974 resultados para Virulência (Microbiologia) Teses
Resumo:
Estreptococos do grupo B (EGB) a principal causa de sepse e meningite neonatal e tem sido recentemente reconhecido como patgeno responsvel por infeces invasivas em adultos imunocomprometidos (idosos ou portadores de doenas crnicas). Os EGB produzem inmeras enzimas extracelulares, vrias das quais interagem com o sistema imune do hospedeiro e so importantes durante a interao EGB-hospedeiro, bem como para o desenvolvimento da doena. Estudos anteriores mostraram que metaloproteases esto envolvidas em vrias vias metablicas em diferentes tipos celulares. Por esta razo, ns decidimos investigar o possvel envolvimento de metaloproteases de EGB durante a interao celular e apoptose/necrose induzida pelo micro-organismo em clulas endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e da linhagem de epitlio respiratrio (A549). Tratamento de EGB com inibidores de metaloproteases (EDTA, EGTA e FEN) no induziu alteraes no crescimento bacteriano, mas promoveu alteraes na expresso de protenas de superfcie, capacidade adesiva e perfil de sobrevivncia intracelular do patgeno. O EGB e o sobrenadante do crescimento bacteriano (meio condicionado; MC) promoveram a morte das clulas HUVEC e A549. Contudo, o tratamento com inibidores de metaloproteases restauraram a viabilidade celular induzida pelos EGB e o MC, sugerindo que metaloproteases bacteriana esto envolvidas no rompimento da barreira celular, promovendo a disseminao bacteriana. Este trabalho descreve pela primeira vez apoptose e necrose induzidas pelo EGB e MC em HUVEC e clulas A549 aps 24h de incubao, respectivamente. Ns tambm observamos reduo da pr-caspase-3 aps infeco das HUVEC com EGB e MC, sugerindo ativao da caspase-3. Alm disso, o aumento da expresso da protena pr-apopttica Bax e diminuio dos nveis da protena anti-apopttica Bcl-2 em HUVEC, demonstram o envolvimento do mecanismo apopttico mitocondrial (via intrnseca). A melhor compreenso das bases moleculares da patognese do EGB contribui para identificar novas molculas bacterianas e hospedeiras que podem representar novos alvos teraputicos ou imunoprofilticos contra a doena causada por esse patgeno neonatal.
Resumo:
As <i>Aeromonas</i> so consideradas patgenos em potenciais para o homem e animais e esto amplamente distribudas no ambiente sendo a gua e os alimentos importantes veculos de transmisso. Muitos estudos tm demonstrado que a patologia causada pela infeco por <i>Aeromonas</i> complexa e envolvem inmeros fatores de virulência, dentre eles a aderncia, invaso, enterotoxinas, hemolisinas, exoenzimas, siderforos, flagelos, formao de biofilme e mecanismos de secreo. No presente estudo, analisamos os mecanismos de patognese mediados por <i>A. caviae</i> e <i>A. hydrophila</i>, avaliando a participao desses microrganismos nos processos de adeso, invaso, persistncia intracelular e citotoxidade celular. Foram utilizados ensaios quantitativos <i>in vitro</i> para testar associao, invaso e persistncia intracelular em linhagens celulares HEp-2 e/ou T84. A interao de tecidos intestinais de coelho cultivados <i>in vitro</i> (IVOC) com trs cepas de <i>A. caviae</i> originrias de fezes diarricas tambm foi avaliada. Observamos que 10 (62,5%) das 16 cepas de <i>Aeromonas</i> spp. de diferentes origens, submetidas aos testes de invaso quantitativos foram capazes de invadir clulas HEp-2 e T84 em 6 horas de incubao. As cepas positivas nos testes de invaso foram submetidas ao teste quantitativo de persistncia em clulas HEp-2 e sobreviveram no ambiente intracelular por 48 e/ou 72 horas sem multiplicao. A interao de trs cepas de <i>A. caviae</i> com a mucosa intestinal de coelho <i>ex vivo</i> resultou em aderncia, produo de muco e alteraes como, intensa vacuolizao e drstica desorganizao estrutural que levaram a destruio das microvilosidades intestinais. Este estudo demonstrou que subconjuntos de cepas de <i>A. caviae</i> e <i>A. hydrophila</i> de diversas origens, foram capazes de invadir, persistir ou destruir linhagens celulares <i>in vitro</i>. Nosso estudo tambm evidenciou que cepas de <i>A. caviae</i> causaram expressivas alteraes morfolgicas que resultaram na destruio de epitlios intestinais de coelho <i>ex vivo</i>. Finalmente, nossos resultados contriburam para reforar o potencial patognico de cepas de <i>Aeromonas</i>, em especial, as de origem vegetal e clnica.
Resumo:
Nas ltimas dcadas, os Staphylococcus coagulase-negativo, tm sido considerados como patgenos verdadeiros, sendo um dos principais grupos bacterianos responsveis pelas infeces relacionadas a assistncia a sade (IRAS). O presente estudo teve como objetivo geral: avaliao da relao entre a resistncia a oxacilina e a produo de biofilme de amostras Staphylococcus coagulase-negativo de origem comunitria e hospitalar. Neste sentido, foram desenvolvidos os seguintes objetivos especfico: identificar ao nvel de espcie os Staphylococcus coagulase-negativo; analisar por tcnica fenotpica (gar vermelho do Congo) a produo de slime; avaliar quantitativamente, a produo de biofilme; correlacionar a produo de polissacardeos extracelulares (slime) com a produo de biofilme; avaliar a relao da resistncia a oxacilina como indicador da presena do gene mecA; avaliar a relao entre a concentrao inibitria mnima e a concentrao bactericida mnima para oxacilina; pesquisar a presena dos genes mecA, icaAD e atlE, pela tcnica de PCR. Foi estudado um total de 150 amostras, sendo 50 isoladas de fmites, 50 isoladas de sangue e 50 isoladas de comunidade. Independente da origem, foram identificadas 14 espcies de Staphylococcus coagulase-negativo, sendo mais frequentes S. epidermidis 42,6%, S. haemolyticus 13,3% e S. cohnii cohnii 10,7%. A anlise geral da expresso fenotpica de slime mostrou que 64% das amostras avaliadas eram produtoras de slime. Das 150 amostras testadas neste estudo, 95,3% foram produtoras de biofilme. Ao considerarmos a anlise da quantificao do biofilme em relao s origens das amostras estudadas no encontramos diferenas significativas e a maioria das amostras foi considerada moderadamente produtora de biofilme. O gene mecA foi detectado em 6 amostras comunitrias, 34 amostras de fmites e 34 amostras de sangue. No houve diferena significativa entre as amostras de fmites e sangue. Porm, houve diferena significativa entre as amostras de origem comunitria e as de origem hospitalar - fmites e sangue (p < 0,0001). Ao compararmos as trs origens de isolamento quanto a presena do gene atlE observamos que houve diferena significativa (p = 0,0012) entre elas. Sendo, as amostras isoladas de sangue, as que apresentaram maior nmero de amostras que possuam o gene atlE (n = 18). Das 150 amostras testadas observamos a presena do gene icaAD em 46% amostras comunitrias, 56% amostras de fmites e 60% amostras de sangue, no encontramos diferena significativa (p = 0,5750). Observamos uma correlao entre a resistncia a oxacilina e a produo de slime, pois as amostras de origem hospitalar (fmites e sangue) apresentaram altos nveis de resistncia a oxacilina e em sua grande maioria foram produtoras de slime. A espcie S. epidermidis foi a mais isolada e deve-se ressaltar que, quando comparada com as outras espcies, apresentou altos nveis de resistncia a oxacilina, sendo a maioria produtora de slime e biofilme.
Resumo:
Staphylococcus aureus resistente meticilina (MRSA) um dos principais microrganismos envolvidos nas Infeces relacionadas Assistncia Sade (IrAS). Porm, um clone de MRSA, o CA-MRSA, emergiu na comunidade e atualmente vem sendo agente de IrAS. O objetivo desta dissertao avaliar fenotpica e genotipicamente 111 amostras de Staphylococcus aureus resistentes meticilina e sensveis a antibiticos no -lactmicos de pacientes atendidos em cinco hospitais no municpio do Rio de Janeiro. Utilizando os critrios padronizados pelo CLSI 2012, foram determinadas as susceptibilidades a 11 antimicrobianos pelo mtodo de disco difuso em gar e concentrao inibitria mnima para vancomicina e oxacilina pelo mtodo da microdiluio em caldo. A multirresistncia (resistncia a 3 ou mais antimicrobianos no -lactmicos) foi observada em 31,5% das amostras, sendo que 53,2% apresentaram resistncia ao antimicrobiano clindamicina, uma das opes para o tratamento emprico das infeces de pele/tecidos moles. 86,4% apresentaram concentrao inibitria mnima (CIM) para vancomicina ≥ 1,0 g/mL ou seja, elevado percentual de amostras associadas ao fenmeno MIC creep, o qual est associado ao insucesso na terapia antimicrobiana anti-MRSA. No foi observado at o momento nenhuma amostra com CIM ≥ 4cg/mL para vancomicina, entretanto, j h resistncia linezolida em quatro hospitais do estudo. A tipificao do SCCmec nos permitiu classificar 4,5% das amostras em HA-MRSA e 86,5% em CA-MRSA, nas quais a resistncia heterognea tpica oxacilina foi observada em 57,2%. A toxina de Panton-Valentine (PVL) foi identificada pela metodologia de PCR em 28% das amostras com gentipo CA-MRSA. Os fatores de riscos clssicos, da literatura, relacionados infeco por HA-MRSA foram tambm observados nos pacientes com infeco por CA-MRSA portadoras de SCCmec IV e V. No intuito de verificar a existncia de similaridades genticas ou a presena de clone predominante entre as amostras dos cinco hospitais, foi realizada a tcnica de eletroforese em gel sob campo pulsado (PFGE) e observou-se diversidade gentica assim como a presena de amostras com padres similares aos clones OSPC (18,5%) e USA400. No foram encontradas amostras com padres de eletroforese similares aos clones USA300, USA800 e CEB. essencial a vigilncia da resistncia aos antimicrobianos no -lactmicos no CA-MRSA, em especial vancomicina. A mudana na epidemiologia deste microrganismo vem impactando os padres caractersticos dos gentipos limitando os critrios de diferenciao entre eles. Neste contexto, as tcnicas moleculares atuam como excelentes ferramentas de caracterizao. O conhecimento do patgeno auxilia na elaborao e implementao de medidas preventivas, contribuindo para o controle da doena tanto no ambiente hospitalar quanto na comunidade.
Resumo:
Sporothrix schenckii um fungo dimrfico e agente etiolgico da esporotricose, uma micose profunda que apresenta diferentes manifestaes clnicas. As diversas manifestaes clnicas desta e de outras doenas infecciosas podem ser relacionadas ao status imune do hospedeiro, a fatores de virulência do patgeno ou a diferentes gentipos. Dados anteriores do nosso grupo demonstram que diferenas na expresso de adesinas do S. schenckii para fibronectina esto diretamente relacionadas virulência de diferentes cepas. Neste trabalho visamos avaliar caracteres morfolgicos bioqumicos e genotpicos de doze isolados de geoflicos, zooflicos e antropoflicos de S. schenckii, de diferentes origens geogrficas, que apresentam diferentes graus de virulência. Foi analisada a morfologia das formas de miclio e levedura de cada isolado. Foi observado que a fase de miclio dos isolados estudados apresentaram morfologia tpica com hifas finas e septadas, com condios obovides ou ovides alongados. As leveduras apresentaram pleomorfismo tpico da espcie, com clulas variando do formato ovide ao alongado. Verificamos ainda a expresso de adesinas para fibronectina e laminina, do antgeno gp70 e, o padro de bandas antignicas reconhecidas por anticorpos IgG presentes em soro de pacientes com esporotricose ou de camundongos infectados. Para isso, foram extradas protenas de superfcie da forma de levedura de cada isolada, sendo os extratos ensaiados por Western blot. Nestes ensaios observamos que os isolados mais virulentos de S. schenckii expressavam mais adesinas para fibronectina e laminina. A presena da gp70 foi detectada em dez dos doze isolados, sendo que apenas os isolados zooflicos no expressam esta glicoprotena. O padro antignico foi varivel entre os isolados, no havendo clara relao com a origem e/ou distribuio geogrfica. Os dados fenotpicos foram confrontados com dados genotpicos. Para isso, sequenciamos os loci da calmodulina (CAL) e do Internal Transcribed Spacer 1/2 (ITS 1/2) a fim de averiguar se haviam diferenas genotpicas entre os isolados estudados. As anlises do sequenciamento do loci CAL e ITS, contudo, apontam a diviso dos isolados em duas espcies filogenticas, S. schenckii e S. brasiliensis no correlacionada com a distribuio geogrfica dos mesmos. Nosso estudo refora a hiptese de haver uma correlao entre virulência e expresso de adesinas, porm, sem qualquer relao entre a distribuio geogrfica dos isolados zoofilicos, antropoflicos ou geoflicos, bem como dos gentipos encontrados.
Resumo:
Em estudo anterior, as espcies de enterobactrias apresentando perfis variados de resistncia aos antimicrobianos foram detectadas em 20% dos stios com leses periodontais de pacientes sadios do ponto de vista sistmico. Tais cepas microbianas foram submetidas a investigaes com o intuito de determinar expresso de enzimas hidrolticas para substratos diversos, a multirresistncia aos agentes antimicrobianos e os mecanismos de resistncia aos antimicrobianos da classe dos β lactmicos. A maioria das amostras expressou atividade de gelatinase (65%), caseinase (30%) e elastase (10%). Lipase, lecitinase e DNase foram observadas apenas para Serratia marcescens. A multirresistncia (considerado como a resistncia a pelo menos dois agentes antimicrobianos de famlias diferentes) foi observada em 56% das amostras isoladas. A maioria das cepas foi resistentes ampicilina (93,75%) e amoxicilina/cido clavulnico (81,25%). Investigaes sobre a resistncia aos antibiticos β-lactmicos mostraram que trs amostras resistentes cefalosporinas de 2 gerao, apresentaram perfis plasmidiais de diferentes pesos moleculares. A expresso fenotpica de β-lacatamases, foi detectada nas cepas de Enterobacter cloacae (PcOM46 e PcOM5) e S. marcescens (PcOM63). No entanto, na anlise molecular, no foi possvel confirmar a expresso fenotpica de diferentes β-lactamases, com exceo do E. cloacae PcOM46, que apresentou amplificao para AmpC e blaTEM. Embora sensvel maioria dos antibiticos β-lactmicos (exceo feita ampicilina e amoxicilina / cido clavulnico), amostra de S. marcescens PcOM68 apresentou amplificao para o gene blaSHV. Os experimentos de conjugao no detectaram a transferncia de plasmdios para uma cepa de Escherichia coli K12 sensvei aos β-lactmicos, o mesmo ocorreu nos procedimentos de transformao por eletroporao e por CaCl2, sugerindo uma resistncia dependente de genes cromossomiais. A expresso de diferentes atividades enzimticas, juntamente com a resistncia aos antimicrobianos, aponta estes grupos de bactrias como agentes patognicos potenciais capazes de contribuir para a patognese e resposta quimioterapia antimicrobiana nas doenas periodontais, alm da disseminao sistmica para outros locais do corpo, especialmente em indivduos imunocomprometidos. A colonizao prvia de leses periodontais por espcies resistentes aos β-lactmicos, pode contribuir para a disseminao destes genes relacionados resistncia aos antimicrobianos em ambientes hospitalares.
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P. aeruginosa um importante agente de infeces relacionadas assistncia em sade. Habitualmente, o estabelecimento de infeces agudas precedido pela colonizao das mucosas dos pacientes. No se sabe, porm, se os processos infecciosos so causados pelas prprias cepas bacterianas colonizadoras ou por outras com que os pacientes entrem em contato, dotadas ou no de maior potencial de virulência ou de resistncia a antimicrobianos que as tornem mais eficientes como agentes infecciosos. Assim, este estudo teve como objetivos i) investigar a existncia de potenciais diferenas entre amostras de P. aeruginosa que causaram apenas colonizao e aquelas responsveis por infeco, isoladas de um mesmo paciente, quanto a seus fentipos de virulência e de no susceptibilidade a antimicrobiamos; ii) pesquisar a existncia de associao entre caractersticas dos paciente, incluindo o tipo de evoluo clnica, com as demais variveis estudadas. No estudo foram includos 21 pacientes que desenvolveram infeco por P. aeruginosa durante sua internao no Centro de Terapia Intensiva do Hospital Universitrio Clementino Fraga Filho, entre abril de 2007 e abril de 2008. De cada paciente foram selecionadas duas amostras bacterianas: a primeira isolada durante o episdio de infeco e a amostra colonizadora obtida imediatamente antes da ocorrncia da infeco. As amostras selecionadas foram estudadas quanto a i) expresso de trs mecanismos de virulência (citotoxicidade, aderncia a clulas epiteliais respiratrias humanas e capacidade de formao de biofilme); ii) presena de genes codificadores das protenas efetoras do sistema de secreo do tipo 3 (SST3 - exoS, exoT, exoU e exoY); iii) perfil de susceptibilidade a antimicrobianos, iv) perfil de fragmentao do DNA cromossmico por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). As amostras bacterianas obtidas de infeces agudas foram significativamente mais citotxicas que aquelas obtidas de colonizao. Embora sem diferena estatstica, a citotoxicidade das amostras que causaram infeco em pacientes que evoluram para bito foi superior citotoxicidade das amostras de pacientes que sobreviveram. O gene que codifica a toxina ExoU foi detectado em 16 amostras (38%), sendo nove de colonizao e sete de infeco. No houve diferena significativa entre as amostras de colonizao e infeco quanto aderncia, produo de biofilme, expresso dos genes do SST3 e no-susceptibilidade s diferentes classes de antimicrobianos. Tambm no foi encontrada associao entre a no-susceptibilidade quinolona, ou a outras classes de antimicrobianos, e a presena do gene exoU. As 42 amostras de P. aeruginosa estudadas foram includas em 20 gentipos. Em 10 deles foi detectado o gene exoU. Amostras de um mesmo gentipo foram uniformes quanto expresso dos genes do SST3 e a no-susceptibilidade aos antimicrobianos, mas no quanto s outras variveis estudadas. Em apenas sete pacientes (33,3%), as amostras de colonizao e de infeco pertenciam ao mesmo gentipo. Assim, nesse estudo, o estabelecimento do processo infeccioso resultou no da perda do equilbrio estabelecido entre os mecanismos de agresso das amostras colonizadoras e os de defesa do hospedeiro e sim da introduo de nova cepa bacteriana no organismo hospedeiro, cepa esta dotada de maior potencial citotxico.
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O objetivo principal deste estudo foi investigar a interao de 24 cepas de E. faecalis isoladas de infeces endodnticas primrias s protenas de matriz dentinria, como tambm a molculas de matriz presentes em leses de endocardites. A anlise desta interao foi feita atravs de tcnica enzimtica, com confirmao pela tcnica de fluorescncia. Alm disto, foi realizada a confirmao do isolamento da espcie E. faecalis, atravs da tcnica de PCR para o gene 16SrRNA e a anlise da presena de genes de virulência da referida espcie microbiana para aderncia s supostas protenas de matriz incluindo s de ligao ao colgeno (ace, gelE, esp, agg e efaA). O maior padro de interao das cepas ocorreu com a fibronectina (83,4%), seguido pelo fibrinognio (62,5%) e colgeno humano tipo I (52%). Curiosamente, a aderncia observada para o colgeno do tipo I, foi de pequena magnitude, quando comparado com a amostra padro da ATCC 29212. As cepas ATCC 29212, A1, A43 e A68 interagiram com todas as protenas de matriz utilizadas neste estudo. Um percentual expressivo das cepas testadas apresentou amplificao para efaA (86,9%) e para ace (73,9%). Paralelamente, todas as cepas apresentaram amplificao para gelE e foram negativas para os genes agg e esp. Adicionalmente, no houve correlao entre a deteco dos genes de virulência e a interao s protenas de matriz, evidenciando que, mesmo com a deteco dos genes nas amostras, se faz necessrio avaliar a expresso gnica por qPCR.
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Corynebacterium diphtheriae um importante patgeno humano e agente causal da difteria. Embora seja observada uma reduo mundial no nmero de casos da doena, a difteria permanece endmica em muitos pases e surtos so esporadicamente notificados. No Brasil, o ltimo surto ocorreu no estado no Maranho e revelou mudanas em aspectos clnico-epidemiolgicos da doena. Diferentemente da maioria das cepas de difteria brasileiras, que pertencem ao biovar mitis, nesse surto dois diferentes pulsotipos de C. diphtheriae biovar intermedius foram isolados. Alm disso, sinais patognomnicos da doena no foram relatados em parte dos casos. C. diphtheriae tambm vem sendo relacionado com quadros de infeces invasivas, apesar de ser reconhecido como patgeno tipicamente extracelular. Em conjunto, estas mudanas no perfil das infeces por C. diphtheriae sugerem a existncia de outros fatores de virulência alm da produo da toxina diftrica. Neste sentindo, foram realizadas anlises de tipagem molecular e de genmica comparativa para avaliar a diversidade gentica e o potencial de virulência de cepas de C. diphtheriae isoladas de difteria clssica e infeces invasivas. Os resultados obtidos demonstram a circulao de diferentes clones invasores no Brasil. Alm disso, revelaram diferenas marcantes na presena e na composio de ilhas de patogenicidade entre as amostras, bem como nos genes sob regulao do DtxR e nas sequncias dos corinefagos integradas ao cromossomo bacteriano. Uma vez que o potencial invasor bacteriano e a persistncia no ambiente podem estar relacionados tolerncia ao estresse oxidativo, foram procurados nos genomas sequenciados, genes possivelmente envolvidos neste processo. Dentre estes, os genes DIP0906, predito como gene de resistncia ao oxidante telurito (TeO32-), e DIP1421, codificador do regulador transcricional OxyR, foram caracterizados funcionalmente e tiveram seus papis na patogenicidade investigados. Ensaios in vivo utilizando o nematdeo Caenorhabditis elegans demonstraram que ambos so importantes para a virulência de C. diphtheriae. Alm da resistncia ao TeO32, DIP0906 parece contribuir para a resistncia ao perxido de hidrognio (H2O2) e para a viabilidade no interior de clulas respiratrias humanas. J OxyR, alm de controlar negativamente a resposta ao H2O2, parece estar envolvido com a ligao de C. diphtheriae a protenas plasmticas e de matriz extracelular. Adicionalmente, foi investigada resistncia e a capacidade de adaptao de C. diphtheriae frente a agentes oxidantes, atravs da induo de resposta adaptativa e/ou resistncia cruzada e da formao de biofilme. As cepas de C. diphtheriae apresentaram diferentes nveis de resistncia e um comportamento heterogneo na presena dos agentes oxidantes, o que sugere a existncia de diferentes estratgias de sobrevivncia e adaptao de C. diphtheriae nas condies de estresse oxidativo.
Resumo:
A esporotricose uma doena mictica, infecciosa e crnica, que envolve o tecido cutneo e subcutneo, e que pode afetar seres humanos e animais. Esta micose sempre foi atribuda a um nico patgeno, o Sporothrix schenckii, um fungo termodimrfico, que cresce como levedura a 37 C e como miclio temperatura ambiente. No entanto, nos ltimos anos, foi demonstrado que isolados identificados como S. schenckii apresentavam grande variabilidade gentica, sugerindo que este txon consiste em um complexo de espcies. Esta doena causada pela implantao traumtica do patgeno fngico, porm, os mecanismos de invaso e disseminao deste microorganismo, bem como as molculas envolvidas nestes processos, ainda so pouco conhecidos. Com base nessas informaes, este trabalho visa identificar molculas de superfcie deste patgeno envolvidas na interao deste fungo com protenas matriciais, bem como analisar diferenas fenotpicas entre espcies do denominado complexo Sporothrix. Foram utilizados, neste estudo, cinco isolados de Sporothrix spp., sendo trs isolados clnicos, um isolado ambiental e um isolado de gato. A virulência de cada isolado foi comparada capacidade adesiva protena matricial fibronectina. Foi observado que os isolados com maior capacidade infectiva eram os que apresentavam maior capacidade adesiva fibronectina. Verificamos ento a expresso de adesinas para fibronectina na superfcie de cada isolado, por Western blot, e observamos que os isolados mais virulentos e com maior capacidade adesiva expressavam mais adesinas para fibronectina. Bandas reativas com o anticorpo monoclonal contra adesina gp70 (mAb P6E7) foram reveladas nos extratos de parede celular dos isolados estudados. Anlises por microscopia confocal revelaram a co-localizao da gp70 com a adesina para fibronectina na superfcie dos isolados. Anlises filogenticas demonstraram que os isolados estudados possuam diferenas genotpicas capazes de agrup-los em duas espcies, S. schenckii e S. brasiliensis. Esta anlise revelou que o isolado avirulento era S. brasiliensis e no S. schenckii, como se pensava. Este dado novo nos levou a verificar se a virulência e as caractersticas fenotpicas estariam relacionadas ao gentipo. A avaliao da virulência mostrou que outro isolado de S. brasiliensis era to virulento quanto os isolados de S. schenckii. Alm disso, as caractersticas morfolgicas, como tamanho, forma e perfil de crescimento, das fases miceliana e leveduriforme, e caractersticas microscpicas da parede das leveduras tambm foram avaliadas. Porm, no foi possvel correlacionar, de forma clara, a morfologia celular com a especiao do gnero Sporothrix. A expresso da gp70 na superfcie das duas espcies foi verificada e foi observado que o isolado virulento de S. brasiliensis quase no expressa a gp70 na sua superfcie em contraste com o isolado avirulento de S. brasiliensis, que alm de expressar esta glicoprotena em grande quantidade ainda a libera para o meio extracelular. Este estudo mostra que h uma correlao direta entre virulência e expresso de adesinas, porm, sem qualquer relao entre caractersticas fenotpicas e gentipo.
Resumo:
Pseudomonas aeruginosa um importante agente de pneumonia, particularmente em pacientes submetidos ventilao mecnica, que pode evoluir para sepse, com elevadas taxas de letalidade. Na sepse, o processo inflamatrio sistmico exacerbado favorece o desequilbrio entre as vias de coagulao e fibrinlise e a instalao de um estado pr-coagulante, com o aparecimento de trombose microvascular, coagulao intravascular disseminada e falncia de mltiplos rgos. Conhecendo a potente atividade pr-inflamatria da toxina ExoU produzida por P. aeruginosa, decorrente de sua atividade fosfolipsica A2, o objetivo desta tese foi investigar seu potencial de induo de alteraes hemostticas relacionadas patognese da sepse. Utilizando modelo de sepse em camundongos inoculados, por via intratraqueal, com suspenses de P. aeruginosa produtora de ExoU (PA103) ou de cepa com deleo do gene exoU, no produtora da toxina, foi mostrado que ExoU determinou maior gravidade da infeco, maior taxa de letalidade, leucopenia, trombocitose, hiperpermeabilidade vascular e transudao plasmtica, evidenciadas, respectivamente, pela maior concentrao de protenas nos lavados broncoalveolares (LBAs) e acmulo do corante Azul de Evans, previamente inoculado nos animais, por via endovenosa, no parnquima renal. ExoU favoreceu, tambm, a ativao plaquetria, confirmada pela maior concentrao de plaquetas expressando P-selectina em sua superfcie, maior nmero de micropartculas derivadas de plaquetas e maior concentrao plasmtica de tromboxano A2. A histopatologia dos pulmes e rins dos animais infectados com PA103 confirmou a formao de microtrombos, que no foram detectados nos animais controles ou infectados com a cepa mutante. Nos pulmes, a produo de ExoU determinou intensa resposta inflamatria com maior concentrao de leuccitos totais e polimorfonucleados, interleucina-6 e fator de necrose tumoral-α nos LBAs. A anlise imunohistoqumica mostrou intensa deposio de fibrina nos alvolos e septos interalveolares. A atividade pr-coagulante dependente do fator tissular detectada nos LBAs dos camundongos infectados com PA103 foi independente da produo do inibidor da via de ativao do fator tissular (TFPI), mas associada ao aumento da produo do inibidor do ativador do plasminognio-1 (PAI-1). Para investigar a participao do fator de ativao plaquetria (PAF) na liberao de PAI-1, foi pesquisada a atividade da enzima PAF-acetil-hidrolase (PAF-AH) nos LBAs dos camundongos. A atividade de PAF-AH apresentou-se significativamente elevada nos LBA dos camundongos infectados com PA103. O tratamento dos animais com um inibidor do PAF, antes da infeco, resultou na diminuio significativa das concentraes de PAI-1 e de leuccitos totais, bem como da atividade pr-coagulante dos LBAs. In vitro, ExoU induziu maior expresso do RNA mensageiro de PAI-1 e maior liberao da protena PAI-1 nos sobrenadantes de clulas epiteliais respiratrias da linhagem A549. O tratamento das clulas A549 com um anticorpo anti-receptor de PAF, antes da infeco, reduziu significativamente a concentrao de PAI-1 nos sobrenadantes de clulas infectadas com a cepa selvagem. Estes resultados demonstraram um novo mecanismo de virulência de P. aeruginosa atravs da atividade pr-trombtica de ExoU e a possibilidade de utilizao da identificao de ExoU em isolados clnicos de pacientes graves como um marcador prognstico para estes pacientes.
Resumo:
Corynebacterium diphtheriae pode ser isolado tanto de quadros de difteria clssica, quanto de infeces sistmicas, como endocardite. O fibrinognio (Fbn) e a fibronectina (Fn) so glicoprotenas presentes na matriz extracelular de tecidos conjuntivos. A influncia destas protenas na patognese das infeces locais e invasivas causadas por C. diphtheriae objeto de estudo devido ao fato do bacilo diftrico poder ser encontrado em leses nas quais o Fbn e a Fn so predominantes, incluindo a pseudomembrana diftrica e vegetaes cardacas presentes na endocardite infecciosa. So crescentes as evidncias de que o C. diphtheriae pode, alm de aderir, ser internalizado por clulas em cultura. No presente estudo, investigou-se a participao de C. diphtheriae e das protenas de superfcie 67-72p na aderncia Fn e ao Fbn de plasma humano e a eritrcitos. A aderncia s clulas HEp-2 e internalizao tambm foram analisadas. A participao de 67-72p nos mecanismos de morte celular foi avaliada atravs das coloraes por Azul de Tripan e 46-diamidino-2-fenil indol (DAPI), pelo ensaio de reduo utilizando dimetil-tiazol-difenil tetrazlio (MTT) e por citometria de fluxo. As 67-72p foram extradas da superfcie da amostra toxignica C. diphtheriae subsp. mitis CDC-E8392 atravs de processos mecnicos e precipitao com sulfato de amnio saturado. Anlises por SDS-PAGE e immunoblotting detectaram a presena das bandas proticas de 67 e 72kDa nas amostras toxinognicas e atoxinognicas analisadas, as quais pertenciam aos biotipos fermentador e no fermentador de sacarose. C. diphtheriae foi capazes no s de formar agregados na presena de plasma de coelho, mas tambm de converter Fbn em fibrina independentemente da presena do gene tox. No entanto, a amostra atoxinognica ATCC 27010 (tox-) foi menos aderente ao Fbn do que a homloga ATCC 27012 (tox+). A interao bacteriana com eritrcitos foi inibida somente pela Fn. Ligaes entre Fn e/ou Fbn com 67-72p foram demonstradas por dot blotting, ELISA e/ou ensaios utilizando fluorescncia. As 67-72p foram capazes de inibir as interaes bacterianas com o Fbn, indicando que 67-72p podem participar do processo de aderncia do patgeno aos tecidos do hospedeiro. Atravs da microscopia ptica, demonstrou-se a ligao de 67-72p adsorvidas em microesferas de ltex com clulas HEp-2. Anticorpos de coelho do tipo IgG anti 67-72p interferiram somente com a expresso do padro de aderncia do tipo difuso, normalmente apresentado pela amostra CDC-E8392. A Microscopia Eletrnica de Transmisso (MET) e a inibio da internalizao bacteriana pela IgG anti 67-72p ou por 67-72p indicaram o papel de 67-72p como invasina. Alteraes do citoesqueleto de clulas HEp-2 com acumulao de actina polimerizada, induzida por microesferas sensibilizadas com 67-72p, foi observada pelo fluorescent actin staining (FAS) test. Foi visualizado um aumento no nmero de bactrias viveis no compartimento intracelular aps tratamento de clulas HEp-2 ou dos microrganismos com Fn. A presena de partculas de ltex adsorvidas com 67-72p no interior de vacolos frouxos em clulas HEp-2 sugeriu que estas protenas podem causar efeito citotxico. A avaliao atravs das coloraes com Azul de Tripan, DAPI e os ensaios de reduo utilizando MTT demonstraram um decrscimo na viabilidade de clulas tratadas com 67-72p. As mudanas morfolgicas observadas 3 horas aps o incio do tratamento com 67-72p incluram vacuolizao, fragmentao nuclear e formao de corpsculos apoptticos. A citometria de fluxo revelou um decrscimo de 15,13% no volume/tamanho de clulas tratadas com 67-72p. Alm disso, o ensaio utilizando Iodeto de Propdio (IP) e Anexina V (AV)-FITIC demonstrou que havia 66,1% de clulas vivas (IP-/AV-), 16,6% de clulas em apoptose inicial (IP-/AV+) e 13,8% de clulas em apoptose tardia ou necrose secundria. Em concluso, as 67-72p esto diretamente envolvidas na interao com Fn e Fbn. As protenas no fimbriais 67-72p so hemaglutininas implicadas na aderncia a clulas respiratrias e na internalizao. Alm disso, estas protenas podem atuar como fatores de virulência em potencial para induzir apoptose de clulas epiteliais nos estgios iniciais da difteria e nas infeces invasivas causadas pelo C. diphtheriae
Resumo:
A difteria uma sndrome toxmica causada pelo Corynebacterium diphtheriae. Embora programas de imunizao mantenham a doena sob controle em pases desenvolvidos, a difteria ainda permanece endmica em diversas partes do mundo, especialmente em indivduos parcialmente imunizados para toxina diftrica. Junto a isso, nos ltimos 20 anos, tem-se observado a ocorrncia crescente de quadros de infeces sistmicas causados por cepas atoxinognicas. A penicilina e eritromicina so as principais drogas de escolha no tratamento destas infeces, entretanto, a escassez de trabalhos reavaliando a terapia de escolha e a influncia dos antibiticos no processo de interao bacteriana com clulas epiteliais humanas so escassos, logo compreendem aspectos que justificam o presente estudo. O objetivo principal deste projeto consiste na anlise da influncia do pr-tratamento de clulas epiteliais Hep-2 com os antimicrobianos penicilina e eritromicina na colonizao e viabilidade intracelular de amostras de C. diphtheriae. As monocamadas foram submetidas ao tratamento prvio com doses sricas teraputicas de penicilina (5g mL1) e eritromicina (1,92 g mL1) por 24 horas e os antibiticos foram removidos por lavagens com PBS antes da interao com a suspenso bacteriana (MOI de 107). Trs horas aps a infeco, o padro de aderncia foi investigado como tambm, realizada a anlise das bactrias viveis associadas e internalizadas nas monocamadas. O pr-tratamento com penicilina induziu a formao de perfil de aderncia difuso (AD) pelas amostras estudadas. Microorganismos que normalmente apresentam padro de aderncia localizado (AL) passaram a expressar perfil (AD) aps pr-tratamento das camadas com ambos antimicrobianos. A expresso do tipo agregativo (AA) no foi influenciada pela presena de eritromicina. A penicilina e a eritromicina reduziram o nmero de bactrias viveis associadas s clulas HEp-2 na maioria das oportunidades. Entretanto, a penicilina interferiu em maior magnitude nesse processo. As trs amostras invasoras de C. diphtheriae (HC01, HC04 e BR5015), apresentaram maior capacidade de sobrevivncia no compartimento intracelular, independente do pr-tratamento. A expresso dos perfis de aderncia assim como a capacidade de sobrevivncia no compartimento intracelular frente aos antimicrobianos testados mostraram-se independentes da produo de toxina e dos percentuais de associao com as clulas HEp-2. Foi observada uma maior eficincia da eritromicina na eliminao de bactrias viveis internalizadas reforando a utilizao clnica da eritromicina tanto no tratamento de pacientes quanto na erradicao do estado de portador. Novos estudos sero desenvolvidos para investigar alteraes na expresso de fatores de virulência por amostras de C. diphtheriae na interao com clulas HEp-2 pr-tratadas com antimicrobianos e a influncia sobre a evoluo clnica das infeces por corinebactrias
Resumo:
A difteria uma doena imunoprevinvel que permanece endmica em diversas regies do mundo. Alm dos casos de difteria clssica, doenas invasivas como endocardite, osteomielite, pneumonia e infeces relacionadas cateter, tem acometido indivduos adultos parcialmente imunizados. A natureza multifatorial dos fatores de virulência que favorecem a formao de biofilme e sobrevivncia em macrfagos tem sido evidenciada para o Corynebacterium diphtheriae. Entretanto, escassos so os trabalhos que investigaram a influncia de condies ambientais na virulência do patgeno. Uma vez que agentes oxidantes so capazes de gerar radicais livres e levar ao estresse oxidativo que, consequentemente, podem resultar em resposta adaptativa e influenciar na formao do biofilme e na virulência bacteriana, o presente trabalho teve como objetivo geral avaliar os efeitos do perxido de hidrognio (H2O2), paraquate e telurito de potssio (K2TeO3) em propriedades biolgicas de cepas de C. diphtheriae de origens diversas. Os resultados demonstraram que as amostras de C. diphtheriae apresentaram nveis de resistncia ao K2TeO3, H2O2 e paraquate, porm em intensidades variadas e independentes da capacidade de produo da toxina diftrica. Algumas amostras, toxinognicas ou no, isoladas do trato respiratrio superior demonstraram resposta adaptativa para H2O2 passando, portanto, a expressar resistncia aumentada aps uma prvia exposio ao referido agente oxidante. C. diphtheriae no exibiu respostas adaptativas para o K2TeO3 e paraquate. C. diphtheriae foi capaz de produzir biofilme na superfcie de substratos abiticos de natureza hidroflica (vidro) e hidrofbica (poliestireno) na presena de agentes oxidantes K2TeO3, H2O2 e paraquate. A presena dos agentes oxidantes influenciou na formao de biofilme de algumas amostras. O paraquate inibiu a produo de biofilme de todas amostras. A amostra TR241 teve a produao de biofilme inibida na presena dos trs agentes oxidantes analisados. Por outro lado, a presena de H2O2 e do K2TeO3 estimulou a produo de biofilme de algumas amostras. Para todas as amostras de C. diphtheriae testadas, independentes das origens, biotipos e da capacidade de produo de toxina diftrica, os ensaios moleculares indicaram a presena de sequncias gnicas cromossmicas homlogas, codificadores da protena DIP 0906 (TeR) e da protena DIP 1421 (OxyR), envolvidos na resistncia ao telurito e na proteo contra o estresse oxidativo, respectivamente. No foi observada correlao da suscetibilidade e a resposta adaptativa aos agentes oxidantes com as diferentes caractersticas bacterianas: origem, stio de isolamento, produo de toxina diftrica, metabolizao de sacarose e produo de biofilme. Em concluso, o estresse oxidativo foi capaz de influenciar fatores de virulência do C. diphtheriae, como a capacidade de produao de biofilme, que podem estar contribuindo para a patogenia da difteria clssica assim como de doenas invasivas causadas por cepas atoxinognicas.
