Cloning and expression of medaka dazl during ernbryogenesis and gametogenesis

The Deleted in azoospermia family consists of RNA-binding proteins Bottle, Daz, and Daz-like (Dazl) that are expressed in the germline. Here, we report the cloning and expression of the medakafish (Oryzias latipes) dazl gene (odazl). Interestingly, although the predicted medaka Dazl protein (oDazl) contains a RRM motif and a DAZ repeat characteristic of its mammalian homologs, it lacks 80 aa at the C-terminus. By RT-PCR, RNA in situ hybridization, Western blotting and fluorescent immunohistochemistry using a rabbit anti-DazI antibody (alpha Oazl), we analyzed the expression patterns of odazl and its protein. The odazl transcript persists throughout embryogenesis and delineates with primordial germ cells. In adults, the expression of odazl RNA and its protein is restricted to germ cells of both the testis and ovary. We observed differential expression of RNA and protein at critical stages of gametogenesis. In the testis, the odazl RNA is low at premeiotic stages, abundant at meiotic stages, but absent in postmeiotic stages; whereas the oDazl protein is rich in premeiotic stages, reduced at meiotic stages, becomes barely detectable or absent in postmeiotic round spermatids or sperm, respectively. This is in sharp mature spermatozoa. In the ovary, the odazl RNA contrast to the human situation where the Dazl transcript and protein are present in and protein persist throughout oogenesis and also show differential expression at premeiotic, meiotic and postmeiotic stages. Thus, the odazl or its protein is a marker for germ cells during embryogenesis and at critical stages of gametogenesis in both sexes of medaka. (c) 2006 Elsevier B.V. All rights reserved.

Characterization and application of monoclonal antibodies against turbot (Scophthalmus maximus) rhabdovirus

Five monoclonal antibodies (mAbs), 1G8, 1H9, 2D2, 2D3, and 2F5, against Scophthalmus maximus rhabdovirus (SMRV) were prepared. Characterization of the mAbs included indirect enzyme-linked immunosorbent assay, isotyping, viral inhibition assay, immunofluorescence staining of virus-infected cell cultures, and Western blot analysis. Isotyping revealed that 1G8 and 1H9 were of the IgG2b subclass and that the other three were IgM. 2D2, 2D3, and 2F5 partially inhibited SMRV infection in epithelioma. papulosum cyprinid (EPC) cell culture. Western blotting showed that all five mAbs could react with two SMRV proteins with molecular masses of approximately 30 kDa (P) and 26 kDa (M). These two proteins were localized within the cytoplasm of SMRV-infected EPC cells by immunofluorescence assay. Also, progressive foci of viral replication in cell cultures were monitored from 6 to 24 h, using mAb 2D3 as the primary antibody. A flow cytometry procedure was used to detect and quantify SMRV-infected (0.01 PFU/cell) EPC cells with mAb 2D3, and 10.8% of cells could be distinguished as infected 36 h postinfection. Moreover, mAb 2D3 was successfully applied for the detection of viral antigen in cryosections from flounder tissues by immunohistochemistry tests.

Vitellogenin in rare minnow (Gobiocypris rarus): identification and induction by waterborne diethylstilbestrol

Rare minnow (Gobiocypris rarus) is a tiny Chinese carp that has a short life cycle and is easily cultured in the laboratory. In this study, juvenile rare minnows were exposed to waterborne diethylstilbestrol (DES) at 0.05, 0.5 and 5 mug/l in laboratory aquaria. After exposure for 4, 8, 13 and 21 days, juvenile fish were collected and vitellogenin (Vtg) was measured in whole body homogenates. Native and SDS electrophoresis followed by Western blotting were performed for Vtg identification, and a non-competitive ELISA was developed. In the DES exposure groups (0.5 and 5 mug/l DES), Vtg appeared after 4 days, increased significantly after 8 days and reached a maximum on day 13. Further, a significant increase in the hepatosomatic index (HSI) was found in the 5 mug/l DES exposure group after 21 days. These results indicate that rare minnow provides a good model for assessing endocrine disruption by environmental estrogens. (C) 2004 Elsevier Inc. All rights reserved.

Differential expression and characterization analysis of a new gene with WD domains in fish oogenesis

A new gene with WD domains is cloned and characterized according to its differential transcription and expression between previtellogenic oocytes (phase I oocytes) and fully-grown oocytes (phase V oocytes) from natural gynogenetic silver crucian carp (Carassius auratus gibelio) by using the combinative methods of suppressive subtraction hybridization, SMART cDNA synthesis and RACE-PCR. The full-length cDNA is 1870 bp. Its 5 ' untranslated region is 210 bp, followed by an open reading frame of 990 bp, which has the typical vertebrate initiator codon of ANNATG. The open reading frame encodes a protein with 329 amino acids. It has 670 bp of 3 ' untranslated region and an AATAAA polyadenylation signal. Because it has 92% homology to STRAP (serine-threonine kinase receptor-associated protein), a recently reported gene, we named it FSTRAP (fish STRAP). Virtual Northern blotting indicated that the FSTRAP was transcribed in fully-grown oocytes (phase V oocytes), but not in previtellogenic oocytes (phase I oocytes). RT-PCR analysis showed that FSTRAP was transcribed in brain, heart, kidney, muscle, ovary, spleen and testis, but not in liver. And its mRNA could be detected in the oocytes from phase II to phase V. Western blotting also showed that FSTRAP protein could be detected in brain, heart, kidney, muscle, ovary, spleen and testis except liver. Results of Western blotting on various oocytes were also similar to the RT-PCR data. FSTRAP protein was not expressed in the previtellogenic oocytes. Its expression initiated from phase II oocytes after vitellogenesis, and was consistent with the mRNA transcription.

Genome segment S8 of grass carp hemorrhage virus encodes a virion protein

The complete nucleotide sequence of the genome segment S8 of grass carp hemorrhage virus (GCHV) was determined from cDNA corresponding to the viral genomic RNA. It is 1,287 nucleotides in length and contains a large open reading frame that could encode a protein of 409 amino acids with a predicted molecular mass of 44 kD. The S8 was expressed using the pET fusion protein vector and detected by Western blotting analysis using the chicken egg IgY against intact GCHV particles, indicating that S8 encodes a virion protein. Amino acid sequence comparisons revealed that the protein encoded by S8 is closely related to protein alpha2 of mammalian reovirus, suggesting that the deduced protein of S8 is an inner capsid protein. Copyright (C) 2001 S. Karger AG, Basel.

Molecular characterization and expression of the M6 gene of grass carp hemorrhage virus (GCHV), an aquareovirus - Brief report

7The complete nucleotide sequence of M6 gene of grass carp hemorrhage virus (GCHV) was determined. It is 2039 nucleotides in length and contains a single large open reading frame that could encode a protein of 648 amino acids with predicted molecular mass of 68.7 kDa. Amino acid sequence comparison revealed that the protein encoded by GCHV M6 is closely related to the protein mul of mammalian reovirus. The M6 gene, encoding the major outer-capsid protein, was expressed using the pET fusion protein vector in Escherichia coli and detected by Western blotting using chicken anti-GCHV immunoglobulin (IgY). The result indicates that the protein encoded by M6 may share a putative Asn-42-Pro-43 proteolytic cleavage site with mul.

猕猴胚胎干细胞神经分化过程中ASPP家族变化的初步研究

为研究肿瘤细胞凋亡调控因子ASPP(Apoptosis-stimulating protein of p53)家族蛋白(ASPP1,ASPP2,iASPP)在猕猴神经系统细胞早期发育过程中是否存在变化,并初步研究其变化趋势,通过体外诱导猕猴胚胎干细胞定向分化为神经前体细胞模拟猕猴神经系统细胞早期发育过程,并对此过程中细胞内ASPP蛋白量进行检测,检测方法使用细胞免疫荧光和western blotting.实验初步检测出,肿瘤调控因子ASPP家族蛋白在猕猴神经系统细胞早期发育过程中在蛋白量和蛋白分子量上有变化,并且可以初步了解其变化趋势.该实验结果表明ASPP蛋白家族作为肿瘤细胞凋亡调控因子与猕猴神经系统早期发育过程有着密切的关系,这也许对将来治疗神经系统退行性疾病和肿瘤发生有一定帮助.

PAR4 和TFF2 在胃肠癌中的表达变异与临床关系以及 TFF2 的重组表达

胃癌和肠癌是常见的威胁人类健康的消化道恶性肿瘤，其发生发展涉及多因 子的作用及调控。其中，在胃肠道都有表达的蛋白酶激活受体（PARs）和三叶 因子蛋白（TFFs）家族都参与肿瘤发生发展的调控过程。正常生理条件下，PARs 的表达与胃肠道消化液的分泌和肌肉的收缩舒张相关。同时，在胃肠道肿瘤的发 生、浸润和转移过程中PARs和TFF2也发挥了作用。而PAR-4，除了具有凝血酶 激活后的血小板聚集功能外，还参与感染、细胞迁移和肿瘤的发生发展。在溃疡 性结肠炎，肠癌组织以及某些肠癌细胞系中都出现PAR4的异常表达，而这种异 常表达可能作为启动肠癌发生的重要环节。TFFs家族蛋白能够对抗粘膜损伤并 且参与修复以发挥保护胃肠道的功能。在肿瘤发生中，三叶因子既有报道作为肿 瘤抑制因子，又有报道作为潜在的肿瘤促进因子。含两个三叶因子结构域的 TFF2，主要表达在胃粘膜的颈细胞。在胃溃疡、慢性萎缩性胃炎及胃癌中，TFF2 的表达具有下降的趋势；而且分化程度越低的胃癌，TFF2的表达量越少，这是 因为TFF2的表达与胃粘膜细胞的增殖和恶性转移相关。在肠道，TFF2可以抑制 一氧化氮（NO）的生成以调节由NO引起的肠炎；在肠炎老鼠的模型中，TFF2 能减轻炎症和溃疡发生的程度，表明TFF2可能通过调节机体的免疫反应来抑制 肠道炎症的发生。 而本实验室前期对大蹼铃蟾皮肤分泌物中获得的新型血小板激动蛋白 -Bm-TFF2与PARs相互作用的实验，促使我们去研究人TFF2与PARs的关系。由 于免疫组化提示TFF2和PAR4在正常胃黏膜中都分布在从基底部到中间的位置， 而且TFF2第二个Loop区序列的保守性，以及和PAR4连接配体（tethered-ligand） 的高度相似性，促使我们推测PAR4和TFF2之间是否存在一种相互作用，或者 hTFF2是否能调节PAR4的生物学活性。所以该篇论文落脚于PAR4和hTFF2，着 重介绍PAR4和TFF2在胃肠道肿瘤中的表达变异以及TFF2对过表达PAR4的细胞 的趋化作用。 我们先用半定量PCR方法检测TFF2和PAR4在胃癌、肠癌及周围远癌部位组 织中mRNA的表达水平。结果提示两个基因在胃癌组织中的表达较周围远癌部位组织减弱，而在肠癌组织中的表达则较周围远癌部位组织增强。Western blotting 也得到相似的结果。为进一步明确PAR4和TFF2在胃癌和肠癌中表达的具体变化 情况，我们继而用实时荧光定量PCR对28例胃癌和38例肠癌及其周围远癌部位组 织中TFF2和PAR4的表达进行了研究。结果显示胃癌组织中两个基因mRNA的表 达都显著低于远癌部位组织（P<0.001），而肠癌组织中两个基因mRNA的表达 则显著高于远癌部位组织（P<0.001）。结合临床病理资料提示PAR4在淋巴结转 移的胃癌患者中的表达低于无淋巴结转移的患者（P<0.05），在胃窦癌中的表达 明显低于非胃窦癌（P<0.05）；而发生淋巴结转移的肠癌患者其TFF2和PAR4基 因的表达都显著高于无淋巴结转移的肠癌患者（P<0.05）；两个基因在中低分化 肠癌中的表达也显著高于高分化肠癌（P<0.001）。免疫组化结果也提示TFF2和 PAR4在胃癌中的表达显著低于周围远癌部位组织（P<0.001），而在肠癌中的表 达则显著高于周围远癌部位组织（P<0.001）。表明TFF2和PAR4在胃肠道肿瘤的 发生中可能受到某些因素的调节而协调性地一致性表达。 在细胞水平上，我们发现在同等浓度hTFF2的诱导下，过表达PAR4的Lovo 稳定株的细胞迁移能力较不表达者明显增强，并且hTFF2的促细胞迁移活性呈剂 量依赖性，同时伴随ERK1/2磷酸化的增强。同时，过表达PAR4的Lovo细胞增殖 能力强于无PAR4表达的细胞，但TFF2作用后其增强能力反而下降，表明TFF2 对过表达了PAR4的Lovo细胞具有抗增殖的能力。 总之这些结果提示PAR4和TFF2在胃肠道中协同表达的现实为两者之间产 生一定的作用提供了基础，而且这种共存为粘膜受损后的修复，组织自身平衡状 态的维持都发挥了一定的作用，同时也为临床相关疾病的诊断，治疗及预后提供 一个新的理论依据。当然，生理和病理情况下，存在于PAR4和TFF2之间的调控 和相互作用的分子机制仍不清楚，这也是进一步研究的关键所在。 为探讨其它动物体内三叶因子家族蛋白结构和功能的关系，我们进而利用原 核表达体系构建并表达纯化了Bm-TFF2以及它的两个单结构域。由于Bm-TFF2 分子中有三对二硫键，所以我们选用pET-32a表达体系表达融合的重组蛋白，并 利用融合蛋白N端引入的Xa因子酶切位点将融合蛋白中的硫氧还蛋白切除，亲和 柱及反向高压液相色谱纯化游离的重组蛋白。重组的Bm-TFF2全长具有血小板聚集活性，而第一个结构域只有诱导血小板变形的作用；三种重组蛋白都具有剂量 依赖性地诱导AGS细胞迁移的功能，但三种重组蛋白的细胞迁移活性无明显差 异。pET-32a表达体系成功表达Bm-TFF2的事实为我们研究人三叶因子家族蛋白 结构及功能关系提供一种方便而可靠的手段。

唾液酸转移酶Ⅰ（ST6GalⅠ）及甲胎蛋白（AFP）上肝癌特异糖链在肝细胞肝癌细胞系和肝病患者血液中的表达

肝癌（HCC）是一种重要的恶性肿瘤，具有高发病率和不良预后的特点，在中国有很多的肝癌患者。早期发现和精确区分肝癌与其他肝病，对于肝癌的临床诊断治疗有十分重要的作用。由于肝脏所处位置较深，以及检测仪器和手段的限制，肝癌的早期诊断相对困难，所以比较好的血清学标记物应用于早期区分肝癌和其他肝病显得尤为重要。目前应用较多的标记物是甲胎蛋白AFP。由于单独的AFP其敏感性和特异性并不高，更为理想的检测手段正在研究中。 Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase Ⅰ(ST6GalⅠ)是唾液酸转移酶家族中的一员，主要调控蛋白的唾液酸化。有研究发现ST6Gal在肝癌中表达升高，而且随着肝实体瘤的恶化而可能被释放到外周血中。所以血液中的ST6GalⅠ水平可能是一种有潜力的肝癌指标。另外，有研究显示，AFP的糖链结构在肝癌和其他肝病中是不同的，如果能用AFP上肝癌特异糖链作为检测目标，联合已有的检测体系，可能有助于早期精确诊断肝癌。 目的：我们选择ST6Gal Ⅰ和AFP上肝癌特异糖链TF（Thomsen-Friedenreich）抗原，H2血型抗原，Lewis Y血型抗原作为主要的研究内容，通过对其在肝癌细胞系和肝病血液中的表达研究，探讨其应用于肝癌早期诊断的可能。 方法：1）用合成的ST6Gal Ⅰ多肽免疫兔子，制备抗ST6Gal Ⅰ多克隆抗体；2）通过免疫细胞化学，ELISA和western blot等方法对制作的兔多克隆抗体进行效价分析；3）通过western blot方法对肝癌、肝硬化和正常人的血浆和血清中ST6Gal表达进行研究；4）通过免疫沉淀的方法对肝癌细胞系和肝癌血浆中AFP上肝癌特异糖链进行研究。 结果：1）制备的兔抗人ST多克隆抗血清，效价可达1:400000，能够通过 免疫细胞化学和western blot检测到肝癌细胞系中的ST6GalⅠ；2）所选的3例肝癌血浆和2例肝癌血清中都有ST6GalⅠ阳性，在所选的2例肝硬化血浆和2例肝硬化血清中，分别只有1例有ST6GalⅠ的阳性，在3例正常人血浆中有2例有ST6GalⅠ阳性；3）AFP上肝癌特异的糖链TF抗原、H2抗原、Lewis Y抗原可以通过免疫沉淀的方法在肝癌病人血浆和肝癌细胞系HepG2中检出。 结论：制备的兔抗人ST6GalⅠ多克隆抗体具有较高效价，并可以检测到自然状态和变性状态的目标蛋白，可以应用于ST6GalⅠ的研究；通过western blotting对肝病血液的检测，发现在肝癌、肝硬化和正常人血液中的ST6GalⅠ的表达有差异，为ST6GalⅠ作为一种肿瘤标记物进行血清学检测提供了可能的前提；免疫沉淀的结果，证实了在肝癌病人的AFP上有TF、H2、LewisY等糖链的存在，为AFP上肝癌特异糖链作一种区分肝癌和其他良性肝病的标记物提供了证据。

唾液酸转移酶Ⅰ（ST6GalⅠ）及甲胎蛋白（AFP）上肝癌特异糖链在肝细胞肝癌细胞系和肝病患者血液中的表达

肝癌（HCC）是一种重要的恶性肿瘤，具有高发病率和不良预后的特点，在中国有很多的肝癌患者。早期发现和精确区分肝癌与其他肝病，对于肝癌的临床诊断治疗有十分重要的作用。由于肝脏所处位置较深，以及检测仪器和手段的限制，肝癌的早期诊断相对困难，所以比较好的血清学标记物应用于早期区分肝癌和其他肝病显得尤为重要。目前应用较多的标记物是甲胎蛋白AFP。由于单独的AFP其敏感性和特异性并不高，更为理想的检测手段正在研究中。 Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase Ⅰ(ST6GalⅠ)是唾液酸转移酶家族中的一员，主要调控蛋白的唾液酸化。有研究发现ST6Gal在肝癌中表达升高，而且随着肝实体瘤的恶化而可能被释放到外周血中。所以血液中的ST6GalⅠ水平可能是一种有潜力的肝癌指标。另外，有研究显示，AFP的糖链结构在肝癌和其他肝病中是不同的，如果能用AFP上肝癌特异糖链作为检测目标，联合已有的检测体系，可能有助于早期精确诊断肝癌。 目的：我们选择ST6Gal Ⅰ和AFP上肝癌特异糖链TF（Thomsen-Friedenreich）抗原，H2血型抗原，Lewis Y血型抗原作为主要的研究内容，通过对其在肝癌细胞系和肝病血液中的表达研究，探讨其应用于肝癌早期诊断的可能。 方法：1）用合成的ST6Gal Ⅰ多肽免疫兔子，制备抗ST6Gal Ⅰ多克隆抗体；2）通过免疫细胞化学，ELISA和western blot等方法对制作的兔多克隆抗体进行效价分析；3）通过western blot方法对肝癌、肝硬化和正常人的血浆和血清中ST6Gal表达进行研究；4）通过免疫沉淀的方法对肝癌细胞系和肝癌血浆中AFP上肝癌特异糖链进行研究。 结果：1）制备的兔抗人ST多克隆抗血清，效价可达1:400000，能够通过免疫细胞化学和western blot检测到肝癌细胞系中的ST6GalⅠ；2）所选的3例肝癌血浆和2例肝癌血清中都有ST6GalⅠ阳性，在所选的2例肝硬化血浆和2例肝硬化血清中，分别只有1例有ST6GalⅠ的阳性，在3例正常人血浆中有2例有ST6GalⅠ阳性；3）AFP上肝癌特异的糖链TF抗原、H2抗原、Lewis Y抗原可以通过免疫沉淀的方法在肝癌病人血浆和肝癌细胞系HepG2中检出。 结论：制备的兔抗人ST6GalⅠ多克隆抗体具有较高效价，并可以检测到自然状态和变性状态的目标蛋白，可以应用于ST6GalⅠ的研究；通过western blotting对肝病血液的检测，发现在肝癌、肝硬化和正常人血液中的ST6GalⅠ的表达有差异，为ST6GalⅠ作为一种肿瘤标记物进行血清学检测提供了可能的前提；免疫沉淀的结果，证实了在肝癌病人的AFP上有TF、H2、LewisY等糖链的存在，为AFP上肝癌特异糖链作一种区分肝癌和其他良性肝病的标记物提供了证据。

APOBEC3G 多重转录本的发现和部分表达特征的研究

APOBEC3G（apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G，载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G，简称为A3G）是2002年Sheehy 发现的天然抗病毒限制因子，代表近年来病毒研究领域的一项重大进展,不仅拓 展了对病毒宿主相互作用的认识,也为研发抗病毒药提供了新的思路和方向。不 过，A3G的结构、功能和抗病毒机制仍有许多未解的重大问题，进一步深入和系 统的研究，可能为预防和治疗HIV/AIDS及多种病毒性疾病，提供新的线索。 本研究的最初线索，来源于前期工作中的偶然发现：我们试图在一个健康个 体PBMC 中克隆A3G 编码序列，经双向测序后发现，有5 个位点属非同义突变， 造成氨基酸序列的改变。为排除个体差异并出于研究的便利，我们采用单核样细 胞系THP-1，进行多条序列的克隆和分析。在研究中，我们使用错误率仅为 1.6x10-6 的高保真酶Pfu，共克隆到23 条A3G 基因编码序列。经双向测序和对比 分析，较为意外地发现，其中20 条序列具有2 个以上的非同义突变或截断错位， 突变率高达87%，显示A3G 基因在THP-1 细胞中存在多重正常或变异的转录本。 这一现象，是否代表天然突变的普遍性以及其频度和意义，有待于进一步在多种 细胞和人群多个个体中验证和大规模的系统研究。 为建立基本的实验体系和研究手段，我们通过RT-PCR 与Western blotting， 检测了A3G 基因在9 个细胞系内的本底表达水平，并在此筛选结果的基础上， 在低本底的细胞系中，以慢病毒系统表达A3G 基因，而在高本底细胞系中，通 过siRNA 沉默A3G 基因，建立了A3G 高低表达体系，为后续研究A3G 功能提 供了方便可行的实验平台。 我们选取野生型A3G、带有3 个位点（H186R、I309T、F310S）连锁的突 变体和5 个位点（W34R、Y222H、V224G、A246V、F289L）非连锁的突变体， 构建真核表达载体，转染HEK293T 细胞，对比观察不同转录本在细胞中的表达 动态和水平。结果发现，3 个位点的突变对A3G 蛋白细胞内定位无明显影响，5 个位点的突变明显增加了单个细胞中A3G 蛋白点灶状团块的比例。并且突变位 点明显减缓了A3G 的表达速率，降低了表达水平。而连锁、非连锁以及截断错 位的突变体在抗病毒功能和结构生物学上的意义，有待于进一步的深入分析。 综上，我们发现A3G 在THP-1 细胞中存在多重转录本，并在确定细胞系A3G 本底表达的基础上，建立了A3G 体外高低表达体系，为后续我们进一步研究 A3G 的功能奠定了基础。而部分突变体在细胞内的表达趋势和细胞内定位的观 察和分析，为进一步的深入研究提供了新的线索。

姚虻唾液腺三类抗血栓活性蛋白的结构和功能研究

血栓栓塞性疾病严重影响人类的健康，是导致死亡率最高的病因之一。在过去 的几十年中，已经开发了针对血液凝固、血小板激活和聚集、血栓溶解的不同步骤而 起作用的基础和临床药物，但是许多抗血栓药物经常被包括低血压、出血等系统性的 副作用所限制，因此，需要开发新型的更具潜力和特异性的抗血栓药物。 吸血节肢动物与宿主相互作用的分子机制研究是目前国际研究的热点之一，通过 该类研究可以发现大量的具有药用前景的先导分子和提供节肢动物控制策略。我们通 过生物化学、分子生物学以及药理学研究手段首次从中国特有的姚虻（Tabanus yao Macquart）唾液腺发现了同时具有水解纤维蛋白原和抑制血小板聚集的双功能的 丝氨酸蛋白酶Tablysin、纤维蛋白水解酶TY6和腺苷三磷酸双磷酸酶Tabapy等3个家 族的抗血栓活性成分。并研究了这3类因子在牛虻唾液腺中的分子多样性、它们的结 构基础及发挥抗血栓功能的作用机制，通过实验动物模型研究体内外抗血栓能力，深 入解析了牛虻作为传统抗血栓中药的物质基础，为发掘具有良好抗血栓功能的新型候 选药物分子，为传统活血化瘀中药牛虻的现代化开发提供了广阔的思路和打下了坚实 的基础。 研究表明，姚虻纤维蛋白原水解酶Tablysin为一种单链蛋白。其表观分子量为 27kDa。此酶为一种丝氨酸蛋白酶家族的新成员，其活性不受金属离子螯合剂EDTA 和还原剂DTT的影响。血浆蛋白酶抑制剂Aprotinin，α-macroglobulin能部分抑制该 酶活性。此酶适应的pH范围较广（pH 2.4-10.0），但对热变化不具很好的耐受性。 Edman降解法进行氨基酸测序分析发现，此酶的N-末端有封闭现象，后经Q-TOF质 谱分析，确定此酶的部分氨基酸序列。此外，我们成功构建了具有完整性的姚虻唾液 腺cDNA文库，获得2×106 pfu个重组子，进一步的筛选了Tablysin的编码基因。 对此酶的溶栓机制进行分析发现，其具有直接水解纤维蛋白原的活性，不具有纤 溶酶原激活剂的活性。此酶能明显地水解纤维蛋白原的α-链，而对β-链的水解活性较 低，不能水解γ链（α > β > γ）。此酶不能有效地水解纤维蛋白，不会水解层粘连蛋白 （Laminin）和纤维粘连蛋白（Fibronectin）等基质蛋白。不具有出血活性。进 一步探讨此酶的作用机制，发现其能以剂量依赖的方式抑制ADP诱导的血小板聚 集。利用流式细胞仪检测到该酶能与血小板膜糖蛋白受体GPIIb / IIIa结合，因此推测其可能是通过抑制血小板和纤维蛋白原结合的作用机制来抑制血小板 的聚集。 我们通过将目的基因连接到pET-32a+载体，并在大肠杆菌表达体系中得到 了高效表达。体外活性检测表明重组蛋白质与天然产物活性相当，用其检测了 其对角叉菜胶致小鼠尾静脉血栓模型体内血栓形成的影响， 实验结果表明 Tablysin具有明显的抗静脉血栓作用。该工作对有潜力开发成为新型单组分抗血栓 药物的姚虻活性蛋白进行了较为系统的理化性质研究，为该分子的进一步开发和研究 奠定了基础。 我们从姚虻唾液腺中分离纯化到一组具有水解纤维蛋白原α-链活性的酶， 命名为TY6家族。对TY6的生化性质进行研究，表明此酶为一种单链的丝氨酸蛋白 酶，其表观分子量为27 kDa，其活性不受金属离子螯合剂EDTA的影响，但能被PMSF 所抑制。Molish反应显示为阴性，说明此酶不是一种糖蛋白。从姚虻唾液腺cDNA 文库中克隆得到其编码序列，发现该酶家族的编码基因在一级结构上表现出丰 富的多样性。通过Western blotting检测到其能与牛虻叮咬后过敏患者血清特异性IgE 结合。推测该基因的多样性是吸血昆虫适应吸血寄生生活而采取的进化策略。 该工作为牛虻唾液腺抗血栓功能基因的继续筛选和分析奠定了基础，并为牛虻的生物 防治提供了思路和对策。 我们从姚虻唾液腺中分离纯化到一个具有水解ADP活性的酶（Apyrase）， 命名为Tabapy。活性检测发现Tabapy具有明显的水解ADP的活性，并能以剂量 依赖的方式抑制ADP诱导的血小板聚集。通过Western blotting检测到Tabapy能与 牛虻叮咬后过敏患者血清特异性IgE结合。用PCR方法从姚虻唾液腺cDNA文库中 克隆得到编码序列，经BLAST分析表明，该酶与来源于斑虻唾液腺的血小板聚 集抑制剂Chrysoptin具有90％的序列相似性，并经过Q-TOF分析确证，有5个肽段 的氨基酸残基与该cDNA序列推导的多肽链匹配。该工作为研究吸血节肢动物 吸血生理及进一步研究Apyrase的结构和功能打下了基础。

白介素4-绿脓杆菌外毒素重组免疫毒素的构建与活性研究

白介素-4受体（IL-4R）在实体瘤和血癌等许多肿瘤细胞表面表达量很高构建导向IL-4R的免疫毒素，是研究肿瘤治疗的一个重要方向。天然IL-4分子N末端和C末端含有很多与受体结合的活性位点，为了降低连接蛋白毒素时对这些位点的影响，将天然IL-4分子的N端和c端用寡肚GGNGG相连，并在非活性部位形成新的开口，构建了cpIL-4；为了进一步提高cpIL-4与IL-4R的亲和力，通过重叠PCR引入13位点突变，得到cpIL-4（13D）；为了增强IL-4免疫毒素对淋巴细胞的选择性，在121位引入点突变，得到cpIL-4（13D121E）。将上述三种重组IL-4分子分别于大肠杆菌表达系统进行表达。ELISA分析表明，三种重组蛋白均可与人IL-4抗体特异性结合。由于PE的DNA序列的GC含量很高，很难用常规手段进行改造，本文采用特殊条件的PCR反应和酶切反应进行绿脓杆菌外毒素PE的改造，得到PE38KDEL，并于大肠杆菌表达系统进行表达。其特点是分子量较小，不含结合区，C末端氨基酸KDEL有利于提高其跨膜能力和细胞毒作用。将靶向分子分别与毒素分子相连，得到三种免疫毒素：cpIL4-PE38KDEL，cpIL4（13D）-PE38KDEL，cpIL4（13D121B）-PE38KDEL。将之分别于表达载体pET32a（＋）进行表达，目的蛋白表达量均约为菌体总蛋白的30％。western blotting分析表明，诱导后表达的三种IL-4免疫毒素均可与hIL-4抗体特异性结合。采用Ni-NTA亲和层析和阴离子交换层析纯化上述三种IL-4免疫毒素，纯度均在95％以上。用MTT法检测其细胞毒作用，结果显示，免疫毒素cpIL4（13D）-PE38KDEL可特异性地靶向产生IL-4R的细胞株，＿且其活性与未突变的免疫毒素cpIIL4-PE38KDEL相比有2-3倍的提高；免疫毒素cpIL4（13D121E）-PE38KDEL对表达I型IL-4R的淋巴瘤细胞结合力较强，对表达II型IL-4R的内皮细胞结合力较弱，因此对淋巴瘤具有一定的选择性，这对于提高药物疗效，降低血管渗漏症等毒副作用具有重要意义。

X射线诱导的HeLa细胞旁效应中ROS和NO关系研究

活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)是辐射诱导的旁效应信号通路中的两个重要信号分子。实验研究了这两种信号分子在HeLa细胞旁效应信号通路中的关系。通过微核实验,发现X射线辐照过的HeLa细胞及其旁观者细胞微核形成明显增加,而二甲亚砜(DMSO)预处理显著抑制了微核形成。另外还发现,接受条件培养基的旁观者细胞的增殖速率增加,而DMSO预处理产生条件培养基的受辐照细胞则使旁观者细胞的增殖速率降低。以上的结果从不同角度证实了HeLa细胞存在X射线诱导的旁效应,且其可以被DMSO预处理所抑制。Western blotting和DAF-FMDA荧光探针检测分别显示出辐照后细胞的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和NO水平均升高,而DMSO预处理则降低其水平。因此,可以推测X射线诱导的HeLa旁效应当中ROS是NO的上游信号。

X射线致HeLa细胞损伤过程中NADPH氧化酶的作用

以HeLa细胞为实验材料,探讨了NADPH氧化酶在X射线诱导细胞损伤过程中的作用。结果显示,12Gy X射线辐照后细胞内活性氧(ROS)明显增加,在用NADPH氧化酶抑制剂处理后再辐照,则细胞内ROS降低到未辐照水平;同时辐照后NADPH氧化酶细胞质亚基p47phox在细胞质积聚并和细胞膜亚基gp91phox结合;Western blotting检测结果显示,NADPH氧化酶的关键亚基gp91phox的表达量明显增加。以上结果说明,NADPH氧化酶可以被X射线激活,由其介导产生的ROS在X射线诱导HeLa细胞损伤过程中扮演重要角色。