羊草生殖生物学研究

羊草 (Leymus chinensis (Trin.) Tzvel. ) ，隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部的重要草原建群种之一。羊草是牧草之王，属于我国有比较优势的战略性生物资源，对我国北方畜牧业发展以及保护生态环境均具有重要作用。 羊草较弱的有性生殖特性限制了其应用，本文从实验生物学角度，研究了羊草有性生殖的基本特点，并试图通过现代分子生物学手段探讨自交不亲和性的有关机理。本论文的主要结果如下： 1. 实验发现羊草具有自交不亲和性。以6 个羊草居群为材料，测定得知开放授粉时的结实率在6.5% - 56.7%之间，自交时结实率为0.6% - 4.3%，差异极其显著; FDA 染色法检测结果显示羊草成熟花药中有活性的花粉达到92.2% 以上;在发育时间顺序和空间结构上，羊草雌蕊、雄蕊适于异花和自花授粉;花粉柱头亲和性实验表明，自交花粉只有5.5%-11.7% 是亲和的，杂交花粉亲和率达到了60.0%-84.8%，说明自交花粉在柱头上萌发受到抑制，其次，荧光显微镜还观察到“不亲和花粉”在进入柱头后生长缓慢，或停止延伸。 2. 初步确定羊草自交不亲和性具有配子体型遗传特点。以不同居群羊草杂交后的姊妹系作为实验材料，观察到自交组合的亲和率变幅为0 % - 6.9 %，杂交组合的亲和率具有连续性变异和变幅较宽的特点（47.5％ - 96.0 %），且正反交结果具有一定的一致性（88.2％），表现出配子体遗传特性。 3. 羊草居群内结实率存在一定变异。以羊草单株为单位分别进行自交、随机互交和开放授粉，结果显示三者的平均结实率分别为4.6%，18.1% 和35.7%，株间的变异系数分别为33.4%，21.2%和17.1%，这些株间的变异均达到统计上的显著差异;同时羊草自交、杂交和开放授粉之间具有一定的相关性，显示羊草的这种株间差异与株系本身的生理特性相关。 4. 分离了羊草硫氧化还原蛋白 H 基因(ThioLc)并对其功能进行了分析。克隆了ThioLc全长和cDNA序列。序列分析结果显示，DNA全长2257 bp，包括3 个内含子和4 个外显子，与水稻Thio h 的cDNA 序列相比，具有 32.0% 的同源性;Southern 杂交显示 ThioLc 在羊草基因组中是单拷贝;Northern 杂交显示 ThioLc 在羊草根、茎、叶和幼小的雌蕊中没有表达, 在成熟雌蕊和幼小的花粉中微量表达, 在成熟花粉中大量表达，说明分离的羊草硫氧化还原蛋白H 基因具有花粉特异表达特点。 5. 原核表达的ThioLc 蛋白具有较高的催化活性。构建了ThioLc 基因的原核表达载体，检测证明ThioLc基因在大肠杆菌中正常表达;提取表达蛋白，纯化，用胰岛素和二硫苏糖醇反应体系进行硫氧化还原蛋白的催化作用反应，结果表明表达的蛋白具有催化活性。这一结果为进一步搜寻靶向蛋白和研究该蛋白的结构、功能和作用方式奠定了基础。

绊根草重金属抗性相关基因的克隆及其功能分析及可耐受偏二甲肼的芦苇变异株系的筛选

本研究利用酵母功能互补方法和RACE的方法从具有较强抗逆能力的绊根草中克隆了9个与重金属抗性相关的克隆，并对部分基因的表达调控及功能进行了初步研究。同时还利用细胞工程技术筛选到了具有较强的耐受火箭推进齐-偏二甲肼(UDMH)的芦苇的变异株系，为以后用人工湿地系统处理受偏二甲肼污染的废水奠定了基础。 本研究通过酵母功能互补法克隆到了五个基因，分别为CdSRP、CdTETH、 CdASP、CdMT2和CdTER1。CdSRP可能是一种衰老相关基因;CdTETH编码的产物可能是组成TRAPP复合体的一个亚基;CdASP是一个功能未知的基因;CdMT2是一个编码Type Ⅱ型金属硫蛋白基因;CdTER1可能是编码一个TERl-like家族蛋白成员的基因。用这五个基因分别转化因Acr基因缺失而对As敏感的酵母菌株FD236-6A，所获得的转化子对As的抗性均有提高，其中以CdMT2、CdTER1和CdASP的作用最为明显。这些基因的表达调控方式以及与其它重金属抗性的关系正在研究中。 本研究还利用RACE的方法克隆了一个谷胱甘肽S-转移酶基因，CdGSTFl;两个植物络合素合酶基因，CdPCSI和CdPCSⅡ，和一个TypeⅠ型金属硫蛋白基因CdMT1。CdGSTF1属于phi类GST基因，Northern-blotting分析表明，CdGSTF1在绊根草根部的表达受Cd2+的诱导，暗示其可能具有解除氧自由基或氢过氧化物的毒性的作用。CdPCSI和CdPCSⅡ的同源性较高，表明绊根草含有两个以上的PCs合酶的基因。参照前人的方法对CdPCSI和CdPCSII的氨基酸序列进行分析，发现它们含有六个非常相近的Cd2+结合位点，这两个基因的功能及其调控方式有何差异尚需进一步的研究。cdMT1与用酵母功能互补法克隆到的CdMT2属于不同类型的MT基因，对它们之间很可能存在的功能、组织特异性等方面的差异性进行了讨论。 四氧化二氮／偏二甲肼是常用的航天器双组元液体推进剂。偏二甲肼易挥发，有致癌、致畸、致突变的毒性。在推进剂贮存、运输、转注、火箭发动机试车、火箭发射、管道及设备冲洗中产生的含有偏二甲肼的废水能够对卫星发射基地的地下水源和空气造成污染。因此迫切需要培育能够净化偏二甲肼污水的植物。 本研究利用生长在卫星发射基地的野生芦苇的种子诱导愈伤组织，进而通过逐步提高偏二甲肼筛选压力的方式从中筛选出具有较强抗性的愈伤组织，然后诱导其分化。目前已经得到能够在含有1.63 mmol/L和3.26 mmol/L偏二甲肼的分化培养基中生长良好的芦苇再生苗，并已成功转移至温室中。抗性分化苗对污水的处理效果和耐受偏二甲肼的机理正在研究中。

缺失nifZ的棕色固氮菌突变株DJ194的钼铁蛋白研究—纯化、结晶及金属簇的组成与分布

从棕色固氮菌DJ194菌株得到的固氮酶粗提液经DEAE－52、Sephacryl S－200及Q－Sepharose等柱厌氧层析，分离纯化得到nifZ基因缺失的固氮酶MoFe蛋白（ΔnifZ Av1）制备物。通过天然电泳和SDS变性电泳发现早期纯化所得的ΔnifZ Av1制备物中残存相当比例的三个主要污染蛋白：属于热激蛋白60家族（Hsp 60 family）成员的分子伴侣GroEL、糖酵解过程的一个多功能酶——6-磷酸葡萄糖异构酶（6-Phosphate Glucose Isomerase，PGI）及棕色固氮菌细菌铁蛋白（Bacterioferritin，Bfr）。初步鉴定表明，它们分别为由约55kD亚基组成的14聚合体，62kD亚基组成的10聚体和20kD亚基组成的24聚体。首次发现PGI有如此高的聚合体。虽然GroEL和PGI在天然电泳中的迁移率小于ΔnifZ Av1蛋白，但它们的亚基在SDS变性电泳中与ΔnifZ Av1亚基具有相似的迁移率，互相重叠，从而使变性电泳比天然电泳显出更高的ΔnifZ Av1纯度;而细菌铁蛋白虽然不会在变性电泳中污染ΔnifZ Av1，但往往会在ΔnifZ Av1制备物的结晶中优先或较多地结晶出来,从而给它的晶体生长和解析研究带来干扰（Zhao等，2004）。 通过Sephacryl S－200柱洗脱峰收集精度的调整及Q－Sepharose柱的NaCl浓度梯度洗脱，得到了纯度大于90%的ΔnifZ Av1制备物。它的厌氧天然电泳及其免疫印渍（Western blotting），以及SDS-变性凝胶电泳显出，ΔnifZ Av1的电泳迁移率、分子量和亚基组成等均与野生种钼铁蛋白（OP Av1）相似，表明nifZ基因缺失并未改变ΔnifZ Av1的α2β2四聚体构成。ΔnifZ Av1的Mo含量、EPR信号（g≈4.3, 3.65和2.01）和520-660 nm附近的圆二色摩尔消光系数（Δε）也都与OP Av1较相似，从而表明ΔnifZ Av1含有与OP Av1数量相当的具有3/2自旋态的还原FeMoco。然而，ΔnifZ Av1的Fe含量和对底物（C2H2、H+和N2）的还原活性都较低, 分别约为OP Av1的74%和46-50%;而反映P-cluster状况的450nm附近的Δε也明显低于OP Av1。此外，与OP Av1相同的ΔnifZ Av1在g≈2.01的EPR信号却与推测含由双[4Fe-4S]簇组成的P-cluster前体的His-tagged ΔnifZ Av1（Hu等，2004）的信号明显不同。这就表明，ΔnifZ Av1与OP Av1的差别不在于FeMoco的结构、含量和氧还状态，也不在于P-cluster的结构和氧还状态，而仅在于ΔnifZ Av1中P-cluster数目的减少（约一半）。据此推测出与国外提出的His-tagged ΔnifZ Av1模型不同的ΔnifZ Av1(DJ194)的如下结构模型。一个αβ亚基对含有一个FeMoco和一个P-cluster，而另一个αβ亚基对只含FeMoco，其P-cluster区域则是空的。由于nifZ基因的缺失只造成了钼铁蛋白中两个P-cluster中的一个不能组装，因此推测P-cluster的组装可能不是受单一基因产物的影响。根据Lee等（1998）对nifZ产物（NifZ）和nifW产物（NifW）可以形成[NifWx-NifZy]多聚体，并可能是通过同一途径来影响固氮酶的合成的研究，提出NifZ的如下的可能作用机理。[NifWx-NifZy]多聚体影响与P-cluster合成相关的金属簇(如[4Fe-4S])的进入和P-cluster的最终合成，而其中的一个αβ对上的P-cluster的形成可能较多的受到NifZ的影响;nifZ的某些突变或缺失虽然不影响[NifWx-NifZy]多聚体的形成，但对于更依赖于NifZ的那个αβ对上的P-cluster的合成可能会产生不同的影响。 对这一高纯度的ΔnifZ Av1制备物结晶的研究表明，使用Tris缓冲系统的25%PEG 6K/MgCl2晶体培养液可以在较短的晶体培养时间内得到较大的晶体;在一定条件下，pH为7.5和8.3的培养液对出晶数和晶体大小的影响不明显;PEG 6K的浓度与MgCl2的浓度对出晶大小的影响有一定的相关性，即较低的PEG浓度在较低的MgCl2浓度下和较高的PEG浓度搭配较高的MgCl2浓度较易长出较大的晶体。虽然ΔnifZ Av1制备物的纯度达到90%以上，并且在染铁实验中表明其基本不含细菌铁蛋白，但我们在对得到的晶体进行电泳鉴定中仍然发现了一种与以前报导的砖红色晶体不同的深棕红色的细菌铁蛋白晶体，之所以颜色不同可能和所含的铁元素的氧化状态有关。不过在所鉴定的5支结晶管中只在一个管内发现了与固氮酶晶体同时存在的这种细菌铁蛋白晶体，说明通过蛋白纯度的提高减少细菌铁蛋白的含量以及晶体培养条件的优化，细菌铁蛋白晶体形成的几率就可大大降低。

G蛋白在松类植物花粉管发育中的亚细胞定位及调控机制

G蛋白参与了哺乳动物内多种细胞信号途径，但其在植物花粉萌发和花粉管发育过程中的细胞学定位、生化特性及功能研究比较滞后，有关这方面的研究报道较少。在显花植物授粉受精过程中，具顶端极性生长特性的花粉管是雄性生殖单位的载体，也是研究细胞生长分子调控机理的理想体系。与被子植物相比，裸子植物具有生长周期长，花粉管生长缓慢、易分叉等特点，具有不同于被子植物花粉发育的独特发育模式。对于裸子植物花粉萌发和花粉管生长的调控机理，目前尚不十分清楚。本文以松类植物中比较有代表性的裸子植物青杆（Piceawillsonii）和白皮松(Pinus bungeana)花粉为试材，应用免疫分析和间接免疫荧光显微镜技术，结合药理学实验和FTIR手段，研究了异三聚体G蛋白和小G蛋白在花粉管细胞中的定位、生化特性及其在花粉管发育中的调控作用。结果如下： 应用Western Blotting技术和来自于抗哺乳动物中不同序列G蛋白O【亚基抗体，我们在白皮松花粉管中检测到一条分子量为40 kDa左右的蛋白。去污剂处理显示，该蛋白与质膜偶联。间接免疫荧光显微镜实验发现，在花粉管发育的整个时期，代表Ga蛋白的荧光均一的分布在整个质膜区域，尤其在尖端皮层区域荧光最亮，显示此处该蛋白浓度最高。无论是在正常发育的花粉管抑或是发生弯曲或扭曲生长的花粉管，均呈现同样的分布模式。随着花粉管发育，Ga蛋白表达量发生变化。在花粉管发育中期，Ga蛋白表达量比较高;随着花粉管离体培养时间的延长，Ga蛋白表达量下降。另外，在花粉刚刚萌发时，Ga蛋白表达量也比较低。 对白皮松花粉萌发进行的药理学实验显示，G蛋白调节剂 CTX和PTX对白皮松花粉管的影响呈现双阶段效应。当添加的药剂浓度小于400 ng mL-I时，无论CTX还是PTX均抑制了花粉萌发和花粉管生长，且花粉管容易破裂;而当二者浓度分别升至500 ng mL-I时，同对照相比，花粉管生长明显受到促进。这一结果不支持Ma等人在百合花粉中的研究结果。进一步应用FTIR技术分析发现，当用浓度为400 ng mL-I CTX或PTX处理花粉管时，花粉管细胞壁酚类物质增加，而纤维素、半纤维素、木聚糖等物质下降，这可能是导致此浓度处理下花粉管易破裂的原因。这些结果显示了G蛋白a亚基参与了白皮松花粉管生长，CTX和PTX可能通过下游对其敏感的功能蛋白而非Ga本身，影响着花粉管生长并调控着花粉管壁的建成。 利用来源于烟草的抗NtRacl抗体和拟南芥的抗ROPs抗体，应用WeternBlotting技术，我们在青杆花粉管中检测到分子量为23kDa的多肽。间接免疫荧光显微镜实验显示，在花粉萌发18和24小时后，Rac蛋白主要定位于花粉管尖端质膜区域，时而会延伸到顶端两侧区域，但从尖端到基部存在浓度梯度，这种分布模式多在花粉管发育的后期观察到。Rac蛋白在青杆花粉管不同发育时期的分布模式变化可能和花粉管的生长状态有关，在花粉管发育早期和中期，正是花粉管旺盛生长期，Rac蛋白的尖端定位保证了花粉管的极性生长。对Rac蛋白在花粉管的分布进行的连续切片扫描发现，Rac蛋白不但分布在质膜上，并与质膜偶联，而且在胞质中亦有分布。通过对一系列正常发育（即极性生长的花粉管）和畸形发育的花粉管进行观察发现，Rac蛋白主要分布在旺盛生长的花粉管尖端质膜或离顶端20 Vm处，在分叉的生长缓慢的分枝端分布较少。而在那些发生分叉生长的花粉管中，处于次要位置的基本停止生长的分枝端几乎没有Rac蛋白存在。在顶端发生膨大的花粉管中，Rac蛋白均匀分布在花粉管整个质膜上，丧失浓度梯度，失去极性生长。这些结果显示了Rac蛋白参与了青杆花粉管生长。 应用抗NtRacl抗体进行的间接免疫荧光显微镜定位实验，我们在正在生长的花粉管的管核中观察到明亮的荧光，显示了有Rac蛋白的存在。当精细胞在花粉粒中未移动到花粉管中时，几乎没有观察到荧光信号。随着花粉管发育，两个精细胞的位置发生变化，当其中一个较大的精细胞移动到花粉管中时，观察到明亮的荧光信号，这些结果显示了Rac蛋白可能参与了管核或精细胞在花粉管内的移动。

青蒿素生物合成相关基因对烟草遗传转化的研究

　　青蒿素是存在于中药青蒿(Artemisia annua L.)中的一种含有过氧桥的倍半萜内酯化合物，是中国科学家研发出的当今最有潜力的抗疟药剂，较传统抗疟药很少或无毒副作用，因此青蒿素的生产备受人们关注。目前，青蒿素的生产主要以植物提取为主，但由于青蒿植株中青蒿素的含量很低（约占干重的0.01%～0.8%），从而导致青蒿素价格昂贵，使许多贫困地区的疟疾患者无法得到医治，故提高青蒿植株中青蒿素的含量或扩大青蒿素的来源，降低生产青蒿素的成本具有重要的意义。　　 　　本论文基于扩大青蒿素的来源和提高青蒿植株中青蒿素含量的目的，开展了以下两方面的工作： 一、紫穗槐二烯在烟草中组合生物合成的研究 　　紫穗槐二烯合酶（amorpha-4,11-diene synthase，ADS）是青蒿素生物合成的关键酶之一，为了能在烟草中合成青蒿素的前体，本研究将青蒿的紫穗槐二烯合酶基因置于CaMV 35S启动子控制下，通过根癌农杆菌介导转入烟草（Nicotiana tobacum L.），并获得了转ADS基因烟草植株。经PCR及Southern杂交分析表明，ADS基因已经整合到转基因烟草基因组中；RT-PCR及对转基因烟草中ADS酶活性和产物中紫穗槐二烯和植物甾醇的测定分析，进一步证明整合的ADS基因在转录、翻译水平上均已经表达。上述结果表明，利用基因工程将青蒿素生物合成途径的关键酶基因导入植物，转基因植物中能够合成青蒿素的前体，这一研究结果为利用转基因植物生产青蒿素或其前体奠定了基础。 二、青蒿鲨烯合酶双链干涉基因对烟草的遗传转化研究 　　鲨烯合酶（squalene synthase, SQS）是甾醇类生物合成分支途径的关键酶之一，利用RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)抑制目标基因表达的技术已日趋成熟。本文根据植物中hpRNA(hairpin RNA)的原理，在与烟草SQS同源性高达80％的青蒿ASQS序列的5/端保守区选择622 bp作为构建RNAi的序列，借助中间克隆载体，经过三次亚克隆，最后形成含ASQS－RNAi表达盒的双元表达载体pART27－ASQS，并转入农杆菌EHA105。采用农杆菌介导的烟草叶盘转化法，共获得了12棵转基因植株。转基因植株经过PCR和PCR-Southern blotting 检测，证实外源ASQS基因已经导入烟草中，并已经成功整合到烟草基因组中；通过RT-PCR分析说明，转基因烟草中SQS基因的表达已被成功抑制，部分转基因植株中内源SQS的干扰效果高达90％以上。对SQS的直接产物鲨烯和最终产物植物甾醇的检测显示，转基因烟草的植物甾醇和鲨烯的含量明显低于对照。本实验的结果为下一步将此RNA干扰载体导入青蒿，抑制青蒿中ASQS基因的表达，从而提高青蒿素的含量提供了可能。

光敏核不育水稻中光敏色素的分析

本文报道了在育性转换敏感期光周期处理对光敏核不育水稻（农垦58S）及农垦58最新全展叶中光敏色素Ⅰ(PhyA)水平的影响PartI）．在10个光周期处理的最后一个暗期结束前,收获每株水稻的最上部二叶。PhyA用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定。 结果表明：0.5%(v／v)聚乙烯亚胺(PEI)可除去水稻叶片粗提液中干扰ELISA的物质;所用的ELISA专一性地检测水稻PhyA。和长日照(LD)处理相比，短日照(SU)处理导致农垦58S中PhyA的相对含量增加38.5%;而农垦58只增加18.5%。显然，在较长的暗期条件下（SD），农垦58S中PhyA的合成比农垦58快。SD处理下大量增加的PhyA可能和农垦58S的育性恢复有关。 上述结果也说明：在同一品种甚至不同品种的植株间，PhyA水平均易受光周期影响而剧烈变化。 为了进一步验证农垦58S中PhyA较快积累的推论，比较了农垦58s和农垦58幼苗（三叶期）在一延长暗期(24h)中PhyA的积累时程。和育性转换敏感期的植株相似，农垦58S幼苗中PhyA积累速度快于农垦58。在暗期开始6h后，这种差异更明显。这一结果证实了过去的假设：甲基化水平低的农垦58PhyA基因可能比农垦58PhyA基因更活跃地表达。 PhyA和PhyB同时存在于水稻叶片中。为了探讨PhyB是否参与农垦58S雄性不育的调节，在育性转换敏感期每日光期结束、暗期开始开始前进行短暂的FR照射实验(即end-of- dayFR irradiations)。EOD FR反应应由PhyB介导。和SD下的对照相比，经过10次EODFR处理(EOD FR+SD)的农垦58S植株抽穗和开花期都相应地推迟2天，而花粉败育率和种子结实率都没有变化。 EODFR处理抑制了农垦58的开花，但花粉育性几乎不受影响。 综上所述，可能是PhyA而不是PhyB参与调节农垦58S的雄性不育。 另外，本文采用免疫印迹(Immunoblotting or Western blotting)比较了农垦58S和农垦58黄化苗(3天龄)中PhyA的相对含量(PartⅡ)。 结果表明，RPA可以专一性地检测两品种中120KD多肽。该肽在照射R或FR后对内源蛋白酶水解的敏感性不同，照射FR后，该肽易降解产生116KD的片段;照射R后，相对较稳定。因此，上述120KD多肽是水稻PhyA。未观察到农垦58S和农垦58的PhyA在免疫原性、分子量及内源蛋白酶解水解带型有差异。定量分析表明农垦58s黄化苗中PhyA的相对含量比农垦58多40%。这一结果和上述光周期处理的结果是相辅相成的。由于干种子、以及吸涨36h以前的水稻胚中均检测不PhyA的存在，因此两品种间PhyA含量的差异是PhyA蛋白重新合成的结果。 活体低温(80K)荧光光谱分析表明：农垦58黄化苗（3天龄）具有典型光敏色素(主要为PhyA）的荧光发射，其最大波长为683.8nm，而农垦58S以及由其转育来的培矮64s都缺少明显的光敏色素峰。显然，农垦58S和农垦58的PhyA荧光光谱特性有所不同。这一差异是否和雄性不育有关仍待深入研究。 本文第三部分比较了农垦58S和农垦58黄化苗（6天龄）最初转到白光下(4h)合成叶绿素的情况。无论是短暂红光(R)处理或对照，农垦58幼苗合成叶绿素的量（在白光下4h）都多于农垦58S。由于R促进叶绿素合成的效果可被随后的远红光照射(FR)逆转，因此水稻幼苗中叶绿素合成是在光敏色素的控制下。FR逆转性在农垦58S中似乎更完全。连续FR（12h最有效）促进叶绿素合成的效果在农垦58S中更明显，但叶绿素合成的量（在白光下4h）仍是农垦58多。然而，对于自然光周期下生长的幼苗（2-4叶期），农垦58S的叶绿素含量明显高于农垦58。文中讨论了这种差异的可能原因。

豌豆Lhcb2 基因的克隆、表达、功能分析及其克隆化蛋白与色素体外重组系统的建立

Lhcb2基因是LHCII基因家族中的一个重要成员。目前，对于其特性、结构和功能还不清楚。本文对豌豆Lhcb2基因的克隆、表达、功能及其在大肠杆菌中的表达产物与色素在体外的重组进行了比较系统的探讨，主要的结果如下： 1．采用RT-PCR技术，从豌豆幼叶中克隆了一个约800 bp的Lhcb2 cDNA。以特异探针进行Southern杂交的结果初步证明，Lhcb2基因以单拷贝形式存在于豌豆基因组中，这在文献中尚未见报道。 2．不同光照时间和温度对豌豆幼苗进行处理的RT-PCR，Northem blotting分析表明，Lhcb2基因转录水平上的表达受光照的控制，且明显地表现出对光照时间的依赖性。用400 μmolm-2.s-1的白光照射0～1.5小时Lhcb2基因未见表达，而在光照2小时以上则大量表达，推测该基因的表达可能要求某种(或某些)需光中间物的合成和积累。温度对Lhcb2基因的表达亦有显著的影响，相同的光照处理，4 ℃下Lhcb2基因的表达量比25℃下的表达量低一倍左右。 3．将豌豆Lhcb2基因反向插入植物表达载体pBIl21中，构建CaMV 35S启动子控制下反义Lhcb2基因的植物表达载体pBIantiLhcb2，通过农杆菌LBA4404介导，在Kan浓度为100 mg／L的筛选培养基上，获得120个抗Kan阳性植株。PCR检测表明至少有80个抗性植株为PCR阳性反应。Southern blotting分析表明，外源反义Lhcb2基因已整合到烟草基因组中。转基因植株在表型上主要表现为三大类型：叶色类似于未转基因的绿色植株、叶色发黄的植株、叶色发白甚至枯死的植株。这几类转基因植株光谱特性的分析表明，Lhcb2基因不仅影响光能的捕获，而且还可能参与激发能分配的调节作用。 4．将豌豆的Lhcb2基因亚克隆至原核表达载体pET-3d上，通过定点突变使其在大肠杆菌BL2l(DE3)中得到高效表达，其表达量约占大肠杆菌总蛋白的40％，并经纯化后获得了电泳纯的Lhcb2蛋白。应用改进的液氮／室温冻融重组方法将纯化的蛋白与色素进行体外重组，建立了高效的重组系统。实验结果表明重组后所获得的LHCB2单体与用生化方法从菠菜类囊体膜中分离纯化的天然LHC II单体相比较，其在部分变性胶的电泳行为，低温荧光发射光谱和激发光谱，以及室温吸收光谱和CD光谱的特征等方面都非常相似，说明大量表达的Lhcb2蛋白与色素已成功地重组，并具有与天然的LHCII单体相类似的组成和结构，这在国际上尚属首次。在此基础上又构建了N端和C端氨基酸残基缺失的突变体，并对这些缺失的氨基酸残基在LHCB2中的可能作用进行了初步的研究。结果表明，N端的前12个氨基酸残基、C端的前10个氨基酸残基和第11位的色氨基酸残基对LHCB2单体的形成不是必需的。 此外，从菠菜中纯化了LHCII，并对其多肽和色素组成及其光谱特性进行了比较系统的研究。同时对用不同浓度OGP和Mg2+处理所获得的不同聚集程度的LHCII的光谱特性进行了研究，并对Mg2+在其中的可能作用进行了初步的探讨。

Cyt b-559 链Arg18和Ser24的定点突变及其对PSII功能的影响

Cyt b-559是光系统II反应中心的成分之一，它由亚基和亚基组成的。在Cyt b-559中，血红素辅基与两个亚基中的组氨酸连接成有功能的蛋白，并维持PSII的功能稳定性。前人曾将与血红素相连的His突变，导致Cyt b-559功能和PSII稳定性的丧失。基于此研究，本文采用定点突变技术，将亚基中与His23位置最近的上游氨基酸Arg18分别用Gly和Glu取代，下游氨基酸Ser24用Phe取代，获得了衣藻Cyt b-559的突变体。对突变体的分析，有以下新结果：突变体都能进行光合自养，但无论在异养培养基上还是自养培养基上，和对照相比，其生长速度非常缓慢; PSII的活性分析，表明PSII的放氧活性为野生衣藻细胞的50%～80%， Fv/Fm 的荧光参数为40%～70%;对突变体进行强光（1000μE•m-2•s-1）照射，10min后，其放氧活性都降低为0，而野生型衣藻还保持35%的活性;提取类囊体膜蛋白，进行SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析，显示突变体的膜蛋白与对照无显著差异。这些结果说明对围绕血红素环境的固有氨基酸的改变，虽然并没有明显影响类囊体膜蛋白的表达和组成，但是却影响了衣藻细胞的生长和PSII的活性，增加了衣藻细胞对强光的敏感性，降低了衣藻细胞自身的光保护能力。这说明靠近血红素配位环境的氨基酸Arg和Ser，尤其是Arg，对Cyt b-559的功能维持不可缺少，对于维持PSII的活性也很重要。

盐胁迫对螺旋藻光合作用影响的研究

盐胁迫是限制高等植物和藻类生长和产量的主要环境因子之一。PSII对环境胁迫的响应被认为是光合作用适应逆境过程中最重要的一个环节。尽管盐胁迫对PSII的影响已进行了大量的研究，但有关盐胁迫对PSII作用方式和位点的研究仍存在着争议。我们主要研究了盐胁迫对螺旋藻PSII结构和功能的影响，以探讨盐胁迫对PSII的作用方式和位点以及该藻细胞PSII对盐胁迫的适应机理。主要研究结果如下： 1． 用0、0.2、0.4、0.6、0.8M NaCl处理螺旋藻细胞12小时。随盐浓度的增加，螺旋藻细胞的Chla、carotenoid、PC、APC及蛋白含量均呈下降趋势，说明盐胁迫抑制了上述色素及蛋白的合成或加速了它们的降解，从而影响了螺旋藻的光合作用。 2． 随盐浓度的增加，螺旋藻细胞光合放氧活性和PS II电子传递活性显著降低，表明盐胁迫引起藻细胞PS II活性的下降。 3． 通过放氧活性、热致发光（TL）、多相荧光瞬态上升动力学曲线的测定以及Western 杂交，来探讨盐胁迫对螺旋藻细胞PS II供体侧电子传递及OEC33蛋白含量的影响。结果显示：随盐浓度的增加，螺旋藻细胞光合放氧活性和PS II电子传递活性下降;TL B-band和Q-band强度降低，在0-0.6M NaCl下，B-band的周期性振荡清楚，最大值出现在第二次和第六次闪光，而在0.8M NaCl时，S态振荡基本上消失，S 态氧化还原循环受阻;Fm， J、I和P相荧光水平降低。以上结果都表明盐胁迫使PS II的放氧侧受损伤。且随盐浓度的增加，盐分引起螺旋藻细胞外周蛋白OEC33的降解，在蓝藻中首次提出放氧机构的S态循环受阻，放氧活性降低。 4． 通过OJIP曲线的测定以及JIP-test、闪光诱导的可变荧光衰减动力学、热致发光（TL）的分析，我们研究了盐胁迫对螺旋藻细胞PS II受体侧的影响。结果显示： JIP-test的参数Ψo和φEo随盐浓度的增加而下降,显示QA-到QB 电子传递受阻;可变荧光衰减动力学快相组分半衰期延长，所占总可变荧光百分比下降，表明QA-到QB 电子转移变慢，中相组分半衰期延长、所占百分比下降，说明空的QB位点对PQ的结合减慢，有可能PQ分子对QB位点的结合能力下降;TL B-band和Q-band的峰温度出现了位移，可能QA、QB的氧化还原电势发生了改变。以上结果表明，盐胁迫伤害了PSII受体侧的电子传递。 5． 首次运用闪光诱导下的叶绿素荧光上升及其衰减动力学来研究盐胁迫对PS II受体侧的影响。 6． 盐胁迫下，PS II供体侧和受体侧电子传递受抑制，有活性的PSII反应中心数量下降，说明盐胁迫对螺旋藻细胞PSII的伤害也可能是多位点的作用方式。此外，盐胁迫下，藻细胞放氧活性的下降快于受体侧QA 到QB电子传递所占百分比的下降，有可能PS II放氧侧先受损伤，然后是反应中心和受体侧。上述结果表明盐胁迫下PSII活性的降低是由于PSII供体侧和受体侧电子传递的抑制，有活性的PSII反应中心的减少。 7． 借助螺旋藻类囊体膜的Western杂交分析，来研究盐胁迫对螺旋藻类囊体膜PSII相关蛋白的影响。结果表明，上述PSII活性的抑制是由于类囊体膜蛋白的损失。主要与PSII反应中心CP43、CP47和OEC33蛋白含量的下降有关。 8． PS II机构对盐胁迫的适应涉及以下几个方面：降低吸收横截面，（PC/chla，APC/chla比值的降低）;光系统II光化学反应的改变，通过关闭的PS II反应中心比例的增加，使得PS II机构免于过多激发能的伤害而得以保护;提高了剩余的有活性反应中心的耗能效率（DIo/RC增加）;保持有活性反应中心高的激发能转化效率，比如，TRo/RC保持不变;另外，随盐浓度的增加，由藻胆体向光系统I的能量传递增加，避免过量激发能对 PSII的伤害，使螺旋藻细胞适应盐胁迫环境。

GPIb is involved in platelet aggregation induced by mucetin, a snake C-type lectin protein from Chinese habu (Trimeresurus mucrosquamatus) venom

Mucetin (Trimeresurus mucrosquamatus venom activator, TMVA) is a potent platelet activator purified from Chinese habu (Trimeresurus mucrosquamatus) venom. It belongs to the snake venom heterodimeric C-type lectin family and exists in several multimeric forms. We now show that binding to platelet glycoprotein (GP) lb is involved in mucetin-induced platelet aggregation. Antibodies against GPIb as well as the GPIb-blocking C-type lectin echicetin inhibited mucetin-induced platelet aggregation. Binding of GPIb was confirmed by affinity chromatography and Western blotting. Antibodies against GPVI inhibited convulxin- but not mucetin-induced aggregation. Signalling by mucetin involved rapid tyrosine phosphorylation of a number of proteins including Syk, Src, LAT and PLCgamma2. Mucetininduced phosphorylation of the Fcgamma chain of platelet was greatly promoted by inhibition of alpha(llb)beta(3) by the peptidomimetic EMD 132338, suggesting that phosphatases downstream Of alpha(llb)beta(3) activation are involved in dephosphorylation of Fcgamma. Unlike other multimeric snake C-type lectins that act via GPIb and only agglutinate platelets, mucetin activates alpha(llb)beta(3). Inhibition Of alpha(llb)beta(3) strongly reduced the aggregation response to mucetin, indicating that activation Of alpha(llb)beta(3) and binding of fibrinogen are involved in mucetin-induced platelet aggregation. Apyrase and aspirin also inhibit platelet aggregation induced by mucetin, suggesting that ADP and thromboxaneA(2) are involved in autocrine feedback. Sequence and structural comparison with closely related members of this protein family point to features that may be responsible for the functional differences.

AIDS 免疫治疗相关腺病毒载体的构建

艾滋病（AIDS）是人类免疫缺陷病毒（HIV）感染后引起的一种严重危害人类健 康的致死性传染病。抗HIV 药物挽救和延长了很多HIV 感染者的生命，提高了其生活 质量，但是仍然不能治愈AIDS 和预防传播。最终有效控制HIV 传播和感染的方法可能 仍将依赖于HIV 疫苗的应用。HIV 感染对感染者以及社会造成的灾难性后果使得发展 一个有效的艾滋病疫苗变得尤为紧迫和重要。 负载HIV-1 抗原的DC 回输到HIV-1 感染者体内可以诱导产生较强的抗HIV-1 细 胞免疫反应，这种免疫反应理论上和临床试验都表明治疗AIDS 有效，而且对HARRT 治疗能够产生很好的协同作用。我们拟用感染了重组腺病毒的DC，回输到HIV-1 感染 者体内，期望可以较好地控制病毒复制和阻止感染。为此，本研究我们制备了重组腺病 毒vAd-gp140、vAd-tat 和vAd-gp140-tat，为后续研究奠定基础。 结构蛋白Env 是激发抗体反应的抗原，由于Env 全长有较大细胞毒性，本文采用 了截短的gp140 分子，删除了gp41 的胞内段，降低了gp140 蛋白的细胞毒性。同时保 留了gp41 的跨膜区，表达的蛋白可被正确地锚定在细胞表面，提高蛋白的免疫原性。 将gp140 分子克隆到复制缺陷型的腺病毒载体中，用Wester Blotting 方法检测到gp140 在293 细胞中的表达。 有效的抗 HIV-1 的疫苗应该能够同时激发针对多种亚型病毒株的细胞和体液免疫 反应。早期病毒蛋白激发的CTL 应答在控制病毒载量上更为有效，而且Tat 蛋白的重 要免疫抗原表位和功能区域在不同HIV-1 病毒株之间是高度保守的。Tat 蛋白的多种生 物学功能使得它成为较强的免疫原、共抗原和佐剂，激发T 细胞抗原表位的Th1 型反 应和CTL 反应，扩大体内T 细胞识别的抗原表位谱，提高T 细胞特异性免疫反应。本 文扩增了HIV-1ⅢB 的tat 基因，克隆到复制缺陷性的腺病毒中，构建了重组腺病毒 vAd-tat，并在293 细胞中表达了分子量大小为15kDa 的蛋白。早期蛋白和结构蛋白的联合免疫能够全面地控制病毒复制，在动物实验中一定程度 上保护了猴子。我们将已得到表达的gp140 和tat 基因进行融合表达。利用融合PCR 技 术，扩增gp140 和tat 的融合基因，构建携有HIV-1 gp140-tat 融合基因的重组腺病毒 vAd-gp140-tat。gp140-tat 在293 细胞中的融合表达还需要进一步验证。 下一步的工作是将构建好的重组腺病毒感染DC，检测外源基因在DC 中的表达水 平，对DC 表面分子表型的影响以及对DC 功能的影响。

基因组中新遗传结构的起源与进化

生物遗传物质的多样性从根本上决定了当今地球上生命世界的丰富多 彩。然而生命在漫长的进化历程中如何从最原始的生命形态不断演变，创造 出如此巨大的多样性，是自然留给我们最吸引人的奥秘之一。因此对于分子 进化生物学或进化基因组学的研究者来说，承载生命遗传信息的基因组如何 进化一直以来都是大家关注的一个基本科学命题。本研究主要从两个方面探 讨了基因组中新遗传结构起源的分子机制和进化模式，一方面我们以实验的 方法在黑腹果蝇亚种组中大规模地对新基因进行筛选和鉴定，探讨了果蝇基 因组中新基因起源的分子机制和进化模式；另一方面我们以生物信息学手段 对啮齿类动物大鼠和小鼠进行比较基因组研究，以人和猪的转录序列作为外 群，鉴定了大量啮齿类特有的新外显子，并对这些新外显子的进化特征和产 生机制做了研究。 在果蝇基因组新基因起源与进化的研究工作中，我们综合运用了荧光原 位杂交(fluorescent in situ hybridization, FISH)，Southern 印迹 (Southern blotting)，表达转录分析，生物信息确认和进化速率分析等技术和分析手段， 通过对黑腹果蝇约7000 个基因在黑腹果蝇亚种组8 个近缘物种中同源拷贝数 分布的筛选，鉴定了17 个年轻的散在重复新基因，并对这些新基因的结构、 表达和进化进行了全面的分析。结果表明，DNA 水平的重组机制产生了大量 的新的与祖先基因结构没有冗余的散在重复基因，它们的基因结构以很高的 频率形成了嵌合结构。这些新散在重复基因形成嵌合基因的机会有可能大大 高于预期。同时，我们提供了有力证据证明，重复序列特别是DNAREP1 转 座子很可能通过了非等位同源重组方式介导了散在重复基因的形成。最后， 运用多种行之有效的分析方法，我们证明绝大部分的这些新的嵌合重复基因 是有功能的。在啮齿类新外显子的起源与进化研究中，我们首先利用有完整序列信息 的人和小鼠的基因组，通过同源比对确定了人和小鼠间12,419 个直系同源的 基因组转录单元，这些基因组转录单元中71,039 个大、小鼠共有且相位定义 清晰的外显子被用作后续的分析。通过与人的基因组序列相比较，并进一步 以猪的转录组序列作为第二外群排除掉可能是在人的基因组中丢失的外显子 后，我们共确定了2,695 个啮齿类特有的新外显子。随后对这些新外显子产 生的机制、进化速率、潜在功能以及与选择性剪接之间的关系进行了讨论。 结果显示多数新外显子来自内含子的非重复序列，存在快速的碱基非同义替 换和插入缺失，功能分布上最多的是参与细胞外结合和蛋白间相互作用，提 示这些新外显子的产生可能与啮齿类与外界环境的适应性进化相关。对这些 新外显子与选择性剪接之间关系所做的分析表明，大多数的新外显子存在于 表达量较低的选择性剪接形式中，这说明这些外显子通常参与形成执行组织 特异功能的表达形式，也从一定程度上解释了这些外显子何以能够摆脱对基 因的功能限制而产生较快的进化速度。 总之，上述对果蝇基因组中新基因和啮齿类基因组中新外显子的起源和 进化的研究结果表明，基因组中通过新基因或新外显子等基因组新材料产生 新功能的进化过程是常见的和重要的遗传机制。

Molecular studies on the effect of germanium oxide on sponges, corals and ascidians

The stress response, at the molecular level, of the soft corals Dendronephthya klunzingeri and Heteroxenia sp., hard corals Acropora hyacinthus and A. valenciennesi, an ascidian Symplegma sp. and sponges Latruncula cortica and Callyspongia crassa to germanium oxide (GeO sub(2)) was evaluated. Evaluation was carried out using bioindicators. such as the level of expression of each of the heat shock proteins (HSPs) and the silicatein enzyme in response to the compound. However, the expression was measured by SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE) and western blotting. The harmful concentration of GeO sub(2) that produced noticeable molecular changes in the studied samples during the first 6-24 hours was 6 μg/ml. The two studied soft corals as well as the ascidian responded to the harmful concentration of germanium oxide by expressing the heat-shock protein 90 (hsp90), while the two hard corals responded by expressing hsp70, C. crassa by decreasing the level of silicatein enzyme and sponge L. cortica produced no change by any of the used biomarkers, The soft coral Heteroxenia sp. was found to be sensitive to mechanical stress during the experiment and it was more sensitive to 6 μg/ml of GeO sub(2) than the other soft coral D. klunzingeri. The two studied hard corals were sensitive to mechanical stress during the experiment, but A. hyacinth us showed higher sensitivity than A. valenciennesi. However, these 2 corals displayed reverse response to GeO sub(2). Primitive evidences were found in the SDS PAGE to distinguish the tissue of the soft coral from that of the hard coral on the molecular level; the soft coral showed two prominent protein bands (45 and 50 kDa) while the two prominent protein bands for hard corals were 31 and 116 kDa.

Characterization of acid-sensing ion channels in dorsal horn neurons of rat spinal cord

Acid-sensing ion channels (ASICs) are ligand-gated cation channels activated by extracellular protons. In periphery, they contribute to sensory transmission, including that of nociception and pain. Here we characterized ASIC-like currents in dorsal horn neurons of the rat spinal cord and their functional modulation in pathological conditions. Reverse transcriptase-nested PCR and Western blotting showed that three ASIC isoforms, ASIC1a, ASIC2a, and ASIC2b, are expressed at a high level in dorsal horn neurons. Electrophysiological and pharmacological properties of the proton-gated currents suggest that homomeric ASIC1a and/or heteromeric ASIC1a + 2b channels are responsible for the proton-induced currents in the majority of dorsal horn neurons. Acidification-induced action potentials in these neurons were compatible in a pH-dependent manner with the pH dependence of ASIC-like current. Furthermore, peripheral complete Freund's adjuvant-induced inflammation resulted in increased expression of both ASIC1a and ASIC2a in dorsal horn. These results support the idea that the ASICs of dorsal horn neurons participate in central sensory transmission/modulation under physiological conditions and may play important roles in inflammation-related persistent pain.

Nuclear matrix of the most primitive eukaryote Archezoa

Accumulating evidence suggests that unicellular Archezoa are the most primitive eukaryotes and their nuclei are of significance to the study of evolution of the eukaryotic nucleus. Nuclear matrix is an ubiquitous important structure of eukaryotic nucleus; its evolution is certainly one of the most important parts of the evolution of nucleus. To study the evolution of nuclear matrix, nuclear matrices of Archezoa are investigated. Giardia lamblia cells are extracted sequentially. Both embedment-free section EM and whole mount cell EM of the extracted cells show that, like higher eukaryotes, this species has a residual nuclear matrix in its nucleus and rich intermediate filaments in its cytoplasm, and the two networks connect with each other to form a united network. But its nuclear matrix does not have nucleolar matrix and its lamina is not as typical as that of higher eukaryotes; Western blotting shows that lamina of Giardia and two other Archezoa Entamoeba invadens and Trichomonas vaginali all contain only one polypeptide each which reacts with a mammalia anti-lamin polyclonal serum and is similar to lamin B (67 ku) of mammlia in molecular weight. According to the results and references, it is suggested that nuclear matrix is an early acquisition of the eukaryotic nucleus, and it and the "eukaryotic chromatin" as a whole must have originated very early in the process of evolution of eukaryotic cell, and their origin should be an important prerequisite of the origin of eukaryotic nucleus; in the iamin (gene) family, B-type lamins (gene) should be the ancestral type and that A-type lamins (gene) might derive therefrom.