Cultura de tecidos e análise fitoquímica de Arachis repens HANDRO.

Os representantes do gênero Arachis são conhecidos como amendoim, e suas sementes possuem grande quantidade de óleos e proteínas, podendo ser consumidas cruas. A espécie mais cultivada do gênero é Arachis hypogaea, que possui grande importância comercial. Outras espécies são também utilizadas para controle das ervas daninhas e cobertura do solo, assim como ornamentais e na alimentação. Arachis repens, popularmente conhecida como grama amendoim, é utilizada como planta ornamental, na formação de pastagens, como forragem e para cobertura do solo em substituição a várias espécies comuns de grama. Diversas substâncias bioativas têm sido identificadas em A. hypogaea. Contudo, estas substâncias ainda não foram descritas em outras espécies do gênero. O objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de sistemas de cultivo in vitro para Arachis repens, visando à micropropagação e à análise comparativa da produção de resveratrol em extratos alcoólicos dos materiais produzidos in vitro, em comparação com as plantas in vivo. Segmentos nodais, internodais e foliares foram excisados de plantas in vitro e inoculados em meio MS suplementado com diferentes concentrações de BAP, TDZ, AIA e KIN, utilizados isoladamente ou em combinação. Os explantes apresentaram respostas distintas de acordo com o regulador de crescimento utilizado. Na presença de BAP foi observada a formação de calos compactos, com formação de brotos em diferentes taxas. Na presença de TDZ, segmentos nodais e internodais formaram calos compactos em todas as concentrações. Segmentos nodais cultivados na presença de diferentes concentrações de AIA em combinação com KIN apresentaram a formação de calogênese. Foi também realizada uma avaliação da atividade antioxidante e a presença de fenóis totais em extratos de diferentes materiais in vivo e produzidos in vitro. Nas análises por meio de CLAE, foi possível detectar a presença de resveratrol tanto nos materiais in vivo, quanto os produzidos in vitro. Dessa forma, o trabalho forneceu resultados preliminares sobre as possibilidades de utilização de A. repens para a produção de metabólitos especiais.

Determinação de atividade antioxidante, compostos fenólicos totais e teor de resveratrol em cinco cultivares brasileiras de Arachis hypogaea L. com a utilização de duas metodologias extrativas

O amendoim A. hypogaea L. é a quarta oleaginosa mais consumida no mundo e suas sementes são altamente energéticas, com grandes quantidades de lipídios, proteínas, vitaminas e carboidratos. Diversas atividades farmacológicas já foram observadas em extratos de raízes, folhas e sementes, sendo a principal delas a atividade antioxidante. Neste trabalho, foi realizada a comparação entre duas metodologias (por maceração e assistida por micro-ondas) para a extração de compostos antioxidantes, incluindo o resveratrol. Também foi realizada a comparação entre extratos de diferentes órgãos de cultivares brasileiras (IAC 886, IAC Caiapó, IAC Tatu ST, IAC 8112 e IAC 99-1) quanto à atividade antioxidante, por DPPH, ao teor de compostos fenólicos, por Folin-Ciocalteu, e ao teor de resveratrol, por HPLC. Por fim, foram estabelecidos protocolos de cultura de tecidos para explantes de sementes, visando à produção de calos e plantas in vitro para posterior dosagem de compostos de interesse, tendo em vista a possibilidade de modulação das condições in vitro. As melhores condições determinadas para a extração por maceração de antioxidantes de A. hypogaea foram 80% de etanol em água como solvente, trituração com almofariz e pistilo, 50 mL solvente por grama de material vegetal seco, 120 minutos de incubação e dois estágios de extração. As melhores condições para a extração de resveratrol assistida por micro-ondas foram o uso de 37 mL de solvente/g material vegetal seco, com agitação de 1200 rpm por 15 minutos, a 37C. De uma maneira geral, os extratos de raízes e oriundos de micro-ondas apresentaram maior atividade antioxidante (até 92,36 2,71%), teor de compostos fenólicos (até 54,15 1,39 mg EAG/g extrato) e teor de resveratrol (até 1,614 0,356 mg/g extrato). Dentre as cultivares estudadas, IAC Tatu e IAC 99-1 foram as que apresentaram os teores mais elevados. Brotos e calos friáveis foram obtidos a partir de cotilédones, eixos embrionários e folíolos embrionários cultivados em meios suplementados com BAP e picloram, respectivamente.

Avaliação do potencial leishmanicida e antibacteriano de Annona mucosa (Jacq.) - Annonaceae cultivada in vitro e in vivo

A biodiversidade brasileira abrange plantas de importância medicinal que podem ser utilizadas na formulação de novos fármacos. Contudo, tem sido reduzida em velocidade alarmante, em função de diferentes ações antrópicas. A cultura de tecidos vegetais propicia a conservação e uso do germoplasma permitindo a obtenção de substâncias de importância medicinal. As leishmanioses são consideradas um problema de saúde pública mundial sendo a espécie Leishmania braziliensis de maior importância epidemiológica no Brasil. Recentemente tem-se registrado aumento da resistência à linha de tratamento usual. Do mesmo modo, o uso indiscriminado de antibióticos levou ao aumento de bactérias multirresistentes, que representam sério risco de infecção. A espécie Annona mucosa (Jacq.) possui substâncias, como acetogeninas e alcaloides, que apresentam atividades antiparasitária e antimicrobiana. Nesse sentido, o objetivo do trabalho foi avaliar o potencial leishmanicida e antibacteriano de extratos de A. mucosa de material produzido in vitro e in vivo. Foi proposto um protocolo de germinação in vitro, ainda não reportada para a espécie, com vistas à obtenção de plântulas axênicas. Em meio WPM foram cultivados explantes hipocotiledonares e foliares em meio MS, suplementados com PIC e diferentes concentrações de KIN, BAP ou TDZ. Os calos obtidos foram cultivados em meio líquido de mesma composição para a produção de suspensões celulares. Os materiais foram submetidos à extração metanólica e posterior fracionamento em hexano e diclorometano. Para a avaliação da atividade dos extratos sobre L. braziliensis foi usado o modelo in vitro, com a forma promastigota, e in vivo na forma amastigota, a partir do tratamento de macrófagos peritoneais de camundongos infectados com o parasito. Ambas as formas foram tratadas com os extratos por 96 e 48h, respectivamente. A atividade antimicrobiana foi avaliada por macrodiluição do extrato em Mueller-Hinton, sendo avaliado o crescimento das cepas após 16h de incubação a 48C. A germinação in vitro da espécie foi alcançada em substrato vermiculita estéril umedecido com solução de sais do meio MS, com taxa média de 85%. A maior produção de calos friáveis foi obtida em meios contendo KIN, com potencial uso para cultivo em suspensões celulares. Os extratos do material in situ e in vitro apresentaram atividade leishmanicida, apesar da toxicidade para macrófagos. Culturas de células em suspensão apresentaram potencial leishmanicida in vitro e redução da infecção em macrófagos. Os extratos do material avaliado apresentaram atividade antimicrobiana seletiva, com inibição do crescimento de Streptococcus pyogenes e Bacillus thurigiensis em diferentes concentrações avaliadas. Os métodos biotecnológicos empregados permitiram a obtenção de materiais com propriedades medicinais para as atividades leishmanicida e antibacteriana, assim como o material in vivo, constituindo este estudo o primeiro relato para as atividades propostas em A. mucosa.

A leptina regula a proliferação celular e a apoptose na próstata humana

A hiperplasia prostática benigna (HPB) é a doença na qual a próstata demonstra um crescimento anormal e sua prevalência aumenta com o envelhecimento. Leptina, a adipocina mais notável, tem um importante papel na regulação do sistema reprodutivo. Esse trabalho tem por fim avaliar o papel da leptina no tecido prostático humano, utilizando a cultura de tecido in vitro, avaliando a proliferação celular e a expressão dos genes do fator de crescimento do fibroblasto 2 (FGF2), da enzima aromatase e dos genes apoptóticos. De 2009 a 2011, amostras de tecido hiperplásico humano foram obtidas pela prostatectomia transvesical em quinze pacientes com próstatas de volume aumentadas. Cada amostra foi dividida em quatro partes simétricas, mantidas no meio RPMI suplementado com soro fetal bovino a 10%, e 1ng/mL de gentamicina, adicionados a 16 ng/mL de leptina (Leptina) ou não (Controle). Após três horas a expressão dos genes de FGF2, aromatase, Bax, Bcl-x e Bcl-2 foram avaliados por RT-PCR em tempo real. A proliferação celular foi avaliada por imunohistoquímica para PCNA. O tratamento com leptina levou a um aumento na expressão de Bax (C=0.40.1; L=0.90.2; p<0.05), enquanto as expressões de Bcl-2 (C=19.95.6; L=5.61.8; p< 0.05) e Bcl-x (C=0.20.06; L=0.070.02; p<0.05) foram significativamente reduzidas. Não houve alteração significativa na expressão de FGF2, enquanto a expressão da aromatase foi significativamente (C=1.90.6; L=0.40.1; p<0.04) reduzida. A leptina também levou a um aumento na proliferação celular (C=21.80.5; L=64.80.9; p<0.0001). Dessa forma, concluímos que a leptina tem um importante papel na manutenção do crescimento fisiológico da próstata, desde que estimula tanto a proliferação celular como a apoptose, com diminuição na expressão do gene da aromatase.

Conservação in vitro de germoplasma de Petiveria alliacea L. utilizando cultura de tecidos e criopreservação

A implementação de estratégias visando à conservação de espécies medicinais apresenta grande importância, tanto do ponto de vista ecológico quanto econômico. Petiveria alliacea L., espécie da família Phytolacaceae, conhecida como guiné, erva-de alho, erva-tipi ou amansa-senhor, pode ser encontrada desde a América Central até a América do Sul. Esta espécie possui ampla utilização medicinal, devido à presença, em sua composição, de vários polissulfetos, como o DTS (dibenziltrissulfeto), com propriedades antifúngica, antineoplásica e imunomodulatória, entre outras. O objetivo deste trabalho foi a conservação in vitro de germoplasma de Petiveria alliacea obtido de diferentes populações ocorrentes no Rio de Janeiro, através de métodos baseados em cultura de tecidos e criopreservação. Plantas obtidas através da germinação in vitro foram utilizadas como matrizes para a micropropagação através da multiplicação de meristemas pré-existentes em meio MS sem reguladores de crescimento, e embriões somáticos foram obtidos de forma direta a partir da cultura de explantes foliares das linhagens estudadas (Magé MG; Marechal Hermes MH; Niterói NT; Vila Isabel VI e Planta envasada AL), em presença de PIC (20μM) e 2,4D (22,6 μM), após 60 dias de cultivo. Os ápices caulinares das plantas micropropagadas e os embriões somáticos obtidos foram submetidos à criopreservação através de técnicas de vitrificação, encapsulamento-vitrificação e encapsulamento-desidratação, com a avaliação da pré-cultura e de soluções crioprotetoras (PVS2 e PVS3), em diferentes concentrações e tempos de exposição. Os resultados mostraram uma taxa de 100% de germinação in vitro. As condições para a pré-cultura de ápices foram padronizadas, entretanto não foram obtidos resultados positivos após o descongelamento. Por outro lado, os embriões da linhagem AL (linhagem embriogênica em cultura há 24 meses) mantiveram sua capacidade multiplicativa (100%) (embriogênese secundária) quando submetidos à desidratação em sacarose (0,5M) e expostos às soluções de vitrificação PVS2 e PVS3 pelos menores tempos (15 e 30 minutos). Os diferentes meios de recuperação apresentaram respostas variáveis em relação à capacidade multiplicativa dos embriões. O encapsulamento/vitrificação foi a técnica que promoveu maior tolerância dos embriões ao congelamento. A recuperação dos embriões através de multiplicação após a criopreservação abre uma perspectiva de conservação de genótipos com alta produção de polissulfetos, de interesse para a indústria farmacêutica

Detecção de anticorpos séricos produzidos contra as proteínas do bacteriófago 17 do Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) é uma bactéria associada à Periodontite Agressiva (PA). Ela invade tecidos moles, com ocorrência de lisogenia e bacteriófagos presentes em até 69% das subespécies. Estudos in vitro sugerem que a indução do bacteriófago (Aa17) ocorre numa co-cultura de Aa lisogênico com fibroblastos humanos. Se esta interação ocorre in vivo, com liberação do vírus, uma reação imunológica contra o Aa17 aconteceria. O objetivo deste estudo é constatar se anticorpos (AC) contra proteínas do Aa17 existem e estão associados à doença periodontal. Um objetivo adicional foi testar a resposta de AC contra os sorotipos do Aa. 52 indivíduos participaram: 31 com PA, 5 com Periodontite Crônica (PC) e 16 com Periodonto Saudável (PS). Soro foi coletado após a classificação clínica. As proteínas do Aa17 foram obtidas de preparações purificadas. As subespécies do Aa utilizadas para amostras de proteínas através de sonicação foram: 43717(American Tissue Culture Collection - ATCC) sorotipo A, 43718 (ATCC) sorotipo B, 33384 (ATCC) sorotipo C, IDH781 sorotipo D, NJ9500 sorotipo E and CU1000 sorotipo F. As proteínas foram separadas em géis de poliacrilamida e transferidas para membranas de nitrocelulose. As reações de Western-blotting ocorreram com o AC primário sendo o soro de cada indivíduo. Todas as membranas foram lidas pelo sistema Odyssey que captura sinais no AC secundário (antihumano). A resposta de AC contra ao menos uma proteína do Aa17, assim como pelo menos um sorotipo do Aa foi observado em todos, com exceção de dois indivíduos (com PS), participantes. Um indivíduo do grupo PC e três do PA tiveram resposta de AC contra alguns, mas não todos os sorotipos do Aa. A resposta de AC contra todos os sorotipos foi o achado mais comum nos grupos PA (28/31), PS (14/16) e PC (4/5). A resposta de AC contra o complexo de proteínas do Aa17 foi observado em 7 indivíduos com PA, 2 com PC e 6 com PS. A presença de AC contra qualquer proteína do Aa17 tem significância estatística (p= 0,044), assim como a resposta de AC contra o sorotipo C (p= 0,044). Reações intensas foram vistas quando o soro reagiu contra proteínas do sorotipo C; em alguns casos um sinal tão forte que cobriu a maioria da faixa. Essa resposta intensa esteve presente em 17, 3 e 1 dos indivíduos com PA, PC e PS e tem significância estatística entre os grupos PA e PS (p= 0,001). A resposta de AC contra uma proteína do Aa17 ou seu complexo foi observado em todos os grupos. Esse achado sugere que a indução in vitro do Aa17 poderia também ocorrer in vivo, embora não sendo necessariamente associada à periodontite. A resposta de AC contra vários sorotipos do Aa foi um achado comum e não associado com a doença. Entretanto, a presença e a intensidade da resposta de AC contra o sorotipo C está associada à PA.

Produção in vitro, análise fitoquímica e avaliação da atividade antineoplásica de metabólitos de Hovenia dulcis Thunb. (Rhamnaceae) obtidos por diferentes estratégias biotecnológicas

Hovenia dulcis Thunberg, natural da Ásia Oriental, é cultivada no Brasil onde é conhecida como uva-do-japão. A espécie possui várias indicações na medicina popular e alguns estudos apontam o seu potencial antineoplásico, tripanocida e hepatoprotetor. Metabólitos secundários são substâncias não essenciais para a sobrevivência celular, mas que fornecem vantagens adaptativas aos vegetais, sendo atribuído, para algumas delas, atividades biológicas importantes. Substâncias de interesse medicinal têm sido obtidas por técnicas da cultura de tecidos vegetais, como a calogênese e a cultura de células em suspensão, que permitem a síntese de matéria-prima de forma contínua e homogênea, independentemente de fatores ambientais e sazonais. O presente estudo objetivou o estabelecimento de culturas in vitro de H. dulcis, visando à produção de metabólitos de interesse, com vistas à avaliação do seu potencial antineoplásico sobre células K562. Foram testados protocolos para o estabelecimento de diferentes sistemas, como culturas de calos, de células em suspensão (CCS) e compact callus clusters (CCC) e ainda a avaliação do uso de elicitores na otimização de metabólitos produzidos in vitro. Foi verificado que a adição dos fitorreguladores KIN e TDZ, substituindo o BAP, não foi capaz de induzir a formação de calos friáveis, bem como a manutenção das culturas em ausência de luz. O uso do nitrato de prata promoveu a friabilidade de calos em todas as concentrações testadas, considerando-se 2,0 mg.L-1 a melhor concentração. Foram alcançadas taxas de 100% de formação de CCS tanto na presença, quanto em ausência de AgNO3. O maior acúmulo de biomassa foi verificado na concentração mais baixa de PIC (0,625 mg.L-1). A análise dos espectros de RMN indicou a presença de (+)-dihidromiricetina, (+)-galocatequina, hovenitina II, hovenosideo G, hodulosideo III, hodulosideo IV, hodulosideo I e hovenidulciosideo B1 nas culturas de calos friáveis. No estabelecimento de culturas CCC, observou-se a formação de calos compactos verdes em todas as concentrações de ANA testadas. O aumento da velocidade de rotação para 135 rpm aumentou a dispersão das células com consequente formação dos agregados celulares desejados. A seleção de linhagens celulares demonstrou ser um método eficiente na uniformização do tamanho desses agregados e tal uniformidade se manteve estável por mais de cinco subcultivos em 100% das culturas. Uma fração rica em saponinas foi obtida a partir dos agregados celulares, correspondendo a 1,46% da massa seca. A análise por RMN sugeriu a presença das saponinas Hovenosideo G e dos hovenidulciosideos A2 e B2. O uso de elicitores em cultura de calos mostrou-se adequado à produção de metabólitos secundários, sem alterações morfológicas nos mesmos. A elicitação alterou o perfil cromatográfico analisado por HPLC. Na elicitação com 5,0 mg.L-1 de extrato de levedura foi verificado um aumento de quase três vezes (12,280 3,396 equivalentes de quercetina/mg de extrato) na síntese de flavonoides. Finalmente, os estudos de ação antitumoral in vitro demonstraram citotoxicidade dos extratos de calos não elicitados de H. dulcis sobre linhagem de leucemia mieloide crônica (IC50 de 74,05 μg.mL-1.) e inibição do crescimento de tais células (K562), sugerindo o potencial antineoplásico para um produto biotecnológio (calo) desta espécie.

玉米原生质体培养、超低温保存和组织培养的研究

本文叙述了两个玉米基因型（小八趟×水白和白17）原生质体培养的植株再生;用基因型（小八趟×水白）为材料研究影响玉米原生质体培养的各种因素，并此基因型的原生质体经超低温保存后获得植株再生;以及用多种基因型玉米幼胚为材料诱导愈伤组织与植株再生。 影响玉米原生质体游离、分裂与植株再生的因素是多方面的。酶液组合0.2% Onozuka RS + 1% Hemicellulase + 0.1% Pectolyase，利用继代8-16天的愈伤组织，所获原生质体的数量与质量最佳。在原生质体植板率方面，结果表明：N6作为基本培养基是理想的;氮源中，NO3-具有明显的促进作用，而NH4+具有明显的抑制作用;有机氮源是不能缺少的，所使用的四种有机氮源中L-脯氨酸效果最明显。2,4-D浓度以1.0 mg/l最佳。原生质体培养后的渗透压浓度降低的时间以培养四星期后为宜。利用三步诱导，成功地获得胚胎发生的植株再生，并且还指出原生质体起始材料的保存年限大大影响原生质体所再生愈伤组织的分化。 采用上述筛选出的最佳游离、培养以及植株再生的方法，成功地培养了基因型（白17）的原生质体，并获得植株再生。原生质体再生细胞培养4-5天后开始一次分裂;培养15天后，植板率为3-4%。一个月后，原生质体所再生的肉眼可见的愈伤组织，分步转至分化培养基。最后，愈伤组织通过胚胎发生获得植株再生，频率约10%。 玉米原生质体，利用5%DMSO与0.55 M葡萄糖作为混合保护剂，经慢速（1 ℃/分钟）降至－40 ℃，停留二小时后直接投入液氮保存。保存3天后，原生质体在40 ℃的温水浴中快速化冻，成活率高达30-40%。成活原生质体培养后生长正常，植板率高达8-10%。培养5-6星期后，再生愈伤组织转至分化培养基;最后获得植株再生，频率为5-10%。 本文最后叙述了玉米七种基因型的幼胚诱导获得愈伤组织，再生植株频率可达70-80%。 上述各方面的研究结果，对玉米的遗传操作和细胞抗寒性研究、生理代谢的研究等都是十分有价值的。

多效唑（MET）在玉米组培中的作用及机理研究

多效唑（MET）是一种新型的植物生长调节剂．本文以多杆多穗青饲玉米为材料详细地研究了它征组织培养中的作用和生物学效应，并对它的作用机理也进行了初步的探讨。 研究结果表明：(1)适宜浓度的MET能够提高不同外植体愈伤组织的诱导率;(2)2～4 mg／lMET能改善愈伤组织的质量，提高愈伤组织的分化率、绿苗形成率、根的形成率和正常苗／异常苗的比值;（3）壮苗培养，MEP能使再生苗形态结构和生理等方面均发生较大的变化，并使其生长健壮，根系发达，移裁入土后成活率提高，达80%以上;（4）在再生苗的长期保存中，MET也具有良好的作用效应;(5)在继代培养中，MET处理后，愈伤组织的生长值下降;过氧化物酶活性和IAA氧化酶活性增加， 内源乙烯的释放量上升;外源GA3可逆转MET的作用效应，IAA、kt、ABA没有逆转效应，相反，ABA与MET对抑制愈防组织的生长具有加成效应．MET的作用机班可能是：通过改变细胞内酶的活性和内源激素的含量水平来控制愈伤组织细胞的生长、分化以及再生植株的生长和发育。 MET在玉米组培中所表现出的良好的作用效应表明：对于解决植物组织培养中所普遍存在的一些问题，用MET处理可能会变成一种有效的方法。展示出MET在植物生物技术领域也具有广泛的应用前景。

菘蓝组织培养及植株再生研究

本实验通过对菘蓝(Tsatis Japanica）的六种外植体进行培养并诱导分化，研究了不同的外植体在相同培养条件下器官分化的不同状况并以分化周期最短、分化频率最高的根外植物为实验材料，通过改变外源激素的配比和浓度，以及其池培养条件的变化来控制外植体定向分化．对培养根段中不定芽的发生途径，做了完整的组织学和扫描电镜观察，并用不定芽做了人工种子的包埋，初步进行j，菘蓝人工种子的研究。

诱导风信子（Hyacinthus orientalis L.）同一花被外植体不同部位细胞分化花芽的研究--外源激素的作用及内源激素的变化

诱导风信子（Hyacnthus orientalis L．）同一花被外植体上不同部位细胞分化花芽，从外源激素的作用和内探激素的变化探讨细胞脱分化启动的原因，研究了不同外源激素的组合下同一花被不同部位花芽分化的诱导频率：测定了花被上、中，下三部位切块离体培养前后的内源IAA和Z+ZR的含量;在此之前研究了GC-MS．MIM内标法测定微量植物材料内源IAA含量的可行性． GC-MS．MIM内标法是测定微量（0.5-1g）植物材料内源IAA含量的一种比较理想的方法，所需材料量一般为0.58．这一方法的材料前处理采用粗提液用C18Sep-pak柱初步分离纯化．HPLC进一步纯化，能获得纯度高的样品，且操作简便，省时省力． 风信子同一花被不同部位细胞均能分化花芽．当培养基中附加2.0mg/l Zeatin或2.0mg/16-BAP时，随着外探IAA浓度从0升高到10.0mg/l．捆胞分化花芽的部位从花被下部向上部移动。 离体培养前后同一花被上、中、下三部位内源IAA和Z+ZR含量测定结果表明．风信子同一花被内源IAA含量是上部最高，下部次之，中部最低，而内源Z+ZR含量从上向下依次增加;在附加不同外源激素的MS培养基上培养3天后，同一花被上，中、下三部位内源IAA和Z+ZR含量部有一定的变化。

猕猴桃属两个种的原生质体培养与体细胞杂交

猕猴桃是重要的栽培果树，但目前栽培品种过于单一，不能满足生产和消费的需求。由于猕猴桃的雌雄异株特性、种间杂交亲合性差、遗传上高度杂合以及育种周期长等特点，常规杂交育种困难很大。现代生物技术，如原生质体培养和体细胞杂交等，为培育新品种提供了新途径。 毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)和软枣猕猴桃(A.arguta)是猕猴桃属中具有重要利用价值的两个种。毛花猕猴桃果实大小在猕猴桃属中次于中华猕猴桃(A.chinensis)和美味猕猴桃(A.deliciosa)列第三位，果实维生素C含量达1014 mg/l00 g FW。软枣猕猴桃极耐寒，在-40℃下可安全越冬，其果实表面光滑无毛。这两个种是品种改良的重要种质资源。 作为生物技术基础的组织培养与植株再生系统，在毛花猕猴桃上尚未见报道。软枣猕猴桃的组织培养仅有一例报道，且芽分化率和分化系数都很低。这两个种的原生质体培养及与美味猕猴桃的原生质体融合也未见报道。针对这种情况，本试验对毛花猕猴桃和软枣猕猴桃的组织培养、原生质体培养及其与美味猕猴桃品种“Hayward”的原生质体融合进行研究，结果建立了较理想的毛花猕猴桃和软枣猕猴桃组织培养系统;首次从毛花猕猴桃原生质体得到再生植株和从软枣猕猴桃原生质体培养再生愈伤组织;通过改进融合方法，建立了毛花猕猴桃+美味猕猴桃和软枣猕猴桃+美味猕猴桃的原生质体融合体系，并将异核体培养分裂得到细胞团。这些结果有利于今后毛花猕猴桃和软枣猕猴桃资源的开发利用。主要试验结果如下： 以毛花猕猴桃试管实生苗叶片和茎段为外植体，培养在附加一定浓度Zea或CPPU的MS培养基上，产生的愈伤组织不经转代就可分化芽。试管苗茎段在附加0.0025 mg/L CPPU和0.1 mg/LIAA的MS培养基上愈伤组织产生、芽分化和苗生长都较理想;试管苗叶片则以附加0.025 mg/L CPPU和0.l mg/LIAA或0.5 mg/L Zea和0.1 mg/LIAA的MS培养基较好。当苗生长至1.0 cm时经诱导生根形成完整植株。 在软枣猕猴桃组织培养中，外植体种类、诱导培养基的激素种类和诱导分化时细胞分裂素种类都有重要影响。无菌苗茎段容易愈伤组织化，但分化困难;叶片外植体产生愈伤组织较难，但分化容易。在含Zea的MS培养基上，两种外植体产生的愈伤组织不经转代即能分化芽。分化培养基中添加Zea能有效地诱导芽分化，其中以2.0 mg/L Zea芽的分化最好，而Kin和BAP在0.5- 2.0 mg/L浓度范围内愈伤组织不分化。 以毛花猕猴桃或软枣猕猴桃试管苗叶片为分离原生质体的材料。试管苗的培养条件对原生质体分离效果及其培养反应有显著影响。弱光培养条件对两个种试管苗的原生质体分离及其培养都有好处，试管苗培养基也有重要影响。毛花猕猴桃和软枣猕猴桃试管苗合适培养基分别为MS基本培养基（大量元素减半）和MS+0.00025 mg/L CPPU+ 0.1 mg/LIAA。在此条件下培养的两个种的试管苗叶片，经酶解后原生质体产量分别为0.7-1.8×l06和3.0-3.5×l06/1 g FW，其原生质体在合适培养基上能够分裂。 毛花猕猴桃原生质体培养在MS培养基（去除NH4N03）附加l.0mg/L2，4-D液体培养基中，约10天时发生第一次分裂，分裂能持续下去并在培养3个月时形成约2mm大小愈伤组织。直接将其转入固体培养基中使其增殖和分化。在附加Zea 0.5 mg/L+ O.l mg/L IAA的MS培养基上继代2次，愈伤组织开始分化芽。芽伸长后切下诱导生根，形成完整植株。软枣猕猴桃原生质体培养基中，MS培养基附加2，4-D配合Zea或Kin对启动分裂是必须的，其中以MS＋2，4-D 0.5 mg/L+ Zea 0.5 mg/L最好，在此培养基上原生质体第一次分裂发生在4-6天时，培养12-14天时见到第三次分裂，培养三周的分裂频率为23%。培养45天后形成许多小愈伤组织块。软枣猕猴桃原生质体再生的愈伤组织从液体培养基转入固体培养基后未见进一步分裂。 对18株毛花猕猴桃原生质体再生植株的体细胞染色体数目作了观察，其中12株为整倍体，二倍体和四倍体各六株;另外六株为混倍体，其染色体数目变化在59-203之间。还发现原生质体再生植株有丝分裂间期细胞存在多核现象，有多核细胞的共10株，细胞内多核数目以双核和三核较常见，最多的有七个核。原生质体供体植株为2n=2x=58，未发现多核细胞。原生质体再生植株体细胞多核现象未见报道。 利用毛花猕猴桃或软枣猕猴桃叶片原生质体分别与愈伤组织来源的美味猕猴桃原生质体进行融合，融合方法为高Ca++高pH值PEG法。对Kao等(1975)报道的融合步骤作了修改。影响融合效率的因素主要有PEG种类、融合作用时间和融合液中DMSO浓度。最佳的融合条件为40%PEG (Sigma，MW3350)+10%DMSO，作用40 min。毛花猕猴桃+美味猕猴桃和软枣猕猴桃+美味猕猴桃的融合频率分别可达14.5%和13.6%。异核体经培养可分裂并形成细胞团。

陆地棉组织培养及转化研究

1．以MS无机盐+B 5有机成分为基本培养基，附加2，4-D，KT，ZT等激素，以农艺性状良好，抗枯萎病的棉花品种“冀492”为材料，建立了愈伤组织诱导，体细胞胚胎发生和植株再生体系． 2．实验结果表明，2，4-D是诱导愈伤组织产生的促进因子，效果明显好于其它生长素类物质，但是随着培养基中2，4-D浓度的升高，愈伤组织状态也会变差，褐化严重，而且，附加O.lppm 2，4-D，O.lppm K T的培养基是较为合适的培养基．IAA，NAA对愈伤组织的诱导不十分理想，此外，愈伤组织的产生还同外植体，基因型和一些物理条件有关， 胚性愈伤组织的产生，需不断调节培养基中激素浓度，逐步降低2，4 -D浓度，并添加低浓度ZT，胚状体要在去除2，4-D的培养基上才能产生．虽然，2，4-D对于胚性愈伤组织的诱导是必须的，但是却抑制胚状体的发育． 3．培养基中硝态氮和氨态氮比例，激素浓度和种类，活性炭的添加，对于胚状体的萌发和成熟有重要影响，硝酸钾加倍，硝酸铵减半，并附加低浓度ABA和活性炭是胚状体诱导和成苗（去除ABA）的适宜培养基，而附加0.2ppm N A A，0.2ppm ZT和活性炭的M S2培养基是胚状体成熟的适宜培养基．通过对胚性愈伤组织的干燥处理，培养基中低浓度ABA和活性炭的添加，比较有效地抑制了畸形胚的产生，大大地提高了正常胚的比例． 4．对陆地棉“冀4 9 2”的下胚轴和子叶利用含Bt抗虫基因的根农杆菌(AgrobacterIIm tumefrens)进行了遗传转化研究，在筛选培养基上获得了大量生长旺盛的阳性愈伤组织，葡糖酸苷检测结果表明，大部分愈伤组织均有G us基因的表达． 5．通过花粉管通道法，进行了将含有Bt抗虫基因DNA的大肠杆菌质粒导入陆地棉“冀492”的实验，并收获了近1 0，000粒种子，为从大量种子中筛选出抗性种质材料，建立了卡那霉素田间初步筛选法． 6．利用活体压片和石蜡切片技术对体细胞胚胎发生过程和胚状体起源进行了观察，发现胚状体发生主要是通过类合子途径进行的，胚状体可能起源于单细胞． 7．通过对相同培养基上的非胚性愈伤组织，胚性愈伤组织和不同时期胚状体的可溶性蛋白SDS - PAGE电泳分析，发现16KD和50K D蛋白特异性地存在于胚性愈伤和各期胚状体中，该蛋白可作为胚性愈伤组织的筛选标记．对不同发育时期的愈伤组织进行了同工酶和可溶性蛋白的IE F/SD S-PA G E双向电泳分析，结果表明，不同发育时期的愈伤组织同工酶酶谱和可溶性蛋白电泳图谱之间具有较大的差别，分化前期的胚性愈伤组织酶的活性强，种类多，并且有新的蛋白斑点的出现，这些都可能与体细胞胚胎发生相关．

组织培养产生小麦族属间易位和其它染色体变异的分子细胞遗传学分析

组织培养能够诱导染色体断裂和重接进而产生染色体易位的观点已被广泛认识。大量的研究注意到了组织培养产生的核型不稳定性，其中大多数研究的对象是栽培作物及其属间或种间杂种幼胚和幼穗再生植株。借助于减数分裂分析、染色体分带和其它检测技术，在再生植株中发现了包括易位在内的许多染色体变异。可以相信，除了传统的同源和部分同源染色体配对时的自发易位和辐射诱变等方法以外，远缘杂种组织培养有可能作为产生染色体易位的又一种选择。尽管如此，至今还没有取得培养细胞中染色体易位的直接证据。本研究以普通小麦×硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂种为材料，研究了组织培养过程中离体细胞的染色体变异，用基因组原位杂交技术（GISH）证实组织培养诱导小麦染色体与簇毛麦染色体发生易位。同时，研究了小麦×黑麦杂种培养细胞中的染色体变异和黑麦B-染色体的变化。利用组织培养技术获得了小麦-黑麦和小麦-长穗偃麦草代换系和附加系。 1 普通小麦比较容易与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体TH_1和TH_1W杂交，所选的9个普通小麦品种或品系与TH_1和TH_1W配制的19个杂交组合，平均结实率为46.7%，共计获得19个杂交组合2316粒杂种种子。正反交结果表明，以普通小麦为母本的杂交结实率高于反交结实率。在继代培养过程中，杂种幼胚愈伤组织生长迅速，甚至直接诱导出绿苗，共获得不同杂交组合2005株再生植株。 2 普通小麦与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂种愈伤组织发生了比较大范围的染色体数目和结构变异。在检查的中国春×TH_1W、TH_1W×84加7911515、TH_1×84加7911515、TH_1W×91E27、鲁资357×TH_1W等5个杂种组合的1730个愈伤组织细胞中，平均有19.1%的细胞发生了染色体数目变异，不同杂交组合变化在12.7%（中国春×TH_1W）至30.7%（TH_1×84加7911515），其中，以染色体数目减少的变异为主，数目增加的变异比较少。杂种愈伤组织平均有6.3%的细胞发生了染色体断裂，产生染色体断片、环状染色体、端着丝点染色体和缺失染色体。断裂的染色体可能重新融合在一起，形成双着丝点染色体。 3 培养时间影响普通小麦×硬粒小麦-簇毛麦双二倍体和普通小麦×黑麦杂种愈伤组织细胞中的染色体数目和结构变异。在一定时间里，随着培养时间的延长，未发生核型变异的细胞逐渐减少，发生变异的细胞逐渐增多，主要表现在染色体数目减少的细胞增多，而染色体数目增加的细胞有减少的趋势。在长时间培养（190日龄）的愈伤组织中染色体加倍的细胞消失了，表明长时间培养对高倍性的细胞具有不利的选择，使这类细胞难以在长期继代培养中生存下去。愈伤组织在第一次继代培养时就发现有核型变异，说明染色体变异在愈伤组织培养初期就可以发生。 4 以簇毛麦总基因组DNA为探针，采用荧光原位杂交技术在普通小麦×硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂种愈伤组织细胞中发现小麦染色体与簇毛麦染色体发性易位，这一结果是组织培养诱导培养细胞中属间染色体易位的第一个直观的证据。易位的染色体既有臂间易位，也有小片段易位。易位的染色体不仅可以在愈伤组织细胞中存在，也能够在再生植株中表达。在64株中国春×TH_1W和NPFP×TH_1再生植株中，观察到了3个易位株，其中1个易位株是一个小麦染色体与一个簇毛麦染色体发生了相互易位，易位的簇毛麦染色体片段比较小，大约为簇毛麦染色体臂的1/2，而易位的小麦染色体大约是臂长的1/3，另外2个易位株染色体断点位于或靠近着丝点。本研究的结果再次证实了利用组织培养能够创造小麦与外源染色体之间发生易位。 5 ~(60)Co γ-射线辐射处理对于普通小麦中国春与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体TH_1W杂种愈伤组织细胞的染色体变异有很大的影响。表现在未发生变异的细胞大大减少，发生染色体数目变异的细胞急剧增加，主要是染色体数目减少的变异提高了21.3%，相反染色体增加的变异不但没有增加，而且还有所减少。经过辐射处理的愈伤组织细胞染色体结构变异也有大幅度增加，变异频率提高，变异类型增加。发生染色体断裂和重接形成双着丝点染色体的细胞频率达到22.3%，比对照提高13.9%。辐射诱变对培养细胞中簇毛麦染色体变异发生明显的影响。与此同时，簇毛麦染色体与小麦染色体易位频率比对照提高了近2倍。观察结果还表明愈伤组织辐射处理比延长培养时间诱导染色体变异的效果更好。 6 尽管愈伤组织中发生的染色体变异在再生植株中多有发现，但是，只有比较小范围染色体变异的愈伤组织细胞具有再生能力形成再生植株，那些发生剧烈变异的细胞通常不具有再生能力，因而不能在再生植株中得到表达。普通小麦与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂种大多数再生植株染色体数目与供体杂种保持一致，只有少数植株发生染色体数目变异。显然，发生较大染色体变异的愈伤组织细胞在增殖和分化过程中处于不利的地位，逐渐被淘汰。 7 在普通小麦与硬粒小麦-簇毛麦与黑麦杂种愈伤组织中，观察到相当高频率的染色体加倍细胞，为利用组织培养创造双二倍体提供了一种可能。但是，加倍的细胞只是培养初期的愈伤组织中出现，经过一段时间的培养，这种细胞大多消失了。而且，大多数再生植株染色体数目未发生加倍，其中并没有出现期望的双二倍体植株。表明加倍了的细胞在愈伤组织生长和分化过程中大范围变异的细胞一样受到不利的选择，再生能力比较差。因此，利用组织培养创造双二倍体需要更大的努力。 8 一些黑麦品种含有数目不等的B-染色体。B-染色体的多少对普通小麦与黑麦的杂交结实率有比较大的影响，数目越多，杂交结实率越低。在培养初期的愈伤组织细胞中，B-染色体的频率很高，例如69%的中国春×芬7416杂种的40日龄愈伤组织细胞中含有数目不等的B-染色体。常染色体的倍性影响B-染色体的分布，染色体数目加倍的双二倍体细胞中含多数B-染色体的细胞频率大大高于单倍体细胞。经过一段时间的培养之后，绝大多数B-染色体都不存在了，只有极少数细胞含有1个B-染色体。可能的原因是离体培养过程对B-染色体产生了不利的选择。 9 利用组织培养技术，从普通小麦与八倍体小黑麦杂种幼胚再生植株自交后代中选育出2个异代换系，从4D缺体小麦×八倍体小黑麦再生植株回交后代中选育出1个附加系。荧光原位杂交、C-分带和种子贮藏蛋白分析证明这两个代换系1D/1R代换，附加的也是1R染色体。从4D缺体小麦与八倍体小偃麦杂种再生植株自交和回交后代中选育出5个代换系和2个附加系。染色体配对和RAPD分析证实了长穗偃麦草染色质的存在。其中一些小麦-长穗偃麦草代换系和附加系对叶锈病免疫或高抗，对条锈病的一些生理小种和白粉病具有比较高的抗性。而且，附加系924和代换系807蛋白质含量分别达到19.32%和18.83%。 10 当普通小麦鲁资357与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂交时，无论是实生苗还是再生植株都发生杂种致死现象。细胞学观察没有发现植株染色体发生变异，荧光原位杂交表明簇毛麦染色也没有发生可见的变异。推测这种杂种致死现象是由于鲁资357和硬粒小麦81086A（TH_1和TH_1W的硬粒小麦亲本）中可能分别带有互补的杂种致死基因所致。