La neoangiogenesi nel reimpianto autologo di tessuto ovarico in pazienti a rischio di fallimento ovarico precoce: ottimizzazione dei metodi di crioconservazione di corticle ovarica

Introduzione L’efficacia dei chemio/radioterapici ha aumentato notevolmente l’aspettativa di vita delle pazienti oncologiche, tuttavia, questi trattamenti possono compromettere la funzionalità ovarica. La crioconservazione di tessuto ovarico, con il successivo reimpianto, ha lo scopo di preservare la fertilità delle pazienti a rischio di fallimento ovarico precoce. Scopo dello studio Definire la migliore procedura di crioconservazione e reimpianto in grado di ottenere la neovascolarizzazione del tessuto reimpiantato nel minor tempo possibile al fine di diminuire la perdita follicolare causata dall’ischemia durante la procedura. Materiali e metodi Per ciascuna paziente (3) le biopsie ovariche, sono state prelevate laparoscopicamente e crioconservate secondo il protocollo di congelamento lento/scongelamento rapido. Campioni di corticale ovarica sono stati processati per l’analisi istologica, ultrastrutturale, immuistochimica e confocale per valutare la preservazione morfologiaca del tessuto. Le fettine di corticale ovarica sono state scongelate e reimpiantate ortotopicamente (2), nelle ovaia e in due tasche peritoneali, o eterotopicamente (1), in due tasche create nel sottocute sovrapubico. Risultati Le analisi di microscopia hanno mostrato il mantenimento di una discreta morfologia dello stroma, e dei vasi criopreservati e un lieve ma non significativo danneggiamento dei follicoli scongelati. Tutte le pazienti hanno mostrato la ripresa della funzionalità endocrina rispettivamente dopo 2/4 mesi dal reimpianto. Il color-doppler, inoltre ha rivelato un significativo aumento della vascolarizzazione ovarica rispetto alla quasi totale assenza di vascolarizzazione prima del reimpianto, quando le pazienti mostravano una conclamata menopausa. Conclusioni Lo studio ha confermato la ripresa della vascolarizzazione dell’ovaio in seguito a reimpianto avascolare di fettine di corticale, senza l’impiego di fattori esogeni o meccanici aggiuntivi, in tempi concordanti con i dati della letteratura. I risultati sono incoraggianti e l’avanzare degli studi e della ricerca potranno contribuire allo sviluppo di nuove metodologie di reimpianto che possano avere un successo clinico ed una sicurezza superiori a quelle finora ottenute.

Residual visual processing following real or virtual lesions to primary visual pathways

Lesions to the primary geniculo-striate visual pathway cause blindness in the contralesional visual field. Nevertheless, previous studies have suggested that patients with visual field defects may still be able to implicitly process the affective valence of unseen emotional stimuli (affective blindsight) through alternative visual pathways bypassing the striate cortex. These alternative pathways may also allow exploitation of multisensory (audio-visual) integration mechanisms, such that auditory stimulation can enhance visual detection of stimuli which would otherwise be undetected when presented alone (crossmodal blindsight). The present dissertation investigated implicit emotional processing and multisensory integration when conscious visual processing is prevented by real or virtual lesions to the geniculo-striate pathway, in order to further clarify both the nature of these residual processes and the functional aspects of the underlying neural pathways. The present experimental evidence demonstrates that alternative subcortical visual pathways allow implicit processing of the emotional content of facial expressions in the absence of cortical processing. However, this residual ability is limited to fearful expressions. This finding suggests the existence of a subcortical system specialised in detecting danger signals based on coarse visual cues, therefore allowing the early recruitment of flight-or-fight behavioural responses even before conscious and detailed recognition of potential threats can take place. Moreover, the present dissertation extends the knowledge about crossmodal blindsight phenomena by showing that, unlike with visual detection, sound cannot crossmodally enhance visual orientation discrimination in the absence of functional striate cortex. This finding demonstrates, on the one hand, that the striate cortex plays a causative role in crossmodally enhancing visual orientation sensitivity and, on the other hand, that subcortical visual pathways bypassing the striate cortex, despite affording audio-visual integration processes leading to the improvement of simple visual abilities such as detection, cannot mediate multisensory enhancement of more complex visual functions, such as orientation discrimination.

Geomorphologische Untersuchungen im Land der tausend Hügel - oder: Wie europäisch ist die rwandische Landschaftsentwicklung?

Das ursprüngliche Ziel der vorliegenden Dissertation war die Untersuchung der Talgenese im Zentralen Hügelland Rwandas. Entstehung und Form der Täler, die Stratigraphie und das Alter der Hang- und Talsedimente sowie die wirkenden reliefgestaltenden Prozesse sind bei weitem nicht abschließend erforscht. Da Strukturen und Prozesse im Rahmen von Prozessresponssystemen in Wechselwirkung stehen, bietet die Untersuchung der Strukturen gleich zwei Möglichkeiten, sich den Prozessen zu nähern: Strukturen sind sowohl Verursacher als auch Indikatoren von Prozessen. Entsprechend der ursprünglichen Fragestellung sollten nach einer Beschreibung der gegenwärtigen Strukturen (morphographische Geomorphologie) die formbildenden Prozesse ergründet werden (funktionale Geomorphologie), um dann die Entwicklung der Strukturen und Prozesse unter Einbeziehung der relevanten Phasen der Erdgeschichte und des Paläoklimas zu rekonstruieren (genetische Geomorphologie). Im Verlauf der zu diesem Zweck durchgeführten geomorphologisch-stratigraphischen Untersuchungen in den Tälern der Region von Butare (Südrwanda) stellten sich aber die holozänen Hangdeckschichten und Talfüllungen als derart mächtig heraus, dass tiefer liegende Sedimente nicht erschlossen werden konnten. Die älteren Strukturen ließen sich daher nur unzureichend rekonstruieren und die eingangs formulierte Fragestellung konnte nicht wie erwartet bearbeitet werden. Angesichts der Mächtigkeit der Sedimente wurde offensichtlich, dass sowohl die spätpleistozäne als auch die holozäne Dimension der Sedimentbildung völlig unterschätzt wurde. Diese Beobachtungen warfen zwei grundlegende Fragen auf: einerseits die Frage warum die holozänen Sedimente so mächtig ausgebildet sind, und andererseits, weshalb ihre Mächtigkeit derartig unterschätzt wurde. Rasch stellte sich heraus, dass die Bearbeitung der ersten Frage eine interdisziplinäre Öffnung und die der zweiten Frage eine interkulturelle Öffnung der Fragestellung erforderte. Dabei stellen sich vor allem zwei Fragen: Zum einen, inwiefern der europäische Ursprung der Begriffe, Theorien und Modelle, die zur Beschreibung und Interpretation der rwandischen landschaftlichen und landschaftsgestaltenden Prozesse verwendet werden, eben jene Beschreibung und Interpretation beeinflusst, und zum anderen, ob und inwiefern auch naturwissenschaftliche Disziplinen in ihrem Umgang mit ‚natürlich gedachten’ Strukturen und Prozessen von diesen Konstruktionen betroffen sind. Ziel der Dekonstruktion der Begriffe, Theorien und Modelle ist kein ‚richtigerer’ oder ‚wahrhaftigerer’, sondern ein ‚bewussterer’ Umgang mit den Begriffen, Theorien und Modellen und dadurch eine bewusstere Rekonstruktion der Strukturen und Prozesse der Landschaften und Paläolandschaften des rwandischen Zentralen Hügellandes.rn

Effetti sulle funzioni autonomiche e sugli stati di veglia e di sonno della manipolazione centrale farmacologica del sistema ipocretinergico nel ratto

Obiettivo della tesi è stato quello di studiare il ruolo svolto dall’ipotalamo laterale (LH) nella regolazione dei processi di integrazione dell’attività autonomica e termoregolatoria con quella degli stati di veglia e sonno. A questo scopo, l’attività dell’LH è stata inibita per 6 ore (Esperimento A) mediante microiniezioni locali dell’agonista GABAA muscimolo nel ratto libero di muoversi, nel quale sono stati monitorati in continuo l’elelttroencefalogramma, l’elettromiogramma nucale, la pressione arteriosa (PA) e la temperatura ipotalamica (Thy) e cutanea. Gli animali sono stati studiati a temperatura ambientale (Ta) di 24°C e 10°C. I risultati hanno mostrato che l’inibizione acuta dell’LH riduce l’attività di veglia e sopprime la comparsa del sonno REM. Ciò avviene attraverso l’induzione di uno stato di sonno NREM caratterizzato da ipersincronizzazione corticale, con scomparsa degli stati transizionali al sonno REM. Quando l’animale è esposto a bassa Ta, tali alterazioni si associano a un ampio calo della Thy, che viene compensato da meccanismi vicarianti solo dopo un paio d’ore dall’iniezione. Sulla base di tali risultati, si è proceduto ad un ulteriore studio (Esperimento B) volto ad indagare il ruolo del neuropeptide ipocretina (prodotto in modo esclusivo a livello dell’LH) nei processi termoregolatori, mediante microiniezioni del medesimo nel bulbo rostrale ventromediale (RVMM), stazione cruciale della rete nervosa preposta all’attivazione dei processi termogenetici. La somministrazione di ipocretina è stata in grado di attivare la termogenesi e di potenziare la comparsa della veglia, con concomitante lieve incremento della PA e della frequenza cardiaca, quando effettuata alle Ta di 24°C o di 10°C, ma non alla Ta di 32°C. In conclusione, i risultati indicano che l’LH svolge un ruolo cruciale nella promozione degli stati di veglia e di sonno REM e, per tramite dell’ipocretina, interviene in modo coplesso a livello del RVMM nella regolazione dei processi di coordinamento dell'attività di veglia con quella termoregolatoria.

Biomechanics of the distal radio-ulnar joint: A finite element study (biomeccanica dell'articolazione radio-ulnare distale: Studio agli elementi finiti)

Il metodo agli elementi finiti è stato utilizzato per valutare la distribuzione dei carichi e delle deformazioni in numerose componenti del corpo umano. L'applicazione di questo metodo ha avuto particolare successo nelle articolazioni con geometria semplice e condizioni di carico ben definite, mentre ha avuto un impatto minore sulla conoscenza della biomeccanica delle articolazioni multi-osso come il polso. Lo scopo di questo lavoro è quello di valutare gli aspetti clinici e biomeccanici dell’articolazione distale radio-ulnare, attraverso l’utilizzo di metodi di modellazione e di analisi agli elementi finiti. Sono stati progettati due modelli 3D a partire da immagini CT, in formato DICOM. Le immagini appartenevano ad un paziente con articolazione sana e ad un paziente con articolazione patologica, in particolare si trattava di una dislocazione ulnare traumatica. Le componenti principali dei modelli presi in considerazione sono stati: radio, ulna, cartilagine, legamento interosso, palmare e distale. Per la realizzazione del radio e dell’ulna sono stati utilizzati i metodi di segmentazione “Thresholding” e “RegionGrowing” sulle immagini e grazie ad operatori morfologici, è stato possibile distinguere l’osso corticale dall’osso spongioso. Successivamente è stata creata la cartilagine presente tra le due ossa, attraverso operazioni di tipo booleano. Invece, i legamenti sono stati realizzati prendendo i punti-nodo del radio e dell’ulna e formando le superfici tra di essi. Per ciascuna di queste componenti, sono state assegnate le corrispondenti proprietà dei materiali. Per migliorare la qualità dei modelli, sono state necessarie operazioni di “Smoothing” e “Autoremesh”. In seguito, è stata eseguita un’analisi agli elementi finiti attraverso l’uso di vincoli e forze, così da simulare il comportamento delle articolazioni. In particolare, sono stati simulati lo stress e la deformazione. Infine, grazie ai risultati ottenuti dalle simulazioni, è stato possibile verificare l’eventuale rischio di frattura in differenti punti anatomici del radio e dell’ulna nell’articolazione sana e patologica.

Laplace operator on finite graphs and a network diffusion model for the progression of the Alzheimer disease

Nella tesi viene descritto il Network Diffusion Model, ovvero il modello di A. Ray, A. Kuceyeski, M. Weiner inerente i meccanismi di progressione della demenza senile. In tale modello si approssima l'encefalo sano con una rete cerebrale (ovvero un grafo pesato), si identifica un generale fattore di malattia e se ne analizza la propagazione che avviene secondo meccanismi analoghi a quelli di un'infezione da prioni. La progressione del fattore di malattia e le conseguenze macroscopiche di tale processo(tra cui principalmente l'atrofia corticale) vengono, poi, descritte mediante approccio matematico. I risultati teoretici vengono confrontati con quanto osservato sperimentalmente in pazienti affetti da demenza senile. Nella tesi, inoltre, si fornisce una panoramica sui recenti studi inerenti i processi neurodegenerativi e si costruisce il contesto matematico di riferimento del modello preso in esame. Si presenta una panoramica sui grafi finiti, si introduce l'operatore di Laplace sui grafi e si forniscono stime dall'alto e dal basso per gli autovalori. Al fine di costruire una cornice matematica completa si analizza la relazione tra caso discreto e continuo: viene descritto l'operatore di Laplace-Beltrami sulle varietà riemanniane compatte e vengono fornite stime dall'alto per gli autovalori dell'operatore di Laplace-Beltrami associato a tali varietà a partire dalle stime dall'alto per gli autovalori del laplaciano sui grafi finiti.

Struttura degli organi linfoidi nei Cetacei

I dati riportati in letteratura relativi alla struttura degli organi linfoidi dei Cetacei sono scarsi, talvolta discordanti e riferiti solo ad alcune specie. Per questo motivo è stato condotto il presente studio che ha utilizzato il tursiope (Tursiops truncatus) come specie di riferimento. In particolare, in tre soggetti di tursiope è stata analizzata, mediante l’ausilio di specifici software di analisi dell’immagine, la struttura dei seguenti organi linfoidi: timo, milza e linfonodi. Il timo, analogamente a quanto si osserva negli altri Mammiferi, si presenta come organo lobulato. In ciascun lobulo è possibile individuare due zone: la corticale e la midollare. A differenza di quanto si osserva nell’Uomo, è interessante sottolineare come nella midollare di ciascun lobulo non sia mai stata osservata la componente fibrillare. E’ possibile ipotizzare che tale differenza sia dovuta ad eventi connessi con l’organogenesi del timo. Nel tursiope il rapporto cortico/midollare non mostra differenze rispetto a quanto si osserva in altri Mammiferi. La milza del tursiope mostra caratteristiche strutturali simili a quelle osservate in altri Mammiferi. Nel tursiope, rispetto ad altri Mammiferi (Equidi, Ruminanti, Suidi e Carnivori), la quantità di polpa bianca, sul totale della polpa splenica, appare decisamente inferiore (5% vs 30%). Dal momento che le dimensioni della milza non sono particolarmente evidenti, anche la polpa rossa, se rapportata alle dimensioni dell’animale, non si presenta abbondante come in altre specie. Tale dato indica come la milza del tursiope, analogamente a quanto si osserva nell’Uomo e nei Roditori, non svolge alcuna funzione di deposito del sangue. I linfonodi di tursiope sono, tra gli organi linfoidi esaminati, quelli che mostrano le maggiori differenze strutturali rispetto a quelli di numerosi altri Mammiferi (eccezion fatta per il maiale). I noduli linfatici ed il tessuto internodulare sono, infatti, posti sia nella parte superficiale che in quella profonda del linfonodo. Tale aspetto non consente di identificare la zona paracorticale e di definire una precisa delimitazione topografica tra corticale e midollare. Il rapporto tra noduli linfatici e tessuto internodulare indica come nel linfonodo di tursiope sia più diffuso il tessuto internodulare che, a differenza del nodulo linfatico (area B-competente), contiene anche territori T-competenti.

Tecnologie biomediche per lo studio e la riabilitazione della funzionalita retinica in condizioni fisiopatologiche

L’occhio è l’organo di senso responsabile della visione. Uno strumento ottico il cui principio di funzionamento è paragonabile a quanto avviene in una macchina fotografica. Secondo l’Organizzazione mondiale della sanità (WHO 2010) sulla Terra vivono 285 milioni di persone con handicap visivo grave: 39 milioni sono i ciechi e 246 milioni sono gli ipovedenti. Si evince pertanto la necessità di tecnologie in grado di ripristinare la funzionalità retinica nelle differenti condizioni fisiopatologiche che ne causano la compromissione. In quest’ottica, scopo di questa tesi è stato quello di passare in rassegna le principali tipologie di sistemi tecnologici volti alla diagnosi e alla terapia delle fisiopatologie retiniche. La ricerca di soluzioni bioingegneristiche per il recupero della funzionalità della retina in condizioni fisiopatologiche, coinvolge differenti aree di studio, come la medicina, la biologia, le neuroscienze, l’elettronica, la chimica dei materiali. In particolare, sono stati descritti i principali impianti retinali tra cui l’impianto di tipo epiretinale e subretinale, corticale e del nervo ottico. Tra gli impianti che ad oggi hanno ricevuto la certificazione dell’Unione Europea vi sono il sistema epiretinale Argus II (Second Sight Medical Products) e il dispositivo subretinale Alpha IMS (Retina Implant AG). Lo stato dell’arte delle retine artificiali, basate sulla tecnologia inorganica, trova tuttavia limitazioni legate principalmente a: necessità di un’alimentazione esterna, biocompatibilità a lungo termine, complessità dei processi di fabbricazione, la difficoltà dell’intervento chirurgico, il numero di elettrodi, le dimensioni e la geometria, l’elevata impedenza, la produzione di calore. Approcci bioingegneristici alternativi avanzano nel campo d’indagine della visione artificiale. Fra le prospettive di frontiera, sono attualmente in fase di studio le tecnologie optogenetiche, il cui scopo è la fotoattivazione di neuroni compromessi. Inoltre, vengono annoverate le tecnologie innovative che sfruttano le proprietà meccaniche, optoelettroniche e di biocompatibilità delle molecole di materiali organici polimerici. L’integrazione di funzioni fotoniche nell’elettronica organica offre nuove possibilità al campo dell’optoelettronica, che sfrutta le proprietà ottiche e elettroniche dei semiconduttori organici per la progettazione di dispositivi ed applicazioni optoelettronici nel settore dell’imaging e del rilevamento biomedico. La combinazione di tecnologie di tipo organico ed organico potrebbe aprire in prospettiva la strada alla realizzazione di dispositivi retinici ed impianti di nuova generazione.

Geometria frattale: analisi della lacunarita cerebrale in MRI

La geometria frattale descrive la complessità strutturale di oggetti che presentano, entro certi limiti, invarianza a fattori di scala. Obiettivo di questa tesi è l’analisi di indici frattali della morfologia cerebrale e cerebellare da immagini di risonanza magnetica (MRI) pesate T1 e della loro correlazione con l’età. A tale scopo sono state analizzate la dimensione frattale (D0) e la lacunarità (λs), indice di eterogeneità strutturale, della sostanza grigia (GM) e bianca (WM), calcolate mediante algoritmi di box counting e di differential gliding box, implementati in linguaggio C++, e regressione lineare con scelta automatica delle scale spaziali. Gli algoritmi sono stati validati su fantocci 3D ed è stato proposto un metodo per compensare la dipendenza di λs dalle dimensioni dell’immagine e dalla frazione di immagine occupata. L’analisi frattale è stata applicata ad immagini T1 a 3T del dataset ICBM (International Consortium for Brain Mapping) composto da 86 soggetti (età 19-85 anni). D0 e λs sono state rispettivamente 2.35±0.02 (media±deviazione standard) e 0.41±0.05 per la GM corticale, 2.34±0.03 e 0.35±0.05 per la WM cerebrale, 2.19±0.05 e 0.17±0.02 per la GM cerebellare, 1.95±0.06 e 0.30±0.04 per la WM cerebellare. Il coefficiente di correlazione lineare tra età e D0 della GM corticale è r=−0.38 (p=0.003); tra età e λs, r=0.72 (p<0.001) (mostrando che l’eterogeneità strutturale aumenta con l’invecchiamento) e tra età e λs compensata rispetto al volume della GM cerebrale (GMV), r=0.51 (p<0.001), superiore in valore assoluto a quello tra età e GMV (r=−0.45, p<0.001). In un modello di regressione lineare multipla, dove l’età è stata modellata da D0, λ e GMV della GM corticale, λs è risultato l’unico predittore significativo (r parziale=0.62, p<0.001). La lacunarità λs è un indice sensibile alle variazioni strutturali dovute all’invecchiamento cerebrale e si candida come biomarcatore nella valutazione della complessità cerebrale nelle malattie neurodegenerative.

Méthode Fanjul: dosage pondéral des bétons légers et lourds

La détermination directe des caractéristiques de cisaillement des bétons par des essais universels est un problème qui reste encore une préoccupation majeure des chercheurs. La plupart des études disponibles consistent à appliquer un couple de torsion à un cylindre creux ayant un rapport épaisseur/rayon le plus faible possible. Ceci pour pouvoir élaborer un critère lié au comportement du matériau et non de la structure (Fourd et al. 1982). Cependant, ces essais peuvent présenter des dispersions liées aux problèmes de fragilité à la rupture ou de non homogénéité du matériau au sein de la paroi (Gotuwka et al. 1999). Pour cela, un dispositif expérimental original a été utilisé et qui consiste en la création de deux zones de contrainte nulle par l’emplacement de corps déformables au moment du coulage de l’éprouvette. De nouvelles conditions aux frontières sont créées permettant de transformer la sollicitation de compression en cisaillement plan sur une zone bien déterminée. L’utilisation de cette technique permet la détermination de l’influence de l’inclinaison du plan de rupture sur le comportement du béton en cisaillement. Le dispositif permet d’assurer la perpendicularité NOvEMBRE 2012 5 des génératrices du cylindre ainsi que la répartition et l’homogénéité des contraintes.

Réadaptation et performance visuelle chez la personne hémianopsique : une étude de cas portant sur les saccades oculaires et le blindsight

But: La perte unilatérale du cortex visuel postérieur engendre une cécité corticale controlatérale à la lésion, qu’on appelle hémianopsie homonyme (HH). Celle-ci est notamment accompagnée de problèmes d’exploration visuelle dans l’hémichamp aveugle dus à des stratégies oculaires déficitaires, qui ont été la cible des thérapies de compensation. Or, cette perte de vision peut s’accompagner d’une perception visuelle inconsciente, appelée blindsight. Notre hypothèse propose que le blindsight soit médié par la voie rétino-colliculaire extrastriée, recrutant le colliculus supérieur (CS), une structure multisensorielle. Notre programme a pour objectif d’évaluer l’impact d’un entraînement multisensoriel (audiovisuel) sur la performance visuelle inconsciente des personnes hémianopsiques et les stratégies oculaires. Nous essayons, ainsi, de démontrer l’implication du CS dans le phénomène de blindsight et la pertinence de la technique de compensation multisensorielle comme thérapie de réadaptation. Méthode: Notre participante, ML, atteinte d’une HH droite a effectué un entraînement d’intégration audiovisuel pour une période de 10 jours. Nous avons évalué la performance visuelle en localisation et en détection ainsi que les stratégies oculaires selon trois comparaisons principales : (1) entre l’hémichamp normal et l’hémichamp aveugle; (2) entre la condition visuelle et les conditions audiovisuelles; (3) entre les sessions de pré-entraînement, post-entraînement et 3 mois post-entraînement. Résultats: Nous avons démontré que (1) les caractéristiques des saccades et des fixations sont déficitaires dans l’hémichamp aveugle; (2) les stratégies saccadiques diffèrent selon les excentricités et les conditions de stimulations; (3) une adaptation saccadique à long terme est possible dans l’hémichamp aveugle si l’on considère le bon cadre de référence; (4) l’amélioration des mouvements oculaires est liée au blindsight. Conclusion(s): L’entraînement multisensoriel conduit à une amélioration de la performance visuelle pour des cibles non perçues, tant en localisation qu’en détection, ce qui est possiblement induit par le développement de la performance oculomotrice.

Contribution différentielle de Neuroligine‐1 et d’EphA4 à la régulation du sommeil

Le sommeil est un besoin vital et le bon fonctionnement de l’organisme dépend de la quantité et de la qualité du sommeil. Le sommeil est régulé par deux processus : un processus circadien qui dépend de l’activité des noyaux suprachiasmatiques de l’hypothalamus et qui régule le moment durant lequel nous allons dormir, et un processus homéostatique qui dépend de l’activité neuronale et se reflète dans l’intensité du sommeil. En effet, le sommeil dépend de l’éveil qui le précède et plus l’éveil dure longtemps, plus le sommeil est profond tel que mesuré par des marqueurs électroencéphalographiques (EEG). Des études ont montré que le bon fonctionnement de ces deux processus régulateurs du sommeil dépend de la plasticité synaptique. Ainsi, les éléments synaptiques régulant la communication et la force synaptique sont d’importants candidats pour agir sur la physiologie de la régulation du sommeil. Les molécules d’adhésion cellulaire sont des acteurs clés dans les mécanismes de plasticité synaptique. Elles régulent l’activité et la maturation des synapses. Des études ont montré que leur absence engendre des conséquences similaires au manque de sommeil. Le but de ce projet de thèse est d’explorer l’effet de l’absence de deux familles de molécule d’adhésion cellulaire, les neuroligines et la famille des récepteur Eph et leur ligand les éphrines dans les processus régulateurs du sommeil. Notre hypothèse est que l’absence d’un des membres de ces deux familles de molécule affecte les mécanismes impliqués dans le processus homéostatique de régulation du sommeil. Afin de répondre à notre hypothèse, nous avons étudié d’une part l’activité EEG chez des souris mutantes n’exprimant pas Neuroligine‐1 (Nlgn1) ou le récepteur EphA4 en condition normale et après une privation de sommeil. D’autre part, nous avons mesuré les changements moléculaires ayant lieu dans ces deux modèles après privation de sommeil. Au niveau de l’activité EEG, nos résultats montrent que l’absence de Nlgn1 augmente la densité des ondes lentes en condition normale et augment l’amplitude et la pente des ondes lentes après privation de sommeil. Nlgn1 est nécessaire au fonctionnement normal de la synchronie corticale, notamment après une privation de sommeil, lui attribuant ainsi un rôle clé dans l’homéostasie du sommeil. Concernant le récepteur EphA4, son absence affecte la durée du sommeil paradoxal ainsi que l’activité sigma qui dépendent du processus circadien. Nos résultats suggèrent donc que ce récepteur est un élément important dans la régulation circadienne du sommeil. Les changements transcriptionnels en réponse à la privation de sommeil des souris n’exprimant pas Nlgn1 et EphA4 ne sont pas différents des souris sauvages. Toutefois, nous avons montré que la privation de sommeil affectait la distribution des marques épigénétiques sur le génome, tels que la méthylation et l’hydroxyméthylation, et que l’expression des molécules régulant ces changements est modifiée chez les souris mutantes pour le récepteur EphA4. Nos observations mettent en évidence que les molécules d’adhésion cellulaire, Nlgn1 et le récepteur EphA4, possèdent un rôle important dans les processus homéostatique et circadien du sommeil et contribuent de manière différente à la régulation du sommeil.

Bases moléculaires et cellulaires d’un trouble neurodéveloppemental causé par l’haploinsuffisance de SYNGAP1

La déficience intellectuelle est la cause d’handicap la plus fréquente chez l’enfant. De nombreuses évidences convergent vers l’idée selon laquelle des altérations dans les gènes synaptiques puissent expliquer une fraction significative des affections neurodéveloppementales telles que la déficience intellectuelle ou encore l’autisme. Jusqu’à récemment, la majorité des mutations associées à la déficience intellectuelle a été liée au chromosome X ou à la transmission autosomique récessive. D’un autre côté, plusieurs études récentes suggèrent que des mutations de novo dans des gènes à transmission autosomique dominante, requis dans les processus de la plasticité synaptique peuvent être à la source d’une importante fraction des cas de déficience intellectuelle non syndromique. Par des techniques permettant la capture de l’exome et le séquençage de l’ADN génomique, notre laboratoire a précédemment reporté les premières mutations pathogéniques dans le gène à transmission autosomique dominante SYNGAP1. Ces dernières ont été associées à des troubles comportementaux tels que la déficience intellectuelle, l’inattention, des problèmes d’humeur, d’impulsivité et d’agressions physiques. D’autres patients sont diagnostiqués avec des troubles autistiques et/ou des formes particulières d’épilepsie généralisée. Chez la souris, le knock-out constitutif de Syngap1 (souris Syngap1+/-) résulte en des déficits comme l’hyperactivité locomotrice, une réduction du comportement associée à l’anxiété, une augmentation du réflexe de sursaut, une propension à l’isolation, des problèmes dans le conditionnement à la peur, des troubles dans les mémoires de travail, de référence et social. Ainsi, la souris Syngap1+/- représente un modèle approprié pour l’étude des effets délétères causés par l’haploinsuffisance de SYNGAP1 sur le développement de circuits neuronaux. D’autre part, il est de première importance de statuer si les mutations humaines aboutissent à l’haploinsuffisance de la protéine. SYNGAP1 encode pour une protéine à activité GTPase pour Ras. Son haploinsuffisance entraîne l’augmentation des niveaux d’activité de Ras, de phosphorylation de ERK, cause une morphogenèse anormale des épines dendritiques et un excès dans la concentration des récepteurs AMPA à la membrane postsynaptique des neurones excitateurs. Plusieurs études suggèrent que l’augmentation précoce de l’insertion des récepteurs AMPA au sein des synapses glutamatergiques contribue à certains phénotypes observés chez la souris Syngap1+/-. En revanche, les conséquences de l’haploinsuffisance de SYNGAP1 sur les circuits neuronaux GABAergiques restent inconnues. Les enjeux de mon projet de PhD sont: 1) d’identifier l’impact de mutations humaines dans la fonction de SYNGAP1; 2) de déterminer si SYNGAP1 contribue au développement et à la fonction des circuits GABAergiques; 3) de révéler comment l’haploinsuffisance de Syngap1 restreinte aux circuits GABAergiques affecte le comportement et la cognition. Nous avons publié les premières mutations humaines de type faux-sens dans le gène SYNGAP1 (c.1084T>C [p.W362R]; c.1685C>T [p.P562L]) ainsi que deux nouvelles mutations tronquantes (c.2212_2213del [p.S738X]; c.283dupC [p.H95PfsX5]). Ces dernières sont toutes de novo à l’exception de c.283dupC, héritée d’un père mosaïque pour la même mutation. Dans cette étude, nous avons confirmé que les patients pourvus de mutations dans SYNGAP1 présentent, entre autre, des phénotypes associés à des troubles comportementaux relatifs à la déficience intellectuelle. En culture organotypique, la transfection biolistique de l’ADNc de Syngap1 wild-type dans des cellules pyramidales corticales réduit significativement les niveaux de pERK, en fonction de l’activité neuronale. Au contraire les constructions plasmidiques exprimant les mutations W362R, P562L, ou celle précédemment répertoriée R579X, n’engendre aucun effet significatif sur les niveaux de pERK. Ces résultats suggèrent que ces mutations faux-sens et tronquante résultent en la perte de la fonction de SYNGAP1 ayant fort probablement pour conséquences d’affecter la régulation du développement cérébral. Plusieurs études publiées suggèrent que les déficits cognitifs associés à l’haploinsuffisance de SYNGAP1 peuvent émerger d’altérations dans le développement des neurones excitateurs glutamatergiques. Toutefois, si, et auquel cas, de quelle manière ces mutations affectent le développement des interneurones GABAergiques résultant en un déséquilibre entre l’excitation et l’inhibition et aux déficits cognitifs restent sujet de controverses. Par conséquent, nous avons examiné la contribution de Syngap1 dans le développement des circuits GABAergiques. A cette fin, nous avons généré une souris mutante knockout conditionnelle dans laquelle un allèle de Syngap1 est spécifiquement excisé dans les interneurones GABAergiques issus de l’éminence ganglionnaire médiale (souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+). En culture organotypique, nous avons démontré que la réduction de Syngap1 restreinte aux interneurones inhibiteurs résulte en des altérations au niveau de leur arborisation axonale et dans leur densité synaptique. De plus, réalisés sur des coupes de cerveau de souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+, les enregistrements des courants inhibiteurs postsynaptiques miniatures (mIPSC) ou encore de ceux évoqués au moyen de l’optogénétique (oIPSC) dévoilent une réduction significative de la neurotransmission inhibitrice corticale. Enfin, nous avons comparé les performances de souris jeunes adultes Syngap1+/-, Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+ à celles de leurs congénères contrôles dans une batterie de tests comportementaux. À l’inverse des souris Syngap1+/-, les souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+ ne présentent pas d’hyperactivité locomotrice, ni de comportement associé à l’anxiété. Cependant, elles démontrent des déficits similaires dans la mémoire de travail et de reconnaissance sociale, suggérant que l’haploinsuffisance de Syngap1 restreinte aux interneurones GABAergiques dérivés de l’éminence ganglionnaire médiale récapitule en partie certains des phénotypes cognitifs observés chez la souris Syngap1+/-. Mes travaux de PhD établissent pour la première fois que les mutations humaines dans le gène SYNGAP1 associés à la déficience intellectuelle causent la perte de fonction de la protéine. Mes études dévoilent, également pour la première fois, l’influence significative de ce gène dans la régulation du développement et de la fonction des interneurones. D’admettre l’atteinte des cellules GABAergiques illustre plus réalistement la complexité de la déficience intellectuelle non syndromique causée par l’haploinsuffisance de SYNGAP1. Ainsi, seule une compréhension raffinée de cette condition neurodéveloppementale pourra mener à une approche thérapeutique adéquate.

Role of the cotransporter KCC2 in cortical excitatory synapse development and febrile seizure susceptibility

Le co-transporteur KCC2 spécifique au potassium et chlore a pour rôle principal de réduire la concentration intracellulaire de chlore, entraînant l’hyperpolarisation des courants GABAergic l’autorisant ainsi à devenir inhibiteur dans le cerveau mature. De plus, il est aussi impliqué dans le développement des synapses excitatrices, nommées aussi les épines dendritiques. Le but de notre projet est d’étudier l’effet des modifications concernant l'expression et la fonction de KCC2 dans le cortex du cerveau en développement dans un contexte de convulsions précoces. Les convulsions fébriles affectent environ 5% des enfants, et ce dès la première année de vie. Les enfants atteints de convulsions fébriles prolongées et atypiques sont plus susceptibles à développer l’épilepsie. De plus, la présence d’une malformation cérébrale prédispose au développement de convulsions fébriles atypiques, et d’épilepsie du lobe temporal. Ceci suggère que ces pathologies néonatales peuvent altérer le développement des circuits neuronaux irréversiblement. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ces effets ne sont pas encore compris. Nous avons pour but de comprendre l'impact des altérations de KCC2 sur la survenue des convulsions et dans la formation des épines dendritiques. Nous avons étudié KCC2 dans un modèle animal de convulsions précédemment validé, qui combine une lésion corticale à P1 (premier jour de vie postnatale), suivie d'une convulsion induite par hyperthermie à P10 (nommés rats LHS). À la suite de ces insultes, 86% des rats mâles LHS développent l’épilepsie à l’âge adulte, au même titre que des troubles d’apprentissage. À P20, ces animaux presentent une augmentation de l'expression de KCC2 associée à une hyperpolarisation du potentiel de réversion de GABA. De plus, nous avons observé des réductions dans la taille des épines dendritiques et l'amplitude des courants post-synaptiques excitateurs miniatures, ainsi qu’un déficit de mémoire spatial, et ce avant le développement des convulsions spontanées. Dans le but de rétablir les déficits observés chez les rats LHS, nous avons alors réalisé un knock-down de KCC2 par shARN spécifique par électroporation in utero. Nos résultats ont montré une diminution de la susceptibilité aux convulsions due à la lésion corticale, ainsi qu'une restauration de la taille des épines. Ainsi, l’augmentation de KCC2 à la suite d'une convulsion précoce, augmente la susceptibilité aux convulsions modifiant la morphologie des épines dendritiques, probable facteur contribuant à l’atrophie de l’hippocampe et l’occurrence des déficits cognitifs. Le deuxième objectif a été d'inspecter l’effet de la surexpression précoce de KCC2 dans le développement des épines dendritiques de l’hippocampe. Nous avons ainsi surexprimé KCC2 aussi bien in vitro dans des cultures organotypiques d’hippocampe, qu' in vivo par électroporation in utero. À l'inverse des résultats publiés dans le cortex, nous avons observé une diminution de la densité d’épines dendritiques et une augmentation de la taille des épines. Afin de confirmer la spécificité du rôle de KCC2 face à la région néocorticale étudiée, nous avons surexprimé KCC2 dans le cortex par électroporation in utero. Cette manipulation a eu pour conséquences d’augmenter la densité et la longueur des épines synaptiques de l’arbre dendritique des cellules glutamatergiques. En conséquent, ces résultats ont démontré pour la première fois, que les modifications de l’expression de KCC2 sont spécifiques à la région affectée. Ceci souligne les obstacles auxquels nous faisons face dans le développement de thérapie adéquat pour l’épilepsie ayant pour but de moduler l’expression de KCC2 de façon spécifique.

Corrélats neuronaux du circuit des récompenses chez les jeunes à risque parental de troubles de l'humeur

Cette thèse a pour objectif l’investigation du circuit des récompenses, sur les plans comportementaux et neuronaux, chez des adolescents à risque parental élevé de dépression majeure et de trouble bipolaire, en comparaison à des jeunes à risque parental peu élevé. Plus précisément, le but est d’identifier des marqueurs comportementaux et neuronaux du risque de développer une dépression majeure ou un trouble bipolaire, afin d’être en mesure de détecter et de prévenir ces troubles le plus tôt possible pour éviter, ou du moins retarder, leur émergence. Pour ce faire, nous avons réalisé deux études, présentées ici dans deux articles empiriques. Dans le premier article, le fonctionnement comportemental et neuronal du circuit des récompenses a été investigué au moyen d’une tâche d’anticipation et d’obtention de gains et de pertes monétaires, chez des adolescents à risque parental de dépression majeure (i.e., jeunes asymptomatiques dont un des parents souffre de dépression majeure), des adolescents à risque parental de trouble bipolaire (i.e., jeunes asymptomatiques dont un des parents souffre de trouble bipolaire) et des adolescents contrôles (i.e., jeunes asymptomatiques dont les deux parents sont en bonne santé mentale). Au niveau comportemental, les résultats ont révélé une meilleure performance chez les jeunes à risque de dépression majeure lorsqu’ils devaient éviter d’obtenir des pertes monétaires de magnitude variée (0,20$, 1$ ou 5$), ainsi qu’une meilleure performance chez les jeunes à risque de trouble bipolaire sur les essais impliquant d’éviter des pertes monétaires de magnitude nulle (0$). Au niveau neuronal, les jeunes à risque de dépression majeure démontraient une diminution de l’activation du cortex préfrontal dorsolatéral lors de l’anticipation de potentielles pertes monétaires de magnitude variée, tandis que les jeunes à risque de trouble bipolaire démontraient une diminution de l’activation du cortex préfrontal dorsolatéral lors de l’anticipation de potentielles pertes monétaires de magnitude nulle. De plus, les jeunes à risque de dépression majeure tendaient à démontrer une augmentation de l’activité du cortex orbitofrontal durant l’évitement réussi de pertes monétaires, tandis que les jeunes à risque de trouble bipolaire tendaient à démontrer une augmentation de l’activité du cortex orbitofrontal lors de l’obtention de pertes monétaires. Dans le deuxième article, l’intégrité structurelle des régions fronto-limbiques a été investiguée, au moyen de mesures du volume, de l’épaisseur corticale et de la superficie corticale. Les résultats ont mis en évidence, chez les jeunes à risque de trouble bipolaire, un volume plus élevé du cortex préfrontal dorsolatéral, par rapport aux jeunes à risque de dépression majeure et contrôles. De plus, les jeunes à risque de trouble bipolaire présentaient un volume plus élevé du cortex cingulaire postérieur, en comparaison aux jeunes à risque de dépression majeure. Enfin, une diminution de l’épaisseur corticale du cortex orbitofrontal et du gyrus frontal moyen a été observée chez les adolescents à risque de trouble bipolaire, en comparaison au groupe contrôle. L’ensemble de ces résultats démontre ainsi l’existence de particularités comportementales et d’altérations neuronales sur les plans fonctionnel et structurel, chez des jeunes à risque élevé de troubles de l’humeur, et ce, avant même l’émergence des premiers symptômes thymiques. Plus particulièrement, ces caractéristiques pourraient constituer des marqueurs du risque de développer un trouble de l’humeur. Par conséquent, ces marqueurs pourraient aider à mieux identifier les jeunes qui sont le plus à risque de développer un trouble de l’humeur, et ainsi permettre la mise en place précoce de stratégies préventives adaptées, afin d’éviter des trajectoires développementales psychopathologiques.