APOBEC3G 多重转录本的发现和部分表达特征的研究

APOBEC3G（apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G，载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G，简称为A3G）是2002年Sheehy 发现的天然抗病毒限制因子，代表近年来病毒研究领域的一项重大进展,不仅拓 展了对病毒宿主相互作用的认识,也为研发抗病毒药提供了新的思路和方向。不 过，A3G的结构、功能和抗病毒机制仍有许多未解的重大问题，进一步深入和系 统的研究，可能为预防和治疗HIV/AIDS及多种病毒性疾病，提供新的线索。 本研究的最初线索，来源于前期工作中的偶然发现：我们试图在一个健康个 体PBMC 中克隆A3G 编码序列，经双向测序后发现，有5 个位点属非同义突变， 造成氨基酸序列的改变。为排除个体差异并出于研究的便利，我们采用单核样细 胞系THP-1，进行多条序列的克隆和分析。在研究中，我们使用错误率仅为 1.6x10-6 的高保真酶Pfu，共克隆到23 条A3G 基因编码序列。经双向测序和对比 分析，较为意外地发现，其中20 条序列具有2 个以上的非同义突变或截断错位， 突变率高达87%，显示A3G 基因在THP-1 细胞中存在多重正常或变异的转录本。 这一现象，是否代表天然突变的普遍性以及其频度和意义，有待于进一步在多种 细胞和人群多个个体中验证和大规模的系统研究。 为建立基本的实验体系和研究手段，我们通过RT-PCR 与Western blotting， 检测了A3G 基因在9 个细胞系内的本底表达水平，并在此筛选结果的基础上， 在低本底的细胞系中，以慢病毒系统表达A3G 基因，而在高本底细胞系中，通 过siRNA 沉默A3G 基因，建立了A3G 高低表达体系，为后续研究A3G 功能提 供了方便可行的实验平台。 我们选取野生型A3G、带有3 个位点（H186R、I309T、F310S）连锁的突 变体和5 个位点（W34R、Y222H、V224G、A246V、F289L）非连锁的突变体， 构建真核表达载体，转染HEK293T 细胞，对比观察不同转录本在细胞中的表达 动态和水平。结果发现，3 个位点的突变对A3G 蛋白细胞内定位无明显影响，5 个位点的突变明显增加了单个细胞中A3G 蛋白点灶状团块的比例。并且突变位 点明显减缓了A3G 的表达速率，降低了表达水平。而连锁、非连锁以及截断错 位的突变体在抗病毒功能和结构生物学上的意义，有待于进一步的深入分析。 综上，我们发现A3G 在THP-1 细胞中存在多重转录本，并在确定细胞系A3G 本底表达的基础上，建立了A3G 体外高低表达体系，为后续我们进一步研究 A3G 的功能奠定了基础。而部分突变体在细胞内的表达趋势和细胞内定位的观 察和分析，为进一步的深入研究提供了新的线索。