formação de proteínas não-funcionais, ou através de alterações cromossómicas numéricas ou estruturais. Na leucemia, por exemplo, os genes híbridos que resultam de translocações cromossómicas desempenham um importante papel no processo tumorigénico. Estes genes são transcritos sob a forma de um RNA mensageiro de fusão, o qual é traduzido numa proteína híbrida com função oncogénica. Frequentemente, os subtipos de doença leucémica estão associados com translocações cromossómicas que envolvem 2 pontos de quebra recorrentes e específicos. É disto exemplo a leucemia mielóide crónica, em que uma translocação recíproca entre os cromossomas 9 e 22 conduz à formação de um gene de fusão BCR-ABL1. Em diferentes subtipos de doença, existe também uma pequena proporção de casos que apresenta translocações cromossómicas complexas, que envolvem um ou mais pontos de quebra adicionais em outras localizações genómicas além das que estão implicadas na formação dos genes de fusão. Por vezes, os pontos de quebra estão também associados a delecções extensas de material genético que se pensa terem uma função importante na tumorigénese. No entanto, o papel destas regiões genómicas no desenvolvimento tumoral não tem sido um motivo recorrente de estudo. Neste contexto, o objectivo desta dissertação foi o de determinar o potencial papel tumorigénico de alterações génicas adicionais ocorridas nos pontos de quebra de translocações cromossómicas complexas. Para a prossecução do objectivo proposto, foram estudados 5 rearranjos cromossómicos distintos associados com diferentes tipos de doença hematológica maligna, nomeadamente a leucemia linfoblástica aguda de células B (2 casos), leucemia mielóide aguda, neoplasma mieloproliferativo e síndrome mielodisplásico/neoplasma ieloproliferativo, não classificável. O mapeamento dos pontos de quebra foi efectuado utilizando a hibridação fluorescente in situ e diferentes metodologias de biologia molecular, tendo como base a informação inicial da análise citogenética. Em casos seleccionados, o papel dos novos genes candidatos foi avaliado in vitro utilizando modelos de linhas celulares, nomeadamente no que respeita às funções de controlo da proliferação celular e de regulação transcricional. De entre os 5 casos estudados, quatro deles evidenciaram translocações complexas envolvendo 3 cromossomas, nomeadamente t(12;21;5)(p13;q22;q13), t(12;6;15)(p13;p24~25;q22), t(9;11;19)(p22;q23;p13) e t(X;20;16)(p11;q13;q23). No caso remanescente, foi observada uma translocação dicêntrica dic(9;12)(p11;p11) acompanhada de delecções extensas em ambos os pontos de quebra. Nos casos com t(12;21;5) e t(9;11;19) as translocações estavam associadas com a presença de genes de fusão recorrentes, nomeadamente TV6(12p13)-RUNX1(21q22) e TLL(11q23)-MLLT3(9p22), indicando que se tratavam de rearranjos complexos das translocações t(12;21) e t(9;11) associadas com a leucemia linfoblástica aguda de células B e a leucemia mielóide aguda, respectivamente. O papel dos pontos de quebra adicionais foi estudado em detalhe no caso com t(9;11;19). Através da metodologia de long distance inverse-polymerase chain reaction, foram identificados os pontos de quebra na sequência de DNA dos 3 cromossomas envolvidos na translocação. Além dos pontos de quebra nos genes MLL e MLLT3, foi observado que o local de quebra no cromossoma 19 interrompeu a sequência de um novo gene, designado CCDC94,conduzindo à sua haplo-insuficiência nas células com t(9;11;19). Através de ensaios de reverse transcription-polymerase chain reaction verificámos que o gene CCDC94 é expresso ubiquitariamente em tecidos humanos normais. A análise informática da sequência prevista da proteína CCDC94 indicou uma elevada identidade de aminoácidos com a proteína cwf16, envolvida na regulação do ciclo celular da levedura Schizosaccharomyces pombe. Através da clonagem do DNA complementar de CCDC94 em vectores de expressão, e após a transfecção destes em culturas de linhas celulares in vitro, observámos que este gene codifica uma proteína de localização exclusivamente nuclear. A expressão ectópica da proteína CCDC94 diminuiu a progressão do ciclo celular e a proliferação das células em cultura. Inversamente, a supressão do transcrito do gene CCDC94 através de interferência de RNA conduziu a um aumento significativo da proliferação celular, confirmando que CCDC94 regula negativamente a proliferação e a progressão do ciclo celular. Estes resultados mostram que os pontos de quebra adicionais, presentes em translocações cromossómicas complexas em leucemia, podem resultar na haplo-insuficiência de genes controladores dos mecanismos proliferativos, cooperando desta forma com a acção das proteínas de fusão para proporcionar ao clone leucémico uma proliferação celular descontrolada. Nos restantes 3 casos estudados não foram identificados genes de fusão. Ao invés, todos aqueles apresentaram delecções de extensão variável associadas com os pontos de quebra cromossómicos. No caso com t(12;6;15), identificámos uma delecção de 1.2 megabases de DNA na banda 12p13 que resultou na eliminação de 9 genes incluindo ETV6 e CDKN1B. O gene ETV6 codifica um factor de transcrição que é essencial para a formação das diferentes linhagens hematopoiéticas na medula óssea, enquanto CDKN1B é traduzido numa proteína responsável por bloquear a entrada das células na fase G1 do ciclo celular e,consequentemente, por travar a proliferação celular. Neste contexto, os resultados obtidos indicam que a perda simultânea de ETV6 e de CDKN1B, através de uma translocação cromossómica complexa, constituiu uma acção cooperativa na leucemogénese. A mesma noção pode aplicar-se ao caso com dic(9;12), no qual pelo menos 2 genes que codificam para factores de transcrição importantes na linhagem hematopoiética, PAX5 no cromossoma 9 e ETV6 no cromossoma 12, estavam deleccionados como resultado do rearranjo cromossómico. Dado que o factor de transcrição PAX5 regula negativamente a expressão do gene FLT3, que desempenha uma função pró-proliferativa, é expectável que a haplo-insuficiência de PAX5 no caso com dic(9;12) terá tido como consequência uma elevação dos níveis de expressão de FLT3, contribuindo deste modo para uma proliferação celular aumentada. A t(X;20;16) foi identificada num doente com trombocitémia essencial (TE), uma doença que está intimamente relacionada com alterações de vias intracelulares reguladas por citocinas. Neste caso, através da utilização de um array genómico, identificámos a presença de pequenas delecções associadas com os pontos de quebra nos cromossomas 16 e 20. No cromossoma 16 apenas um gene, MAF, estava deleccionado, enquanto no cromossoma 20 a delecção tinha abrangido 3 genes. Dos genes deleccionados, dois deles, NFATC2 (20q13) e MAF (16q23), codificam proteínas que operam como reguladores transcricionais de citocinas hematopoiéticas. Dado que NFATC2 se localiza numa região que constitui um alvo frequente de delecções em neoplasmas ieloproliferativos, incluindo a trombocitémia essencial,efectuámos um estudo detalhado do papel deste gene na proliferação megacariocítica e na regulação da expressão de uma citocina hematopoiética (GM-CSF), implicada na maturação das diferentes linhagens mielóides. Utilizando um modelo de linha celular de trombocitémia essencial, verificámos que a supressão do transcrito do gene NFATC2 in vitro, por interferência de RNA, estava associada com um aumento da proliferação celular. Em concordância, o bloqueio da activação da proteína NFATC2 através de um inibidor específico da sua interacção com a calcineurina, conduziu a um aumento da proliferação celular in vitro. Utilizando a PCR quantitativa em tempo real, detectou-se um aumento da produção do RNA de GM-CSF em ambos os ensaios celulares, indicando que o factor de transcrição NFATC2 pode regular negativamente a expressão de GM-CSF em células de trombocitémia essencial. No geral, estes resultados mostram que a redução dos níveis fisiológicos do transcrito NFATC2, ou a redução da respectiva actividade proteica, estão relacionados com a proliferação de megacariocitos através do aumento da produção de GM-CSF. De acordo com estes resultados, verificámos que as células dos doentes com TE apresentam níveis mais baixos do transcrito NFATC2 do que a população normal. Dado que o factor de transcrição MAF desempenha igualmente um papel como regular transcricional de citocinas, é plausível que a haplo-insuficiência dos genes NFATC2 e MAF, resultante do rearranjo cromossómico complexo t(X;20;16), teve um efeito cooperativo importante na patogénese da trombocitémia essencial através da alteração do padrão normal de expressão das citocinas hematopoiéticas. Em síntese, efectuámos nesta dissertação um estudo citogenético de 4 translocações cromossómicas complexas incluindo t(12;21;5), t(12;6;15), t(9;11;19) e t(X;20;16), e de uma translocação dicêntrica dic(9;12), associadas com diferentes neoplasmas hematológicos. Em casos seleccionados efectuámos também um estudo molecular detalhado das regiões dos pontos de quebra. Esta análise permitiu-nos identificar 2 genes, CCDC94 no cromossoma 19 e NFATC2 no cromossoma 20, cuja haplo-insuficiência pode promover o aumento da proliferação celular das células leucémicas. A partir destes estudos podem ser retiradas 2 noções principais: (i) Os pontos de quebra adicionais, que ocorrem em translocações complexas associadas com a formação de genes de fusão, podem ter como consequência a desregulação de genes controladores da proliferação celular (e.g., CCDC94); (ii) As translocações complexas caracterizadas pela ausência de genes de fusão recorrentes poderão estar preferencialmente associadas com a presença de delecções, envolvendo um ou mais genes, nos pontos de quebra; nestas situações, serão necessários pelo menos 2 genes com funções celulares semelhantes (e.g., NFATC2 e MAF) ou complementares (e.g., ETV6 e CDKN1B) para, quando deleccionados, promoverem de forma cooperativa a leucemogénese. Nestes termos, o modelo de alterações genéticas sequenciais que caracteriza o desenvolvimento do cancro pode ser substituído por um modelo em que vários genes-alvo são simultaneamente desregulados pela formação de uma translocação cromossómica complexa, evitando deste modo a necessidade de ocorrência de alterações genéticas subsequentes.----------------------ABSTRACT: Tumourigenesis is a multistep process which results from the accumulation of successive genetic mutations in a normal cell. In leukemia for instance, recurrent translocations play a part in this process by generating fusion genes which lead to the production of hybrid proteins with an oncogenic role. However, a minor subset of chromosomal translocations referred to as complex or variant involves extra breakpoints at variable genome locations in addition to those implicated in the formation of fusion genes. We aimed to describe in this work the role, if any, of genes located at extra breakpoint locations or which are affected by breakpoint-adjacent deletions through the study of 5 leukemia patients.Two of the patients presented with TV6(12p13)-RUNX1(21q22) and MLL(11q23)- MLLT3(9p22) fusion genes as a result of a t(12;21;5) and a t(9;11;19), respectively. Detailed molecular characterization of the extra breakpoint at chromosome 19 in the latter case revealed that a novel ubiquitously expressed gene, CCDC94, with a potential role in cell cycle regulation, was disrupted by the breakpoint. We demonstrated using in vitro cellular assays that this gene codifies for a nuclear protein which negatively regulates cell cycle progression. These data shows that extra breakpoint locations of complex translocations may result in haplo-insufficiency of critical proliferation genes, thereby cooperating with the generation of hybrid proteins to provide unrestrained cell proliferation. In the other 3 patients there were reakpoint-associated deletions which precluded the formation of putative fusion genes. In a case with a t(12;6;15) we characterized a deletion at 12p13 which eliminated ETV6 and 8 other genes including CDKN1B. These findings indicate that concomitant loss of ETV6 and CDKN1B, which encodes a cyclin-dependent kinase inhibitor responsible for blocking entry of cells into the G1 phase of the cell cycle, acted cooperatively to promote leukemogenic proliferation. The same notion applied to a case with a dic(9;12) in which 2 genes encoding hematopoietic transcription factors - ETV6 and PAX5 (9p13)- were deleted as a result of breakpoint-adjacent deletions. Similarly, we found that 2 transcription factor genes involved in the regulation of cytokine expression, NFATC2 (20q13) and MAF (16q23), were involved in deletions contiguous to the breakpoints in a patient with a t(X;20;16). In vitro suppression of NFATC2 mRNA or inhibiton of NFATC2 protein activity enhanced cell proliferation as a result of an increase in the production of a myeloid-lineage stimulating hematopoietic cytokine, GM-CSF. These results suggest that haplo-insufficiency of NFATC2 and MAF genes had a cooperative effect in inducing cell proliferation as a result of a disregulation of cytokine production. Two main conclusions may be drawn from our studies: (i) In complex translocations associated with the production of fusion genes, additional breakpoints may cooperate in tumourigenesis by targeting genes that control cell proliferation; (ii) In complex translocations associated with small breakpoint-adjacent deletions, at least 2 genes with similar or complementary functions need to be deregulated to promote tumourigenesis.

Avaliação do papel da glutationa e do vacúolo como mecanismos de defesa contra a toxicidade induzida pelo chumbo na levedura Saccharomyces cerevisiae

A presença de metais pesados no meio ambiente deve-se, principalmente, a actividades antropogénicas. Ao contrário do Cu e do Zn, que em baixas concentrações são essenciais para o normal funcionamento celular, não se conhece para o chumbo nenhuma função biológica. O chumbo apresenta efeitos tóxicos, e considerado possível agente carcinogéneo, sendo classificado como poluente prioritário pela Agencia de Protecção Ambiental dos EUA (US-EPA). O presente trabalho teve como objetivo avaliar o papel da glutationa e do vacúolo, como mecanismos de defesa, contra os efeitos tóxicos induzidos pelo chumbo, usando como modelo a levedura Saccharomyces cerevisiae. A levedura S. cerevisiae quando exposta a varias concentrações de chumbo, durante 3h, perde a viabilidade e acumula espécies reativas de oxigénio (ROS). O estudo comparativo da perda de viabilidade e acumulação de ROS em células de uma estirpe selvagem (WT) e de estirpes mutantes, incapazes de produzir glutationa devido a uma deficiência no gene GSH1 (gsh1) ou GSH2 (gsh2) mostrou que as estirpes gsh1 ou(gsh2 não apresentavam um aumento da sensibilidade ao efeito toxico do chumbo. No entanto, o tratamento de células da estirpe WT com iodoacetamida (um agente alquilante que induz a depleção de glutationa) aumentou a sensibilidade das células a presença de chumbo. Pelo contrário, o enriquecimento em GSH, através da incubação de células WT com glucose e uma mistura de aminoácidos que constituem a GSH (acido L-glutâmico, L-cisteína e glicina), reduziu o stress oxidativo e a perda de viabilidade induzida por chumbo. A importância do vacúolo, como mecanismo de defesa, foi avaliada através da utilização de um mutante sem qualquer estrutura vacuolar (vps16) ou de mutantes deficientes na subunidade catalítica A (vma1) ou B (vma2) ou no proteolítico - subunidade C (vma3) da V-ATPase. As células da estirpe ƒ´vps16 apresentaram uma elevada suscetibilidade a presença de chumbo. As células das estirpes deficientes na subunidade A, B ou c da V-ATPase, apresentaram uma maior perda de viabilidade, quando expostas a chumbo, do que as células da estirpe WT, mas menor do que a da estirpe vps16 Em conclusão, os resultados obtidos, no seu conjunto, sugerem que a glutationa esta envolvida na defesa contra a toxicidade provocada por chumbo; todavia, a glutationa, por si só, parece não ser suficiente para suster o stress oxidativo e a perda de viabilidade induzida por chumbo. O vacúolo parece constituir um importante mecanismo de defesa contra a toxicidade provocada por chumbo. A V-ATPase parece estar envolvida na compartimentação de chumbo no vacúolo.

Efeitos de Uma Sessão de Exercício Físico Associado à Microcorrente Abdominal na Seleção do Substrato Energético

Introdução: A acumulação de gordura na região abdominal acarreta um maior risco para a saúde. Objetivo(s): Analisar o efeito de um protocolo de uma sessão de exercício físico aeróbio associada à eletrolipólise no tecido adiposo da região abdominal nos valores do consumo e proporção dos substratos energéticos. É ainda objetivo avaliar as diferenças no consumo e proporção dos substratos energéticos, com o mesmo protocolo, no sexo feminino e no sexo masculino. Métodos: 38 participantes foram distribuídos aleatoriamente por dois grupos, o grupo experimental (9 feminino e 9 masculino) e o grupo placebo (11 feminino e 9 masculino). Ambos os grupos foram avaliados através das medidas antropométricas e foram sujeitos aos dois protocolos do estudo, o de microcorrente com aplicação 2 frequências (25 e 10Hz), 20 minutos cada, e o de exercício aeróbio a 45-55% frequência cardíaca de reserva. Contudo, no grupo placebo a microcorrente foi realizada sem intensidade. Para obtenção dos valores do consumo e proporção dos substratos foi utilizado o K4b2 durante o exercício físico. Resultados: Não se verificaram diferenças significativas nas quantidades de ácidos gordos, glucose e no quociente respiratório entre os grupos (ρ> 0,05). No entanto, parece haver uma tendência para um maior consumo de ácidos gordos após a aplicação da microcorrente durante o exercício físico. Conclusão: Os resultados deste estudo indicam que uma sessão de eletrolipólise associada ao exercício físico aeróbio não parece ser suficiente para influenciar a quantidade do consumo e a proporção dos substratos energéticos numa amostra de indivíduos jovens de ambos os sexos.

Estratégias de alimentação para a optimização do processo de produção de PHAs por via bacteriana

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Bioquímica

Produção de sideróforo pela bactéria Bacillus megaterium

Os agentes quelantes, como é o caso do EDTA, são utilizados numa ampla variedade de indústrias como a indústria têxtil, da pasta de papel, alimentar, de cosméticos ou de detergentes. Contudo, os agentes complexantes sintéticos, habitualmente usados, não são biodegradáveis, pelo que a sua acumulação no meio ambiente constitui motivo de preocupação. Deste modo, existe um interesse crescente na substituição destes compostos por compostos similares biodegradáveis sendo, deste modo, ambientalmente amigáveis. Alguns microrganismos são capazes de produzir moléculas com capacidade de captar metais. Um desses exemplos são os sideróforos: compostos produzidos por bactérias, fungos e plantas gramíneas, com capacidade de formar quelatos muito estáveis com o ferro. A presente dissertação teve como objetivo estudar o efeito de diferentes condições culturais e nutricionais na produção de sideróforo pela bactéria Bacillus megaterium. A avaliação da produção de sideróforo, utilizando o método colorimétrico Chrome Azurol S (CAS), durante o crescimento da bactéria, em meio de cultura deficiente em ferro, na presença de 5 ou de 20 g/L de glucose, mostrou que o início da sua produção ocorre, durante a fase exponencial de crescimento, não está relacionada com a esporulação e não é afetada pela concentração de glucose. Contudo, o crescimento da bactéria na presença de diferentes fontes de carbono (glicerol, frutose, galactose, glucose, manose, lactose, maltose ou sacarose) evidenciou que a produção de sideróforo é afetada pelo tipo de fonte de carbono. O crescimento na presença de glicerol promoveu a maior produção de sideróforo; efeito inverso foi observado na presença de manose. A bactéria B. megaterium, quando crescida na presença de frutose, galactose, glucose, lactose, maltose ou sacarose, produziu concentrações similares de sideróforo. O aumento da concentração de arginina, no meio de cultura, não aumentou a produção de sideróforo. A agitação apresentou um efeito positivo na produção de sideróforo; o crescimento em condições estáticas atrasou e diminuiu a produção de sideróforo. Em conclusão, o glicerol parece constituir uma fonte de carbono alternativa, aos monossacáridos e dissacáridos, para a produção de sideróforo. A agitação apresenta um efeito positivo na produção de sideróforo pela bactéria B. megaterium ATCC 19213.

Intervenção em situações de violência e indisciplina em alunos do ensino básico: Estudo de Caso

A indisciplina e a violência em contexto escolar têm sido uma preocupação social crescente e um assunto amplamente discutido sob diversas perspetivas. Pela complexidade de que se revestem e amplitude de implicações que acarretam, nomeadamente o insucesso escolar e as consequências psicossociais e individuais inerentes, os problemas ao nível do comportamento exigem cada vez mais uma resposta eficaz da comunidade escolar, que vê o seu funcionamento diário ser prejudicado. A acumulação de processos disciplinares evidencia a ineficácia dos sistemas punitivos, pelo que se impõe uma alternativa eficaz. Neste trabalho procuramos apresentar um programa de intervenção comportamental de caráter preventivo e que tem revelado eficácia em diversos contextos escolares. Pelo seu carácter proativo e cientificamente fundamentado, o sistema PBIS (Positive Behavioral Interventions and Supports) apoia-se em princípios da Psicologia Positiva e em dados empíricos e oferece um quadro operacional adaptável a qualquer instituição escolar. O estudo de caso apresentado apresenta intervenções de nível dois e três que, mesmo sem a implementação do nível um de base, revelaram resultados bastante positivos, pelo que há evidências de que seria benéfico para as escolas a introdução destes sistemas no combate diário, constante e preocupante à indisciplina.

Prevalência de obesidade infanto-juvenil : associação com os hábitos alimentares, actividade física e comportamentos sedentários dos adolescentes escolarizados de Portugal Conti

RESUMO Nos países industrializados observam-se elevadas prevalências de pré- obesidade e obesidade em jovens e adolescentes, com consequências negativas para a saúde. A obesidade é apontada como o distúrbio nutricional mais frequente em crianças e adolescentes nos países desenvolvidos e é resultado da acumulação excessiva ou anormal de gordura no tecido adiposo. Segundo a I.O.T.F. considera- se que uma criança tem pré-obesidade quando o seu percentil de I.M.C. está entre o p88 e p99 para as raparigas e entre o p90 e o p99 para os rapazes. Considerase que tem obesidade quando o percentil de I.M.C. é superior ao p99, para ambos os sexos. A prevalência de pré-obesidade e obesidade em crianças e adolescentes tem vindo a aumentar a nível mundial a um ritmo alarmante, sobretudo nos países desenvolvidos e em alguns segmentos de países em desenvolvimento. Estudos demonstram que a obesidade em crianças e adolescentes se encontra fortemente correlacionada com o aumento da morbilidade e mortalidade, reflectindo-se numa variedade de situações patológicas com risco de persistência no adulto. Dada a sua extrema importância em termos de Saúde Pública, as tendências para a pré- obesidade e obesidade em crianças e adolescentes devem ser monitorizadas com especial atenção. Os hábitos alimentares e o gasto energético são factores que influenciam a obesidade e o seu controlo. Há estudos que concluem que existe uma associação directa entre estes factos e a presença de obesidade e outros apresentam conclusões contrárias. Pretendeu-se determinar a prevalência de excesso de peso (pré-obesidade e obesidade) infantojuvenil em Portugal e associá-la com os hábitos alimentares, actividade física e comportamentos sedentários dos adolescentes. A população em estudo é todos os adolescentes, de ambos os sexos, que frequentam o ensino básico (2º e 3º ciclos) e secundário oficial de Portugal Continental (n=5708). Todos os elementos em estudos foram avaliados antropometricamente (peso e altura) e responderam a um questionário de hábitos alimentares e frequência alimentar, actividade física e comportamentos sedentários. Como resultados do estudo verificou-se que a prevalência de pré- obesidade infanto-juvenil em Portugal é de 22,6% e a prevalência de obesidade de 7,8%. Quer a obesidade quer a pré-obesidade apresentam indicadores superiores nos rapazes (p=0,01) e nos adolescentes mais jovens (p=0,00). Em relação aos hábitos alimentares estudados é de referir que a frequência de consumo de refeições fora de casa é muito similar entre o grupo normoponderal e o grupo com excesso de peso sendo a refeição da ceia consumida por um número muito superior de adolescentes normoponderais comparativamente com os que apresentam excesso de peso (p=0,01). Em relação à ingestão de determinados alimentos ou grupos alimentícios, verificou-se que, regra geral, o consumo de alimentos de características nutricionais de baixa qualidade (gordura saturada, sal e açucares simples) era superior no grupo normoponderal comparativamente ao grupo com excesso de peso (refrigerantes, snacks, fast-food, cereais açucarados, sobremesas doces) (p<0,05). Em relação à actividade física, o número de horas semanais de actividade física diminui do grupo normoponderal para o grupo com excesso de peso. Dentro do grupo com excesso de peso, os obesos apresentam ainda uma média inferior em relação aos pré-obesos. Poderemos afirmar que quanto maior o índice de actividade física menor o percentil de I.M.C., mostrando-se assim a actividade física como um factor protector de um peso saudável (p<0,05). Quando solicitado que caracterizassem o estilo de vida e a habilidade desportiva, verificou-se que nos grupos com excesso de peso se caracterizavam em indicadores mais baixos do que os normoponderais (p<0,05). No que diz respeito aos comportamentos sedentários, verifica-se que são mais prevalentes nos grupos com excesso de peso do que no grupo normoponderal (p<0,05). Em conclusão, os resultados da prevalência de obesidade obtidos assemelham-se aos resultados obtidos noutros estudos, constituindo um dado revelador de uma situação bastante preocupante em termos de Saúde Pública. Em relação aos hábitos alimentares as diferenças não são significativas entre os diferentes grupos (normoponderal, pré-obesidade e obesidade). A actividade física apresentou-se como um factor protector do aumento de peso com uma associação directa com o estado nutricional (I.M.C.). Verificou-se que os adolescentes em Portugal que apresentavam indicadores mais elevados de actividade física eram aqueles que se encontravam com peso normal. Os comportamentos sedentários apresentaram-se como um factor propício ao desenvolvimento do excesso de peso estando directamente relacionados com o percentil de I.M.C. Os comportamentos sedentários mais frequentes são o visionamento televisivo e o computador/internet. Assim, poder-se-á fundamentar a necessidade de medidas interventivas a este nível com o intuito de controlar os indicadores encontrados. ABSTRACT In the industrialized countries high prevalences of pre-obesity and obesity are observed in youngsters and adolescents, with negative health consequences. Obesity is pointed as the most frequent nutritional disturbance in children and adolescents in developed countries and results from the excessive or abnormal accumulation of fat in the adipose tissue. According to the IOTF a child is pre-obese when the BMI percentile is between p88 and p99 for girls and between p90 and p99 for boys. Obesity is considered when the BMI percentile is above p99 for both sexes. The prevalence of pre-obesity and obesity in children and adolescents has been rising alarmingly worldwide, especially in developed countries and some segments of developing countries. Studies indicate that obesity in children and adolescents is strongly associated with increased morbidity and mortality resulting in a variety of pathological situations with risk of persistence in adulthood. Given its major Public Health importance, pre-obesity and obesity trends in children and adolescents should be monitored with special attention. Eating habits and energy expenditure are factors that influence obesity and its control. Some studies conclude that there is a direct association between these factors and the presence of obesity and others present opposite conclusions. It was intended to determine the prevalence of overweight (pre-obesity and obesity) in children and youth in Portugal and to associate it with eating habits, physical activity and sedentary behaviors of adolescents. The population in study is constituted by all adolescents of both sexes that attend basic (2nd and 3rd grade) and secondary official education of continental Portugal (n=5708). All participants in study were anthropometrically evaluated (weight and height) and answered a questionnaire of eating habits and food frequency, physical activity and sedentary behaviors. The study results indicate a prevalence of pre-obesity in children and youth in Portugal of 22.6% and a prevalence of obesity of 7.8%. Both obesity and pre-obesity present higher indicators in boys (p=0.01) and younger adolescents (p=0.00). In relation to the studied eating habits it should be noted that the frequency of consumption of meals away from home is very similar between the normal weight group and the overweight group. Moreover, the supper meal is consumed by a much larger number of normal weight adolescents as compared to the ones with overweight (p=0.01). Regarding the intake of certain foods or food groups, it was found that, in general, the consumption of foods with characteristics of low nutritional quality (saturated fat, salt and simple sugars) was higher in the normoponderal group compared with the overweight group (soft drinks, snacks, fast-food, sugary cereals, desserts) (p<0.05). In respect to physical activity, the number of weekly hours of physical activity decreases from the normoponderal group to the group with overweight. Within the group with overweight, obese subjects also present a lower average than pre-obese subjects. As we can affirm that the higher the physical activity index the lower the BMI percentile, physical activity appears as a protective factor for a healthy weight (p<0.05). When they were asked to characterize their lifestyle and sports ability, it was found that overweight groups characterized themselves with lower indicators than the normoponderal group (p<0.05). Regarding sedentary behaviors, it appears that they were more prevalent in groups with overweight than in the normoponderal group (p<0.05). In conclusion, the results of the obesity prevalence attained are similar to the results obtained in other studies, revealing a very worrying situation in terms of Public Health. In relation to the eating habits there were no significant differences between the groups (normoponderal, pre-obesity and obesity). Physical activity appears as a protective factor from weight gain with a direct association with nutritional status (BMI). It was found that young people in Portugal who had the highest indicators of physical activity were those who presented normal weight. The sedentary behaviors were presented as a factor conducive to the development of overweight being directly related to the BMI percentile. The most frequent sedentary behaviors were television viewing and computer/internet

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RESUMO: Sessenta e três derivados de hidantoína foram utilizados para avaliar possíveis efeitos de modulação na actividade das bombas de efluxo (BE) na Salmonella NCTC 13349 utilizando um método fluorimétrico semi-automático. Nenhum dos compostos apresentaram actividade anti-bacteriana até concentrações de 240 mg/L. Entre todos os compostos, SZ-7 demonstrou possuir propriedades de modulação de effluxo na presença de glucose. Para testar esta actividade, estirpes de Salmonella resistentes à ciprofloxacina, induzidas a elevados níveis de resistência com sobre-expressão de BE, foram expostas ao SZ-7. Este derivado afectou a susceptibilidade das estirpes à ciprofloxacina. Uma vez que os 63 compostos estudados apresentaram pouco efeito inibitório /cumulativo, apesar de serem conhecidos pelos seus efeitos moduladores de BE-dependentes de iões em eucariotas, foi questionado o papel dos iões na regulação de BE bacterianas, que poderão influenciar a eficácia de novos compostos. Para este estudo, utilizamos a Escherichia coli AG100 como modelo, devido ao extenso conhecimento no que respeita a estrutura e actividade das BE. Devido à importância de iões de cálcio (Ca2+) nos canais de transporte membranar e na actividade de ATPases, a sua actividade na modulação do efluxo foi investigada. De resultados anteriormente obtidos concluiu-se que a pH 5 o efluxo é independente de energia metabólica; contudo, a pH 8 é absolutamente dependente, sendo que o Ca2+ é indispensável para manter a actividade das ATPases bacterianas. A acumulação/effluxo de EtBr pela E. coli AG100 foi determinada na presença/ausência de Ca2+, clorpromazina (inibidor de ligação de Ca2+ a proteínas), e ácido etilenodiamino tetra-acético (quelante de Ca2+). Acumulação/effluxo aumentou a pH 8, contudo o Ca2+ reverte estes efeitos evidenciando a sua importância no funcionamento das BE bacterianas. Em resumo este trabalho colocou em evidência que muitos aspectos bioquímicos e bioenergéticos devem ser tomados em consideração no estudo da resistência bacteriana mediada por BE.------- ABSTRACT: Sixty-three hydantoin derivatives were evaluated for their modulating effects on efflux pump (EP) activity of Salmonella NCTC 13349 utilizing a semi-automatic fluorometric method. None of the compounds presented antibacterial activities at concentrations as high as 240 mg/L. Among all compounds, SZ-7 showed possible efflux modulating activity in the presence of glucose, indicative of a potential EP inhibitor. To verify its potential effects, ciprofloxacin-resistant Salmonella strains, induced to high level resistance with over-expressing EPs, were exposed to SZ-7. This derivative affected the susceptibility of the ciprofloxacin-resistant strains. Since the 63 compounds studied had very low inhibitory/accumulative effects, even though their known for being efficient in modulating ion-driven eukaryotic EPs, we questioned whether ions had a leading role in regulating bacterial EPs, influencing the effectiveness of new compounds. For this study we used Escherichia coli AG100 as a model, due to the extensive knowledge on its EPs structure and activity. Owing the importance of calcium ions (Ca2+) for membrane transport channels and activity of ATPases, the role of Ca2+ was investigated. From previous results we concluded that at pH 5 efflux is independent of metabolic energy; however, at pH 8 it is entirely dependent of metabolic energy and the Ca2+ ions are essential to maintain the activity of bacterial ATPases. Accumulation and efflux of ethidium bromide (EtBr) by E. coli AG100 was determined in the presence and absence of Ca2+, chlorpromazine (inhibitor of Ca2+-binding to proteins), and ethylenediaminetetraacetic acid (Ca2+ chelator). Accumulation of EtBr increased at pH 8; however Ca2+ reversed these effects providing information as to the importance of this ion in the regulation of bacterial EP systems. Overall this work puts in evidence that many biochemical and bioenergetic aspects related to the strains physiology need to be taken into consideration in bacterial drug resistance mediated by EPs.