Charakterisierung funktioneller Domänen von Centrin-Isoformen

Centrine sind kleine Ca2+-bindende Proteine aus der Familie der EF-Hand Proteine. Erstmals wurden Centrine als Hauptbestandteil der kontraktilen Flagellenwurzeln von Grünalgen beschrieben. Mittlerweile konnten Centrine in nahezu allen eukaryotischen Organismen nachgewiesen werden. In Säugetieren wurden bis zu vier Isoformen identifiziert, die an Centrosomen oder davon abgeleiteten Strukturen, wie Spindelpolkörpern und Basalkörper, aber auch in Übergangszonen von Cilien exprimiert werden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Centrine im zellulären Kontext der Photorezeptorzellen nicht nur durch die Bindung von Ca2+ reguliert werden, sondern auch durch reversible Phosphorylierungen. Die Phosphorylierung der Centrin-Isoformen findet in der Retina von Vertebraten lichtabhängig während der Dunkeladaption statt. Die Protein Kinase CK2 (CK2) ist für die beschriebenen lichtabhängigen Phosphorylierungen hauptverantwortlich. Obwohl alle Centrin-Isoformen mehrere mögliche Zielsequenzen für die CK2 besitzen, kommt es nur zur Phosphorylierung einer einzigen Aminosäure in Cen1p, Cen2p und Cen4p. Im Gegensatz dazu stellt die Isoform Cen3p kein Substrat für die CK2 dar. Zudem wurden hier erstmals Phosphatasen identifiziert, die in der Lage sind Centrine zu dephosphorylieren. Die Dephosphorylierung durch die PP2Cund PP2C ist sehr spezifisch, da keine andere Phosphatase der Retina die CK2-vermittelte Phosphorylierung der Centrine rückgängig machen kann. Hoch auflösende licht- und elektronenmikroskopische Analysen zeigten erstmals, dass die Centrine sowohl mit der CK2 als auch mit der PP2C im Verbindungscilium der Photorezeptorzellen colokalisiert sind. Cen1p und CK2 sind in der Lage, direkt an Mikrotubuli zu binden, was die notwendige räumliche Nähe zwischen Enzymen und Substrat herstellt. Bisherige Arbeiten zeigten, dass alle Centrine Ca2+-abhängig mit dem visuellen G-Protein Transducin interagieren. Diese Wechselwirkung dürfte an der Regulation der lichtabhängigen Translokation des visuellen G-Proteins Transducin zwischen dem Außen- und dem Innensegment der Photorezeptorzelle beteiligt sein. In der vorliegenden Arbeit zeigten Interaktionsstudien, dass die Bindungsaffinitäten der Centrine für Transducin durch die CK2-vermittelte Phosphorylierung drastisch verringert wurden. Dieser beobachtete Effekt beruht auf deutlich verringerten Ca2+-Affinitäten der Centrin-Isoformen nach der CK2-vermittelten Phosphorylierung. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuartiger Regulationsmechanismus der Centrine in den Photorezeptorzellen der Vertebraten beschrieben. Centrine werden nicht nur durch Ca2+-Bindung zur Bildung von Protein Komplexen stimuliert, sondern durch die Phosphorylierung zum Auflösen dieser Komplexe angeregt. Damit reguliert die CK2-vermittelte, lichtabhängige Phosphorylierung der Centrine möglicherweise ebenfalls die adaptive Translokation des visuellen G-Proteins Transducin zwischen dem Außen- und Innensegment der Photorezeptorzellen.

Photovernetzbare flüssigkristalline Polymere unterschiedlicher Kettentopologien

„Photovernetzbare flüssigkristalline Polymere unterschiedlicher Kettentopologien“, Patrick Beyer, Mainz 2007 Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurde die Synthese und Charakterisierung flüssigkristalliner Elastomere unterschiedlicher Polymertopologien vorgestellt. Dabei wurden Systeme synthetisiert, bei denen die mesogenen Einheiten entweder als Seitengruppen an ein Polymerrückgrat angebunden (Seitenkettenelastomere) oder direkt in die Polymerkette integriert (Hauptkettenelastomere) sind (siehe Abbildung). Bezüglich der Seitenkettensysteme konnten erstmals photovernetzbare smektische Seitenkettenpolymere, in denen aufgrund der Anknüpfung eines photoisomerisierbaren Azobenzols eine Photo- modulation der ferroelektrischen Eigenschaften möglich ist, dargestellt werden. Homöotrop orientierte freistehende Filme dieser Materialien konnten durch Spincoaten dargestellt und unter Ausnutzung des Dichroismus der Azobenzole durch geeignete Wahl der Bestrahlungsgeometrie photovernetzt werden. Aufbauend auf diesen Untersuchungen wurde anhand eines nicht vernetzbaren Modellsystems im Detail der Einfluss der trans-cis Isomerisierung des Azobenzols auf die ferroelektrischen Parameter untersucht. Durch zeitaufgelöste Messungen der Absorption der Azobenzole, der spontanen Polarisation und des Direktorneigungswinkels und Auswertung der kinetischen Prozesse konnte eine lineare Abhängigkeit der ferroelektrischen Eigenschaften vom Grad der Isomerisierungsreaktion festgestellt werden. Durch Vergleich dieser in der flüssigkristallinen Phase erhaltenen Ergebnisse mit der Kinetik der thermischen Reisomerisierung in Lösung (Toluol) konnte ferner eine deutliche Reduzierung der Relaxationszeiten in der anisotropen flüssigkristallinen Umgebung festgestellt und auf eine Absenkung der Aktivierungsenergie zurückgeführt werden. Makroskopische Formänderungen der Seitenkettenelastomere am Phasenübergang von der flüssigkristallinen in die isotrope Phase konnten jedoch nicht festgestellt werden. Aus diesem Grund wurden neue Synthesestrategien für die Darstellung von Hauptkettenelastomeren entwickelt, die sich aufgrund der direkten Kopplung von flüssigkristallinem Ordnungsgrad und Polymerkettenkonformation besser für die Herstellung thermischer Aktuatoren eignen. Auf Basis flüssigkristalliner Polymalonate konnten dabei lateral funktionalisierte smektische Hauptkettenpolymere synthetisiert werden, welche erstmals die Darstellung von LC-Hauptkettenelastomeren durch Photovernetzung in der flüssigkristallinen Phase erlauben. Durch laterale Bromierung konnte in diesen Systemen die Kristallisationstendenz der verwendeten Biphenyleinheiten unterdrückt werden. Bezüglich der Photovernetzung konnten zwei neue Synthesemethoden entwickelt werden, bei denen der Vernetzungsschritt entweder durch radikalische Polymerisation lateral angebundener Acrylatgruppen oder durch photoaktive Benzophenongruppen erfolgte. Basierend auf den Benzophenon funktionalisierten Systemen konnte ein neuartiges Verfahren zur Darstellung makroskopisch orientierter Hauptkettenelastomere durch Photovernetzung entwickelt werden. Die Elastomerproben, deren Ordnungsgrad durch Röntgenuntersuchungen ermittelt werden konnte, zeigen am Phasenübergang von der flüssigkristallinen in die isotrope Phase eine reversible Formänderung von 40%. Im Gegensatz zu anderen bekannten smektischen Systemen konnten die in dieser Arbeit vorgestellten Elastomere ohne Zerstörung der Phase bis zu 60% entlang der smektischen Schichtnormalen gestreckt werden, was im Kontext einer geringen Korrelation der smektischen Schichten in Hauptkettenelastomeren diskutiert wurde.

Charakterisierung der neuroprotektiven Eigenschaften des Corticotropin-Releasing-Hormons

Das Corticotropin Releasing Hormon (CRH) ist ein zentraler Mediator des neuroendokrinen Systems von Säugetieren und kontrolliert die physiologische Stressreaktion des Körpers. Zudem zeigten in vitro Daten, dass es Neuroprotektion gegenüber oxidativem Stress induzieren kann. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals ein neuroprotektiver Effekt des CRH in vivo gezeigt werden. Die Überexpression des CRH im ZNS von Mäusen konnte Nervenzellen in vivo vor Exzitotoxizität schützen; nach Injektion des Exzitotoxins Kainat verkürzte die CRH-Überexpression die Dauer der epileptischen Anfälle, schützte die Neurone der betroffenen Hippocampusregion vor Zelltod und verhinderte die bei Exzitotoxizität und vielen neurodegenerativen Erkrankungen auftretende Neuroinflammation. Desweiteren konnten in CRH-überexprimierenden Tieren erhöhte BDNF-Proteinspiegel nachgewiesen werden. BDNF, ein bedeutender neurotropher Faktor im ZNS, vermittelt daher teilweise die CRH-induzierte Neuroprotektion gegenüber der Exzitotoxizität in vivo. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Connexin43, dem Haupt-Gap Junction-Protein der Astrozyten, ein neues CRH-Zielgen im ZNS identifiziert. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass CRH sowohl die Expression des Connexin43-Gens als auch den Connexin43-Proteinspiegel in vitro und in vivo erhöht. Diese Effekte werden über die Aktivierung des CRH-Rezeptor 1 und nachfolgend der PKA- und MAPK-Signalwege vermittelt. In Übereinstimmung mit der Hochregulation des Connexin43-Proteinspiegels verstärkte CRH auch die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions. Physiologisch hat diese CRH-induzierte Verstärkung der astrozytären Gap Junction-Kommunikation eine große Bedeutung für die Neuroprotektion, da eine Hochregulation der interzellulären Kommunikation schnell toxische Moleküle verdünnt, Energiesubstrate und protektive Faktoren verteilt und Ionen abpuffert. Dadurch werden Schädigungen durch oxidativen Stress in den Zellen reduziert, was über die Analyse der Proteincarbonylierung gezeigt wurde. Die Relevanz der astrozytären Gap Junction-Kommunikation für das Überleben der Neurone konnte in organotypischen hippocampalen Schnitten und in Neuron-Astrozyten-Co-Kulturen deutlich gemacht werden. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gewonnenen Daten zeigen, dass die Stress-induzierte Sekretion von CRH im ZNS zur verstärkten Expression neuroprotektiver Moleküle wie BDNF und Connexin43 beiträgt. Diese vermögen Neurone gegenüber toxischen Einflüssen zu schützen und zum Erhalt ihrer Funktion beizutragen. Die protektiven CRH-Effekte könnten speziell bei chronischen neurodegenerativen Krankheiten wie der Alzheimerschen Demenz und der Parkinsonschen Krankheit hilfreich sein.

Identifizierung und Charakterisierung von Intermediärfilament-Organisatoren in Caenorhabditis elegans

Intermediärfilamente (IFs) sind neben Mikrotubuli und Aktinfilamenten die dritte filamentäre Komponente des Zytoskeletts. Sie wirken als mechanische Stabilisatoren, sind außerdem an Zelldifferenzierung, Proliferation und Apoptose beteiligt und tragen zu Zellpolarität bei. IFs sind dynamische Strukturen, die zelltypspezifisch in unterschiedlichen Anordnungen und Abundanzen vorkommen und von Signalkaskaden beeinflusst werden. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dieser fein abgestimmten Prozesse sind weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit sollte deswegen ein Tiermodell entwickelt werden, um Regulatoren der IF-(Netzwerk)-Organisation in vivo zu untersuchen und zu identifizieren. Dazu wurde C. elegans ausgewählt, da es sich hierbei um einen genetisch gut charakterisierten und leicht manipulierbaren Organismus handelt, in dessen Genom elf Gene für zytoplasmatische IFs kodieren. Zunächst wurden stabil transgene C. elegans-Linien generiert, die fluoreszierende IFs exprimieren. Es konnte gezeigt werden, dass das darmspezifische IFB-2::CFP im Bereich des apikalen Junktionskomplex verankert ist und nahezu vollständig im subapikalen Terminalgeflecht der Enterozyten lokalisiert, das als Teil der endotube besonders stabil und widerstandsfähig ist. Wenn diese Tiere mit dsRNA gegen das ebenfalls im Terminalgeflecht exprimierte IF ifc-2 behandelt wurden, entwickelten sich blasenförmige Ausstülpungen des Darmlumens, die auf eine Schwächung der rigiden und formgebenden endotube hinwiesen und damit einen direkten in vivo-Beweis für die stressprotektive Funktion des intestinalen IF-Netzwerks lieferten. Die leichte Detektierbarkeit des IFB-2::CFP-Musters wurde in einem optischen Screen ausgenutzt, bei dem nach chemischer Mutagenese nach Veränderungen im IF-Muster gefahndet wurde. Hierbei wurden drei Mutanten isoliert. In Komplementationsanalysen stellte sich heraus, dass es sich in zwei Fällen um Allele desselben Gens handelt. Die Identifizierung der betroffenen Gene gelang durch eine PCR-basierte Kartierung von single nucleotide polymorphisms nach Verpaarung mit dem Hawaii-Stamm (snp-mapping) und anschließender RNAi-Analyse der Einzelgene in den identifizierten Chromosomenabschnitten. Im einen Fall handelte es sich um das sma-5-Gen, einer Serin/Threonin-Kinase mit Homologie zu den MAP-Kinasen MAPK7/ERK5 der Säuger. Hier wurden, ebenso wie beim ifc-2 (RNAi)-Phänotyp, progressive blasenförmige Ausstülpungen des Darmlumens beobachtet. Die beiden anderen Allele tragen Mutationen in einem bisher nicht näher charakterisierten Gen. In diesen Würmern kommt es zu einem vollständigen Auflösung des IFB-2::CFP-Netzwerks mit prominenten Akkumulationen um die apikalen Junktionen. Das Darmlumen ist stellenweise geweitet und das elektronendichte Terminalgeflecht fehlt fast vollständig, die Integrität des Darmepithels ist jedoch nicht kompromittiert. Die anderen IFs des Terminalgeflechts sind ebenfalls fehlverteilt, und die intestinale Expression von Aktin ist stark reduziert. Expressionskonstrukte des Gens zeigten weiterhin, dass es darmspezifisch synthetisiert wird und mit den IFs im Terminalgeflecht kolokalisiert. Das Protein ist, ähnlich wie das IF-assoziierte Filaggrin der Säuger ausgesprochen histidinreich. Es enthält außerdem eine Prolin-reiche Domäne, die Teil einer potentiellen Aktin-Bindedomäne ist. Auf Grund all dieser Eigenschaften wird die Bezeichnung IFO-1 (intermediate filament organizer) für das neue Protein vorgeschlagen, das möglicherweise als struktureller Zytoskelett-Linker wirkt. Die vorgestellten Ergebnisse untermauern die Bedeutung von C. elegans für die Identifizierung von Faktoren, die IF-Netzwerke regulieren, und die Möglichkeit, Defekte im lebenden Gesamtorganismus zu bestimmen.

Optical resonances of sphere-on-plane geometries

The optical resonances of metallic nanoparticles placed at nanometer distances from a metal plane were investigated. At certain wavelengths, these “sphere-on-plane” systems become resonant with the incident electromagnetic field and huge enhancements of the field are predicted localized in the small gaps created between the nanoparticle and the plane. An experimental architecture to fabricate sphere-on-plane systems was successfully achieved in which in addition to the commonly used alkanethiols, polyphenylene dendrimers were used as molecular spacers to separate the metallic nanoparticles from the metal planes. They allow for a defined nanoparticle-plane separation and some often are functionalized with a chromophore core which is therefore positioned exactly in the gap. The metal planes used in the system architecture consisted of evaporated thin films of gold or silver. Evaporated gold or silver films have a smooth interface with their substrate and a rougher top surface. To investigate the influence of surface roughness on the optical response of such a film, two gold films were prepared with a smooth and a rough side which were as similar as possible. Surface plasmons were excited in Kretschmann configuration both on the rough and on the smooth side. Their reflectivity could be well modeled by a single gold film for each individual measurement. The film has to be modeled as two layers with significantly different optical constants. The smooth side, although polycrystalline, had an optical response that was very similar to a monocrystalline surface while for the rough side the standard response of evaporated gold is retrieved. For investigations on thin non-absorbing dielectric films though, this heterogeneity introduces only a negligible error. To determine the resonant wavelength of the sphere-on-plane systems a strategy was developed which is based on multi-wavelength surface plasmon spectroscopy experiments in Kretschmann-configuration. The resonant behavior of the system lead to characteristic changes in the surface plasmon dispersion. A quantitative analysis was performed by calculating the polarisability per unit area /A treating the sphere-on-plane systems as an effective layer. This approach completely avoids the ambiguity in the determination of thickness and optical response of thin films in surface plasmon spectroscopy. Equal area densities of polarisable units yielded identical response irrespective of the thickness of the layer they are distributed in. The parameter range where the evaluation of surface plasmon data in terms of /A is applicable was determined for a typical experimental situation. It was shown that this analysis yields reasonable quantitative agreement with a simple theoretical model of the sphere-on-plane resonators and reproduces the results from standard extinction experiments having a higher information content and significantly increased signal-to-noise ratio. With the objective to acquire a better quantitative understanding of the dependence of the resonance wavelength on the geometry of the sphere-on-plane systems, different systems were fabricated in which the gold nanoparticle size, type of spacer and ambient medium were varied and the resonance wavelength of the system was determined. The gold nanoparticle radius was varied in the range from 10 nm to 80 nm. It could be shown that the polyphenylene dendrimers can be used as molecular spacers to fabricate systems which support gap resonances. The resonance wavelength of the systems could be tuned in the optical region between 550 nm and 800 nm. Based on a simple analytical model, a quantitative analysis was developed to relate the systems’ geometry with the resonant wavelength and surprisingly good agreement of this simple model with the experiment without any adjustable parameters was found. The key feature ascribed to sphere-on-plane systems is a very large electromagnetic field localized in volumes in the nanometer range. Experiments towards a quantitative understanding of the field enhancements taking place in the gap of the sphere-on-plane systems were done by monitoring the increase in fluorescence of a metal-supported monolayer of a dye-loaded dendrimer upon decoration of the surface with nanoparticles. The metal used (gold and silver), the colloid mean size and the surface roughness were varied. Large silver crystallites on evaporated silver surfaces lead to the most pronounced fluorescence enhancements in the order of 104. They constitute a very promising sample architecture for the study of field enhancements.

Clostridium difficile: Entdeckung und Charakterisierung der autokatalytischen Prozessierung von Toxin B

Clostridium difficile, der Auslöser der nosokomialen Antibiotika-assoziierten Durchfälle und der Pseudomembranösen Kolitis, besitzt zwei Hauptvirulenzfaktoren: die Toxine A und B. In vorangegangenen Veröffentlichungen wurde gezeigt, dass Toxin B durch einen zytosolischen Faktor der eukaryotischen Zielzelle während des Aufnahmeweges in die Zelle gespalten wird. Nur die N-terminale katalytische Domäne erreicht das Zytosol. Hierbei wurde davon ausgegangen, dass eine Protease der Zielzelle die Spaltung katalysiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Spaltung von Toxin B ein intramolekularer Prozess ist, der zytosolisches Inositolphosphat der Zielzelle als Kofaktor zur Aktivierung der intrinsischen Protease benötigt. Die Freisetzung der katalytischen Domäne durch Inositolphosphat-induzierte Spaltung ist nicht nur das Prinzip des Clostridium difficile Toxin B sondern auch des Toxin A, als auch des alpha Toxin von Clostridium novyi und das Letale Toxin von Clostridium sordellii. Der kovalente Inhibitor von Aspartatproteasen 1,2-epoxy-3-(p-nitrophenoxy)propan (EPNP), wurde dazu verwendet die intrinsische Protease von Toxin B zu blockieren und ermöglichte die Identifikation des katalytischen Zentrums. EPNP modifiziertes Toxin B verliert die intrinsische Proteaseaktivität und Zytotoxizität, aber wenn es direkt in das Zytosol der Wirtszelle injiziert ist, bleibt die Toxizität erhalten. Diese ist damit der erste Bericht eines bakteriellen Toxins, das eukaryotische Signale zur induzierten Autoproteolyse nutzt, um seine katalytisch-toxische Domäne in das Zytosol der Zielzelle freizusetzen. Durch diese Ergebnisse kann das Modell der Toxin-Prozessierung nun um einen weiteren entscheidenden Schritt vervollständigt werden.

Point defects in carbon nanostructures studied by in-situ electron microscopy

In the present work, the formation and migration of point defects induced by electron irradiation in carbon nanostructures, including carbon onions, nanotubes and graphene layers, were investigated by in-situ TEM. The mobility of carbon atoms normal to the layers in graphitic nanoparticles, the mobility of carbon interstitials inside SWCNTs, and the migration of foreign atoms in graphene layers or in layers of carbon nanotubes were studied. The diffusion of carbon atoms in carbon onions was investigated by annealing carbon onions and observing the relaxation of the compressed clusters in the temperature range of 1200 – 2000oC. An activation energy of 5.0±0.3 eV was obtained. This rather high activation energy for atom exchange between the layers not only prevents the exchange of carbon atoms between the layers at lower temperature but also explains the high morphological and mechanical stability of graphite nanostructures. The migration of carbon atoms in SWCNTs was investigated quantitatively by cutting SWCNT bundles repeatedly with a focused electron beam at different temperatures. A migration barrier of about 0.25 eV was obtained for the diffusion of carbon atoms inside SWCNTs. This is an experimental confirmation of the high mobility of interstitial atoms inside carbon nanotubes, which corroborates previously developed theoretical models of interstitial diffusivity. Individual Au and Pt atoms in one- or two-layered graphene planes and MWCNTs were monitored in real time at high temperatures by high-resolution TEM. The direct observation of the behavior of Au and Pt atoms in graphenic structures in a temperature range of 600 – 700°C allows us to determine the sites occupied by the metal atoms in the graphene layer and the diffusivities of the metal atoms. It was found that metal atoms were located in single or multiple carbon vacancies, not in off-plane positions, and diffused by site exchange with carbon atoms. Metal atoms showed a tendency to form clusters those were stable for a few seconds. An activation energy of around 2.5 eV was obtained for the in-plane migration of both Au and Pt atoms in graphene (two-dimensional diffusion). The rather high activation energy indicates covalent bonding between metal and carbon atoms. Metal atoms were also observed to diffuse along the open edge of graphene layers (one-dimensional diffusion) with a slightly lower activation energy of about 2.3 eV. It is also found that the diffusion of metal atoms in curved graphenic layers of MWCNTs is slightly faster than in planar graphene.

An alternative blocking layer for titanium dioxide (TiO 2) solar cell applications

In hybrid organic solar cells a blocking layer between transparent electrode and nanocrystalline titania particles is essential to prevent short-circuiting and current loss through recombination at the electrode interface. Here the preparation of a uniform hybrid blocking layer which is composed of conducting titania nanoparticles embedded in an insulating polymer derived ceramic is presented. This blocking layer is prepared by sol-gel chemistry where an amphiphilic block copolymer is used as a templating agent. A novel poly(dimethylsiloxane) containing amphiphilic block copolymer poly(ethyleneglycol)methylethermethacrylate-block-poly(dimethylsiloxane)-block-poly(ethyleneglycol)methylethermethacrylate has been synthesized to act as the templating agent. Plasma treatment uncovered titania surface from any polymer. Annealing at 450°C under nitrogen resulted in anatase titania with polymer derived silicon oxycarbide ceramic. Electrical characterization by conductive scanning probe microscopy experiments revealed a percolating titania network separated by an insulating ceramic matrix. Scanning Kelvin probe force microscopy showed predominant presence of titania particles on the surface creating a large surface area for dye absorption. The uniformity of the percolating structures was proven by microbeam grazing incidence small angle x-ray scattering. First applications in hybrid organic solar cells in comparison with conventional titanium dioxide blocking layer containing devices revealed 15 fold increases in corresponding efficiencies. Poly(dimethylsiloxane)-block-poly(ethyleneglycol)methylethermethacrylate and poly(ethyleneoxide)-poly(dimethylsiloxane)methylmethacrylate diblock copolymers were also synthesized. Their titania nanocomposite films were compared with the integrated blocking layer. Liner poly(ethyleneoxide) containing diblock copolymer resulted in highly ordered foam like structures. The effect of heating temperature rise to 600°C and 1000°C on titania morphology was investigated by scanning electron and force microscopy and x-ray scattering. Sol-gel contents, hydrochloric acid, titania precursor and amphiphilic triblock copolymer were altered to see their effect on titania morphology. Increase in block copolymer content resulted in titania particles of diameter 15-20 nm.

Charakterisierung redundanter Kerntransportsignale des minoren Kapsidproteins L2 humaner Papillomviren

Das minore Kapsidprotein L2 humaner Papillomviren wird im Laufe des HPV-Lebenszyklus zweimal in den Zellkern importiert und akkumuliert dort an den Nukleären Domänen 10 (ND10). Der erste Kernimport erfolgt in der frühen Phase der Infektion zusammen mit der Virus-DNA. Für den Zusammenbau von Virionen wird neu synthetisiertes L2-Protein ein weiteres Mal in den Kern transportiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Domäne von L2 identifiziert werden, die für den Kernimport von HPV16 L2 absolut notwendig ist. Dabei gelang es diesen Bereich auf 25 Aminosäuren einzuengen. Sowohl während der frühen Phase der Infektion als auch während der Morphogenese scheint die zentrale, basische Aminosäureregion 291-315 (mNLS) hauptverantwortlich für die Interaktion mit Kernimportrezeptoren zu sein. Möglicherweise leisten dabei flankierende Sequenzen einen Beitrag zur Stabilisierung der notwendigen Konformation. Des Weiteren gelang die Identifizierung der Aminosäuren, die für die Funktionalität des mNLS essentiell sind. Hierbei handelt es sich um ein zentrales Arginin-Motiv, bestehend aus vier dicht beieinander liegenden Argininen, dessen Mutation den Kernimport von L2 während Infektion und Morphogenese verhindert. Untersuchungen mit HPV16 und HPV18 L2-Proteinen verdeutlichten, dass es möglicherweise ein universelles Motiv zu sein scheint und in verschiedenen HPV-Typen konserviert ist. Flankiert wird dieses Arginin-Motiv von konservierten Serinen und Threoninen. Wie die Analyse von Punktmutationen zeigte, sind diese Aminosäuren für den Kernimport von L2 ohne Bedeutung. Interessanterweise verhinderte aber die Mutation TS295/6A die Kolokalisation von L2 mit ND10 im Zellkern. L2wt rekrutiert den transkriptionellen Regulator Daxx. Auch diese Funktion ging bei der Mutante TS295/6A verloren. Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht nur die ND10-Lokalisationsdomäne (AS 390-420) in L2 sondern auch weitere Aminosäuren oder Domänen für die Assoziation mit ND10 und die Rekrutierung von Daxx verantwortlich sein könnten. Auf der Suche nach zellulären Faktoren, die eine Rolle im mNLS-vermittelten Kernimport spielen, wurde zunächst die Bedeutung von Hsc70 untersucht. Während der Morphogenese maskiert Hsc70 den C-Terminus von L2 und verhindert damit unerwünschte Interaktionen mit Mikrotubuli im Zytoplasma. Es existieren aber weitere noch unbekannte Hsc70-Bindedomänen in L2, die möglicherweise den Kernimport ebenfalls beeinflussen können. Wie die Untersuchungen deutlich machten, ist der zentrale, basische Bereich von L2 aber nicht mit Hsc70 assoziiert und der mNLS-vermittelte Kernimport findet unabhängig von Hsc70 statt. In einem siRNA-Screen wurde anschließend die Rolle von Karyopherinen während der Infektion untersucht. Sowohl Kapß2-siRNA als auch Kapß3-siRNA waren in der Lage unabhängig voneinander die Infektion von HPV16-Pseudovirionen zu reduzieren. Für beide Karyopherine konnte in der Vergangenheit in vitro die Interaktion mit HPV16 L2 nachgewiesen werden. Das L2-Protein ist das einzige virale Protein, das während der Infektion die Virus-DNA in den Kern begleitet (Day et al., 2004). Demzufolge ist es auch das einzige virale Protein, das mit Importinen während der Infektion interagiert. Möglicherweise sind also beide Karyopherine in der Lage sein L2 während der Infektion in den Kern zu importieren. Abschließend wurden Präzipitationsversuche durchgeführt, die zur Identifizierung möglicher Bindungspartner des mNLS führen sollten. In diesen Versuchen konnte eine erhöhte Bindungsaffiniät zu den beiden Importinen Kapß1 und Kapß2 festgestellt werden. Möglicherweise ist das L2-Protein mit seiner mNLS in der Lage mehrere Importrezeptoren zu binden und für den Kernimport zu nutzen. Eines dieser Importine ist Kapß2. Dieser Importrezeptor scheint sowohl bei der Infektion als auch während der Morphogenese den Kernimport von L2 durch die Bindung an das mNLS zu vermitteln.

Die Identifizierung und Charakterisierung von HLA-Klasse-I-restringierten Minorhistokompatibilitätsantigenen und Leukämie-assoziierten Antigenen mittels cDNA-Expressionsklonierung

Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (allo-HSCT) bietet bei einem hohen Anteil akuter Leukämien die einzige kurative Behandlungsmöglichkeit. Um die mit ihr assoziierte Morbidität und Mortalität zu senken und ihre Effektivität zu steigern, soll die GvL (graft-versus-leukemia)-Reaktion als eigentliches Therapieziel gegenüber der unerwünschten GvHD (graft-versus-host disease) möglichst selektiv verstärkt werden. Wesentliche Mediatoren beider Effekte sind alloreaktive T-Zellen. Bei HLA-Übereinstimmung zwischen Spender und Empfänger sind so genannte Minorhistokompatibilitätsantigene (mHAgs) und Leukämie-assoziierte Antigene (LAA) die mutmaßlichen Zielstrukturen beider Reaktionen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden in dem Leukämie-Modell der Patientin MZ201 [akute myeloische Leukämie (AML) vom Subtyp FAB M5] mittels T-Zell-basierter cDNA-Expressionsklonierung zwei neue Antigene identifiziert, die von allogenen, AML-reaktiven CD8+ T-Lymphozyten aus Blut eines HLA-passenden gesunden Spenders erkannt wurden. Es handelt sich zum einen um das HLA-B*5601-restringierte mHAg PLAUR-317P, das aus einem Polymorphismus des Gens PLAUR (plasminogen activator, urokinase receptor) resultiert. Das von den T-Zellen am Besten erkannte Peptid enthält die Aminosäuren 316 - 327. PLAUR wird in lymphohämatopoetischen Zellen und in verschiedenen Malignomen überexprimiert und ist dabei mit schlechterer Prognose und vermehrter Gewebeinvasivität assoziiert. Etwa 30% getesteter Individuen tragen das Allel PLAUR-317P. Zum anderen handelt es sich um ein Epitop aus der Signalregion des Chemokins CXCL3 [chemokine (C-X-C motif) ligand 3], das von CD8+ T-Zellen des gleichen Spenders auf Leukämiezellen der Patientin MZ201 in Assoziation mit HLA-A*0201 erkannt wurde. Auch CXCL3 wird vorwiegend in Zellen der Myelopoese exprimiert. Aufgrund ihres Expressionsmusters sind beide Antigene potentielle Zielstrukturen für die Elimination der Empfänger-Hämatopoese unter Einschluss der Leukämieblasten im Rahmen der allo-HSCT. Weiterführende Untersuchungen müssen zeigen, ob diese Antigene tatsächlich in vivo GvL-Reaktionen hervorrufen. Die Kenntnis eines repräsentativen Spektrums solcher Antigene würde verbesserte Spenderselektionen erlauben und neue Wege des adoptiven T-Zelltransfers erschließen helfen.

Unconventional superconductivity of the heavy fermion compound UNi 2 Al 3

The heavy fermion compound UNi2Al3 exhibits the coexistence of superconductivity and magnetic order at low temperatures, stimulating speculations about possible exotic Cooper-pairing interaction in this superconductor. However, the preparation of good quality bulk single crystals of UNi2Al3 has proven to be a non-trivial task due to metallurgical problems, which result in the formation of an UAl2 impurity phase and hence a strongly reduced sample purity. The present work concentrates on the preparation, characterization and electronic properties investigation of UNi2Al3 single crystalline thin film samples. The preparation of thin films was accomplished in a molecular beam epitaxy (MBE) system. (100)-oriented epitaxial thin films of UNi2Al3 were grown on single crystalline YAlO3 substrates cut in (010)- or (112)-direction. The high crystallographic quality of the samples was proved by several characterisation methods, such as X-ray analysis, RHEED and TEM. To study the magnetic structure of epitaxial thin films resonant magnetic x-ray scattering was employed. The magnetic order of thin the film samples, the formation of magnetic domains with different moment directions, and the magnetic correlation length were discussed. The electronic properties of the UNi2Al3 thin films in the normal and superconducting states were investigated by means of transport measurements. A pronounced anisotropy of the temperature dependent resistivity ρ(T) was observed. Moreover, it was found that the temperature of the resistive superconducting transition depends on the current direction, providing evidence for multiband superconductivity in UNi2Al3. The initial slope of the upper critical field H′c2(T) of the thin film samples suggests an unconventional spin-singlet superconducting state, as opposed to bulk single crystal data. To probe the superconducting gap of UNi2Al3 directly by means of tunnelling spectroscopy many planar junctions of different design employing different techniques were prepared. Despite the tunneling regime of the junctions, no features of the superconducting density of state of UNi2Al3 were ever observed. It is assumed that the absence of UNi2Al3 gap features in the tunneling spectra was caused by imperfections of the tunnelling contacts. The superconductivity of UNi2Al3 was probably suppressed just in a degraded surface layer, resulting in tunneling into non superconducting UNi2Al3. However, alternative explanations such as intrinsic pair breaking effects at the interface to the barrier are also possible.

Charakterisierung spezieller pflanzlicher Gamma-Tubulin-Sequenzbereiche und Detektion potentieller Interaktionspartner mittels Yeast-two-Hybrid-System

Mitotische und postmitotische Vorgänge pflanzlicher Zellen basieren auf der Funktion von Mikrotubuli. Es liegen nur wenige gesicherte Erkenntnisse zur Organisation dieser Multifunktionalität vor. Eine zentrale Bedeutung wird bei der Nukleation der Mikrotubuli an MTOCs durch γ-Tubulin zugeschrieben. Deren Zusammenlagerung an MTOCs ist jedoch noch nicht richtig verstanden. Domänen, die an der Proteinoberfläche exponiert werden, könnten in Interaktionen involviert sein. Hier werden im Besonderen der γ-A und γ-B-Peptivmotiv diskutiert. Es wurde das γ-A- und γ-B-Peptidmotiv des γ-Tubulins hinsichtlich einer Konservierung innerhalb des Pflanzenreiches untersucht. Die beiden Bereiche sind bei den grünen Landpflanzen stark konserviert. Sie divergieren stark zu den einzelligen Grünalgen Chlamydomonas reinhardtii und Chlorella spec. Es wurden daher in der bestehenden phylogentischen Lücke weitere Organismen hinsichtlich des γ-A und γ-B Peptidmotivs untersucht. Auswahlkriterien der Organismen waren Ein-/Mehrzelligkeit, Besitz/Abwesenheit von Centriolen und Besitz/Abwesenheit von Geißeln. Des weiteren wurde mit verschiedenen γ-Tubulin-Konstrukten um das γ-A- und γ-B-Peptidmotiv, gewonnen aus Nicotiana tabacum (BY2) mittels Y2H-System nach Interaktionspartnern gesucht. Bei den Sequenzuntersuchungen des γ-A- und γ-B-Peptidmotivs konnte festgestellt werden, dass die Konservierung innerhalb der Streptophytenlinie erfolgt. Interessant erweist sich die Tatsache, dass dieses Motiv bei den Jochalgen, welche ebenfalls den Streptophyten angehören, nur im γ-A-Peptidmotiv auftritt. Es besteht die Möglichkeit, dass die beiden potentiellen Interaktionspartner verschiedene Proteine als Interaktions-partner besitzen. Durch eine Anwendung eines auf dem GAL4-Protein basierenden Y2H-Systems mit vier unterschiedlichen Konstrukten des γ-Tubulin-A/B-Peptidbereichs als Köder-konstrukt und einer cDNA-Bibliothek als Beutekonstrukt, wurden diverse Sequenzen identifiziert. Identifiziert wurden das Poly(A)-Bindeprotein, Glycerin-aldehyd-3-phosphatdehydrogenase, die S-adenosyl-L-methionine-Synthetase, diverse Proteasom-Untereinheiten, eine sekretorische Peroxidase, eine Ascorbat-Peroxidase, die NtPOX1-Peroxidase und verschiedene Peroxidasen aus Nicotiana tabacum, Sequenzen des Chloroplastengenoms, ein Myosin-ähnliches Protein und eine Sequenz auf dem 5. Chromosom des Medicago truncatula-Klons mth2-16f8 und diverse humane Sequenzen der Proteine DKFZp68 und DKFZp77. Die Ergebnisse weisen auf eine komplexe Funktionsweise der unterschiedlichen Komponenten des pflanzlichen Cytoskeletts und des γ-Tubulins hin. Zur Aufklärung müsste dies in Zukunft mittels anderer genetischer, biochemischer oder funktioneller Methoden untersucht werden. Hypothesen über Interaktionen der Cytoskelettkomponenten können wahrscheinlich nicht allein durch die Anwendung des Y2H-Systems aufgeklärt werden.

Ionenleitfähigkeit in polymeren Matrizes – Synthese, Charakterisierung und Untersuchung dynamischer Prozesse von neuen Lithium- und Protonenleitern

Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der Synthese, physikochemischen und polymerspezifischen Charakterisierung und insbesondere der impedanzspektroskopischen Untersuchung von sowohl neuartigen, solvensfreien lithiumionen- als auch protonenleitfähigen Polymermaterialien für potentielle Anwendungen in sekundären Lithiumionenbatterien bzw. in Hochtemperatur-Protonenaustauschmembran-Brennstoffzellen (engl.: proton exchange membrane fuel cell, auch: polymer electrolyte membrane fuel cell, PEMFC). Beiden Typen von ionenleitfähigen Membranen liegt das gängige Prinzip der chemischen Anbindung einer für den Ionentransport verantwortlichen Seitengruppe an eine geeignete Polymerhauptkette zugrunde („Entkopplung“; auch Immobilisierung), welcher hinsichtlich Glasübergangstemperatur (Tg), elektrochemischer und thermischer Stabilität (Td) eine dynamisch entkoppelte, aber nicht minder bedeutsame Rolle zukommt. Die Transportaktivierung erfolgt in beiden Fällen thermisch. Im Falle der Protonenleiter liegt die zusätzliche Intention darin, eine Alternative aufzuzeigen, in der die Polymerhauptkette gekoppelt direkt am Protonentransportmechanismus beteiligt ist, d.h., dass der translatorisch diffusive Ionentransport entlang der Hauptkette stattfindet und nicht zwischen benachbarten Seitenketten. Ein Hauptaugenmerk der Untersuchungen liegt sowohl bei den lithiumionen- als auch den protonenleitfähigen Polymermembranen auf temperaturabhängigen dynamischen Prozessen der jeweiligen Ionenspezies in der polymeren Matrix, was die Ionenleitfähigkeit selbst, Relaxationsphänomene, die translatorische Ionendiffusion und im Falle der Protonenleiter etwaige mesomere Grenzstrukturübergänge umfasst. Lithiumionenleiter: Poly(meth)acrylate mit (2-Oxo-1,3-dioxolan)resten (Cyclocarbonat-) in der Seitenkette unterschiedlicher Spacerlänge wurden synthetisiert und charakterisiert. Die Leitfähigkeit s(,T) erreicht bei Poly(2-oxo-[1,3]dioxolan-4-yl)methylacrylat (PDOA): Lithium-bis-trifluormethansulfonimid (LiTFSI) (10:3) ca. 10^-3,5 S cm^-1 bei 150 °C. Weichmachen (Dotieren) mit äquimolaren Mengen an Propylencarbonat (PC) bewirkt in allen Fällen einen enormen Anstieg der Leitfähigkeit. Die höchsten Leitfähigkeiten von Mischungen dieser Polymere mit LiTFSI (und LiBOB) werden nicht beim System mit der niedrigsten Tg gefunden. Auch dient Tg nicht als Referenztemperatur (Tref) nach Williams-Landel-Ferry (WLF), so dass eine WLF-Anpassung der Leitfähigkeitsdaten nur über einen modifizierten WLF-Algorithmus gelingt. Die ermittelten Tref liegen deutlich unterhalb von Tg bei Temperaturen, die charakteristisch für die Seitenkettenrelaxation sind („Einfrieren“). Dies legt nahe, dass der Relaxation der Seitenketten eine entscheidende Rolle im Li^+-Leitfähigkeitsmechanismus zukommt. Die Li^+-Überführungszahlen tLi^+ in diesen Systemen schwanken zwischen 0,13 (40 °C) und 0,55 (160 °C). Protonenleiter: Polymere mit Barbitursäure- bzw. Hypoxanthinresten in der Seitenkette und Polyalkylenbiguanide unterschiedlicher Spacerlänge wurden synthetisiert und charakterisiert. Die Leitfähigkeit s(,T) erreicht bei Poly(2,4,6(1H,3H,5H)-trioxopyrimidin-5-yl)methacrylat (PTPMA) maximal ca. 10^-4,4 S cm^-1 bei 140 °C. Höhere Leitfähigkeiten sind nur durch Mischen mit aprotischen Lösungsmitteln erreichbar. Die höchste Leitfähigkeit wird im Falle der Polyalkylenbiguanide bei Polyethylenbiguanid (PEB) erzielt. Sie erreicht 10^-2,4 S cm^-1 bei 190 °C. Die Aktivierungsenergien EA der Polyalkylenbiguanide liegen (jeweils unterhalb von Tg) zwischen ca. 3 – 6 kJ mol^-1. In allen beobachteten Fällen dient Tg als Tref, so dass eine konventionelle WLF-Behandlung möglich ist und davon auszugehen ist, dass die Leitfähigkeit mit dem freien Volumen Vf korreliert.

Proteins control in biomineralization processes of the freshwater pearl mussel Hyriopsis cumingii

Pearls are an amazing example of calcium carbonate biomineralization. They show a classic brick and mortar internal structure in which the predominant inorganic part is composed by aragonite and vaterite tablets. The organic matrix is disposed in concentric layers tightly associated to the mineral structures. Freshwater cultivate pearls (FWCPs) and shells nacreous layers of the Chinese mussel Hyriopsis cumingii were demineralized using an ion exchange resin in order to isolate the organic matrix. From both starting materials a soluble fraction was obtained and further analyzed. The major component of the soluble extracts was represented by a similar glycoprotein having a molecular weight of about 48 kDa in pearls and 44 kDa in shells. Immunolocalization showed their wide distribution in the organic sheet surrounding calcium carbonate tablets of the nacre and in the interlamellar and intertabular matrix. These acidic glycoprotein also contained inside the aragonite platelets, are direct regulators during biomineralization processes, participating to calcium carbonate precipitation since the nucleation step. Selective calcium carbonate polymorph precipitation was performed using the two extracts. The polysaccharides moiety was demonstrate to be a crucial factor in polymorphs selection. In particular, the higher content in sugar groups found in pearls extract was responsible of stabilization of the high energetic vaterite during the in vitro precipitation assay; while irregular calcite was obtained using shells protein. Furthermore these polypeptides showed a carbonic anhydrase activity that, even if not directly involved in polymorphs determination, is an essential regulator in CaCO3 formation by means of carbonate anions production. The structural and functional characterization of the proteins included in biocomposites, gives important hints for understanding the complicated process of biomineralization. A better knowledge of this natural mechanism can offer new strategies for producing environmental friendly materials with controlled structures and enhanced chemical-physical features.

Fluorescence close to dielectric interfaces

The aim of the work was to study the correlation between the orientation and excited-state lifetimes of organic dyes close to dielectric interfaces. For this purpose, an experimental setup was designed and built, guiding the light through a prism in total internal reflection geometry. Fluorescence intensities and lifetimes for an ensemble of dye molecules were analyzed as a function of the excitation and detection polarizations. Working close to the total internal reflection angle, the differences between polarization combinations were enhanced. A classical electromagnetic model that assumes a chromophore as a couple of point-like electrical dipoles was developed. A numerical method to calculate the excitation and emission of dye molecules embedded in a multilayer system was implemented, by which full simulation of the time resolved fluorescence experiments was achieved. Free organic dyes and organic dyes covalently bound to polyelectrolyte chains were used. The polymer functionalization process avoided aggregation and provided control over the dyes position, within a few nanometers to the interface. Moreover, by varying the pH, the polymer chains could be deposited on different substrates with different conformations and the resulting fluorescence characteristics analyzed. Initially the fluorescence of organic dyes embedded in a polymer matrix was studied as a function of the distance between the fluorophores and the polymer-air interface. The non-radiative decay rate, vacuum decay rate and the relative angle between the excitation and emission dipoles of the chromophores could be determined. Different free organic dyes were deposited onto different dielectric spacers, as close as possible to the air-dielectric interface. Surprisingly, the fluorescence characteristics of dyes deposited onto polyelectrolyte layer were in good agreement with theoretical predictions of dyes in a polymer matrix, even when the layer was only 2 nm thick. When functionalized chains were deposited at low pH, on top of a polyelectrolyte spacer, the fluorescence had the characteristics of emitters embedded in a polymer matrix as well. Surface deposition at high pH showed an intermediate behaviour between emitters embedded in polymer and on top of the surface, in air. In general, for low pH values, the chains are deposited on a substrate in a train-like conformation. For high pH values, the chains are deposited in a loop-like conformation. As a consequence at low pH the functionalized polymer strongly interdigitates with the polyelectrolyte chains of the spacer, bringing most of the dyes inside the polymer. Thus, the fluorophores may experience the polymer as surrounding environment. On the other hand, for high pH values the dye-loaded chains adsorbed have a conformational arrangement of dense loops that extend away from the surface. Therefore many fluorophores experience the air as surrounding environment. Changing the spacer from polyelectrolyte to negatively charged silane produced contradictory results for lifetimes and intensities. The fluorescence intensities indicated the behaviour of emitters embedded in a polymer matrix, regardless of the pH value. On the other hand, for low pH values, the excited-state lifetimes showed that the emitters behaved as in air. For higher pH values, an intermediate behaviour between fluorophores located within and above of a dielectric film was observed. The poor agreement between theoretical and experimental data may be due to the simplified model utilized, by which the dipoles are assumed either in one side or in the other with respect to a geometrical air-dielectric interface. In the case when the dielectric film is constituted by the functionalized polymer chains themselves, reality is more complex and a different model may apply. Nevertheless, possible applications of the technique arise from a qualitative analysis.