Neurosubstancias en larvas de parasitos digeneos : posible implicación en la regulación neuroendocrina y en la relación huesped-parasito

Tesis (Doctorado en Ciencias con Especialidad en Morfología) UANL.

Análise da variabilidade imunológica e da expressão dos genes FREPs entre as espécies Biomphalaria glabrata e B. straminea com diferentes perfis de suscetibilidade ao parasito Schistosoma mansoni

Algumas espécies do gênero Biomphalaria se apresentam como potenciais hospedeiras ao parasito Schistosoma mansoni, estando a suscetibilidade a este parasito, neste gênero, ligada ao sistema interno de defesa de cada espécie de Biomphalaria. Um dos componentes importantes no sistema imune de invertebrados é a enzima fenoloxidase, que ainda apresenta muitos aspectos desconhecidos no sistema de defesa do gênero Biomphalaria. Foi relatado também que os genes de proteínas relacionadas ao fibrinogênio (FREPs) possuem importância na resposta imune de Biomphalaria glabrata, entre esses, as subfamílias dos FREPs 3 e 4 são diferencialmente expressas em linhagens susceptíveis e resistentes frente a infecção com trematódeos. No entanto os trabalhos existentes em sua maioria estudam a espécie Biomphalaria glabrata, excluindo a espécie Biomphalaria straminea, amplamente distribuída no Brasil e principal responsável pela disseminação da esquistossomose. Tendo em vista a falta de conhecimento sobre a resposta imune destes moluscos hospedeiros, principalmente em relação à expressão de genes imune relevantes e ao tipo de resposta, o presente trabalho se propôs a estudar a variação do número de hemócitos, da produção de fenoloxidase e da expressão dos genes dos FREP 3 e FREP 4 envolvidos com a ligação a antígenos de trematódeos, nas espécies Biomphalaria glabrata, Biomphalaria straminea pós-infecção com S. mansoni, bem como em caramujos pré-expostos a antígenos de S. mansoni. Para isso, os caramujos de cada espécie foram divididos em 2 grupos: pré-expostos e não expostos a antígenos de S. mansoni. Esses grupos foram divididos em sadios e infectados com a cepa LE de S. mansoni. Em B. glabrata não houve alteração no número de hemócitos, porém B. straminea mostrou uma queda após duas horas de infecção. A atividade da fenoloxidase variou após a sensibilização na espécie menos susceptível (B. straminea) e não variou em B. glabrata, também foi identificado que os hemócitos produtores da fenoloxidase são os granulócitos e hialinócitos. Quanto à expressão dos genes, o FREP 3 e 4 apresentaram níveis basais de expressão aumentados após a sensibilização, com perfil de expressão diferente entre as espécies estudadas. Esses resultados confirmam que a resposta imune varia em diversos aspectos entre as espécies do gênero Biomphalaria, e que nas espécies estudadas a enzima fenoloxidase não parece ter o mesmo papel que no sistema de defesa de insetos, diferindo apenas após a sensibilização, que tem influência na expressão dos genes imuno relevantes do FREPs

Soroprevalência da infecção pelo Trypanosoma cruzi no município de Caicó, RN, e caracterização genética por RAPD do parasito isolado de humanos e de triatomíneos no semiárido potiguar

Trypanosoma cruzi infection was evaluated in 390 resident individuals in different rural communities of Caicó municipality, State of Rio Grande do Norte (RN). Of 28 investigated communities the soroprevalence of T. cruzi infection was 2.8% in eight rural communities individuals. The epidemiological characteristics of seropositive shown that the age ranged from 22 to 64 years, being significantly raised from 31 years (90.9%). The female gender was predominant and low education degree. Those individuals reported that they never donated blood, but they had direct contact with triatomines bug. The isolation of the parasite was performed by blood culture and xenoculture methods to determine the genetic variability of the samples. Twenty seven T. cruzi isolates were analyzed by RAPD as genetic marker using three random primers (M13-40, gt11-F and L15996). The T. cruzi isolates showed 73.7% of shared bands considering the average obtained with the three primers, and were genetically well correlated. Using this marker it was possible to separate the populations of the parasite in three distinct groups. The first group composed by isolates obtained of triatomines and humans from four different districts (Caicó, Caraúbas, Serra Negra doNorte and Governador Dix-Sept Rosado); the second contained isolates obtained of triatomines of two different species (T. brasiliensis and P. lutzi) captured in Caraúbas and Serra Negra do Norte. The third grouped isolates obtained from humans of Angicos and Caicó municipalities. In different localities of distinct mesoregions, State of RN, a profile genetic well correlated was identified among all isolates and the presence of three distinct groups of the parasite circulating among vertebrate and invertebrate hosts

Nota sobre a biologia de "Microdon tigrinus" (Diptera: Syrphidae), parasito social de "Acromyrmex coronatus" (Hymenoptera: Formicidae)

The fly of the syrphid Microdon tigrinus is a specific social parasite of leaf-cutting ant, Acromyrmex coronatus. Six colonies of Acromyrmex coronatus were collected in plastic containers, which there was a layer of 1 cm of plaster, with the purpose of maintaining the humidity of fungus culture. Larvae of social parasite were separate for the establishment of instars number, through morphometric study. The data were measured of 165 larvae, using spiracle (length (Ls), width (Ws) and distance between spiracle (Ds)). After that, the morphometric data obtained for the larvae were submitted to cluster analysis by Wong's hybrid method, which produces the adequate number of groups through pseudo F-statistics and pseudo t-squared statistics. The three morphometric variables studied permitted grouping of larvae into the following three distinct groups: cluster 1 [long dash] consisting of 55 larvae (Ls=0.177[plus or minus]0.026, Ws=0.163[plus or minus]0.030, Ds=0.052[plus or minus]0.008 mm); cluster 2 - consisting of 20 larvae (Ls=0.631[plus or minus]0.065, Ws=0.630[plus or minus]0.049, Ds=0.065[plus or minus]0.018 mm); cluster 3 - consisting of 90 larvae (Ls=1.294[plus or minus]0.062, Ws=1.308[plus or minus]0.069, Ds=0.140[plus or minus]0.018 mm). of the all couples, only 1 obtained success in the mating, and the female, after 24 hours, began the oviposition. The female layed 76 eggs in a period of 6 days, after that, her death. The larvae emerged in the seventh day (incubation period [plus or minus] 7 days). From 76 eggs, 54 were viable, with a viability of 71.05%. This study contributes to the knowledge of Microdon tigrinus biology of, a social parasite poorly studied in Brazil.

Método estimativo para amostragem quantitativa de Rondonia rondoni (Nematoda: Atractidae) parasito de peixes

O objetivo deste trabalho foi avaliar o número de Rondonia rondoni no intestino de Piaractus mesopotamicus, por meio da diferença entre peso úmido e peso seco das amostras de parasitos para cada hospedeiro, a partir da relação do peso seco e número de parasitos pré-estabelecida. Amostras totais de R. rondoni, de 37 espécimes de Piaractus mesopotamicus, foram medidas para obtenção do peso úmido, desidratadas em estufa com temperatura entre 55ºC e 60ºC e, após 24 h seu peso seco foi determinado. Por meio de uma regra de três simples, calculou-se o número de parasitos a partir da diferença entre o peso úmido e o peso seco, considerando um erro padrão médio de 6,027 para um número médio de 1010 indivíduos, quantificado em ensaio prévio. A equação da regressão linear estimada foi de y = 13,138x - 162,01 e r² = 0,9989, a qual foi significativa (p < 0,01), sendo y o número de parasitos e x o peso seco. A normalidade dos dados foi verificada com o teste de Kolmogorov-Smirnov significativo para p < 0,01.

O papel das imunidades nas relações parasito-hospedeiro: o carrapato Rhipicephalus (Boophilus ) microplus e bovinos resistentes ou susceptíveis

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Avaliação da resposta de anticorpos contra antígenos de Plasmodium vivax relacionada a fatores genéticos do parasito e do hospedeiro humano

Pós-graduação em Genética - IBILCE

Análise taxonômica e molecular de Cestoda nematotaeniidae parasito de intestino delgado de Rhinella marina (Linnaeus, 1758) (Amphibia: Bufonidae) de Belém-Pa

Os anfíbios da espécie Rhinella marina também conhecidos como Sapo-Cururu e possuem distribuição mundial. Possuem hábitos noturnos, e devido a sua alimentação bem diversificada vivem em diferentes habitats. Assim podem estar parasitados com uma variedade de helmintos. Dentre os helmintos, os cestodas são o objeto de estudo deste trabalho. Os membros da Família Nematotaennidae são comumente encontrados parasitando o intestino delgado de anfíbios e répteis. O presente trabalho tem como objetivo identificar e caracterizar morfologicamente e molecularmente um cestoda parasito de R. marina da cidade de Belém-PA. Para isso vinte hospedeiros foram capturados em domicílios da região metropolitana de Belém-PA e, após necropsia, os cestoda foram retirados do intestino delgado, alguns exemplares foram fixados em A.F.A, alguns fixados em Glutaraldeído a 2% em tampão cacodilato, e outros em álcool absoluto para serem processados para diferentes técnicas. Parte da amostra foi desidratada em uma série etanólica, corados com Carmin®, clarificados com Salicilato de Metila®. Alguns exemplares foram desidratados e incluídos em parafina para realização de cortes transversais e longitudinais. Os exemplares fixados em glutaraldeído foram desidratados e incluídos em Historesina®. Os cestoda também foram processados para microscopia Eletrônica de Varredura. A identificação foi realizada por meio de desenhos realizados no microscópio Olympus BX 41 com câmara clara, fotografias feitas em microscópio MEDILUX, com sistema de captura de imagem e MEV. Os Cortes histológicos longitudinais foram fotografados e com o Software RECONSTRUCTTM foi realizada a reconstrução tridimensional do corpo do parasito. Helmintos fixados em álcool absoluto foram submetidos a extração de DNA, amplificação gênica pela técnica de PCR e seqüenciamento de nucleotídeos. Os cestoda possuem um corpo cilíndrico, filiforme e indistintamente segmentado, exceto na porção posterior. Escólice com quatro ventosas sem rostéolo ou órgão apical, os proglotes grávidos apresentam duas cápsulas piriformes, que se fundem na base, contendo os ovos. A partir das observações por microscopia eletrônica e luz dos cestoda encontrados no intestino delgado de R. marina, observou-se que estes cestoda pertencem à Família Nematotaeniidae, no entanto os outros caracteres morfológicos e moleculares por nós encontrados não encaixam este cestóide em nenhum gênero desta Família.

Manipulação gênica do protozoário Neospora caninum como ferramenta para o estudo das interações parasito-hospedeiro

Neospora caninum is an obligate intracellular parasite classified in the phylum Apicomplexa, characterized by the presence of the apical complex composed by micronemes proteins, rhoptries and dense granules, used by parasite during the adhesion and invasion process of the host cell. This is the mean event in infection pathogenesis generated by N. caninum and other parasites from the phylum Apicomplexa, promoting influence in the parasite biology and the interface between the parasite and its host. Therefore, molecular tools have been developed in order to identify and characterize these possible virulence factors. Thus, the present study sought to establish a specific system of genetic manipulation of N. caninum, searching for the improvement of the genetics manipulation of this parasite. So, we developed genetically depleted N. caninum to Rop9 rhoptry using the pU6-Universal CRISPR-Cas9 plasmid of T. gondii modified by the insertion of Ku80. The Rop9 depleted parasite showed important during initial phase of invasion and replication of the parasite, however it was not characterized as a potential virulence fator for N. caninum. Furthermore, T. gondii proteins were expressed in N. caninum by the use of specific vectors for this parasite, showing an heterologous system for the study of Toxoplasma proteins, due to the fact that Gra15 or Gra24 of type II T. gondii and Rop16 of type I T. gondii were expressed in N. caninum tachyzoites in a stable way and keept its biological phenotype, as already presented the former parasite, that naturaly expresses these proteins. In addition, it was observed that N. caninum induced an inflammasome activation through NLRP3, ASC and Caspase-1. IL-1R/MyD88 demonstrated an indirect pathway in the control of parasite replication. Furthermore, it was observed that this activation is dependent of the potassium efflux and that different strains of N. caninum keep this activation profile. However, T. gondii strains block this activation, making necessary a prior signal in order to active the inflamosome pathway. Type I T. gondii Rop16 was identified as responsible for blocking this activation, in a dependent way to the STAT3 activation. Therefore, the development of molecular tools and their application in N. caninum may prove to be useful to identify and characterize virulent factors involved in the pathogenesis by these two protozoans.

Infestación de parásitos gastrointestinales en bovinos de la Upe Santos López al final de la época lluviosa

El presente trabajo se realizó en el periodo comprendido de octubre a noviembre de 1988, con el objetivo de investigar la infestación de parásitos gastrointestinales de la masa bovina de la upé santos López a finales de la época lluviosa. Se muestrearon 100 bovino distribuidos en las distintas categorías. Las muestras fueron extraídas directamente del recto del animal, luego refrigerada a 5c, y fueron analizadas en el laboratorio. Se empleó la técnica de dilución con solución salina saturada y para el conteo de huevos, la técnica de Marc-master. Los huevos fueron identificados mediante comparación morfológica con fotografía. Se hizo un análisis de varianza y la prueba de separación de medias según Tucker. El orden de prevalencia e incidencia de los géneros de parasito gastrointestinales encontrados fue el siguiente: hasmonchus spp., cesophogostomun spp., strongyloides spp., nevascaris spp., trichostrangulus spp. Y trichuris spp. La más alta concentración de huevos encontrados entre todos los generos y las categorías fue para el género hasmonchus spp. Los niveles de infestación clínicamente fueron de moderadas para ternero (as) y de leve para adultos en el hato estudiado.

Efecto de diferentes períodos de aplicación tempranos de Chlorpyrifos (Lorsban) en maíz sobre depredadores y parasitos de cogollero Spodoptera frugiperda (Lep: Noctuidae)

De los granos básicos en Nicaragua, el Maíz representa el 45% del área sembrada y es por así decirlo uno de los principales alimentos de la dieta alimenticia de lo9s Nicaragüenses. Sin embargo la producción aún no evoluciona paralela en el orden de los 4 500.000 quintales al año. Esta situación motiva importaciones que en 1983 fueron de 40.000 toneladas métricas (%0) situación debida a que la siembra continua en forma tradicional en altos porcentajes, ò sometida a manejo inadecuado por parte de los productores pero en especial al daño que nos causan las enfermedades y plagas especialmente el cogollero /Spodoptera Frugiperda)) obteniéndose en la mayoría de los casos rendimientos por debajo del punto de equilibrio para conseguir rentabilidad (20). El gusano cogollero (spodoptera frugiperda) es la principal plaga del maíz, la larva desarrollada de alimenta de las hojas dentro del cogollo causando una disminución en el gran foliar de la planta y afectando así la producción hasta en un 52% (23). El daño causado por spodoptera frugiperda se puede acentuar más por el mal uso de producto químico ya que con excesiva aplicaciones inducimos resistencia a la plaga, esto incide a una intoxicación del medio ambiente, afectación del agro ecosistema, los costó de producción se elevan ya que son productos caros y tienen que ser importado. Cuando se hacen estas aplicaciones no se toma en cuenta que con ello eliminamos la fauna benéfica la cual nos ayudaría a ejercer un control sobre la plaga si los químicos fueran aplicados de una forma más racional y se pudiera conservar dicha fauna benéfica, actuando ambos en combinación. Las condiciones excesivas aplicaciones no siempre han proporcionados el control duradero de plagas que se esperaba y frecuentemente han conducido al aumento en el uso de los pesticidas y el incremento de los problema de residuos en los producto y en el suelo. Estos resultados junto con el alarmante desarrollo de resistencia de las plagas a los productos químicos, han estimulado el interés en el diseño de programa en que los pesticidas trabajan en forma armónica con los agentes biológicos que intervienen en la disminución del incremento de las plagas. Mediante la combinación de las características ventajosas de los métodos de control químico y biológico por ejemplo, se reduce la plaga, causando el mínimo disturbio de la actividad del enemigo natural, por lo que puede lograrse una mayor permanencia en la superficie de la plaga (5) Muchos de los experimento iniciales para promover un balance favorable entre las plagas y sus enemigos naturales después del uso del pesticida, han sido llevados a cabo por entomólogos con intereses parciales en el control biológicos . el exitoso desarrollo de los programa de control químico y de control biológico integrados demandan la conciliación de esos puntos de vista, tanto como se requiera la combinación del conocimiento de la evaluación del enemigo natural y la toxicidad del pesticida. A pesar de que el control integral es muchos más que la unión de las técnicas biológicas y químicos para combate de las plagas , la mayor parte de los proyectos de este tipo tienen que estructuraras tomando muy en cuenta la acción de los plaguicidas , que se vayan a emplear, ya que este es el elemento de los programa fitosanitarios que más trastorno crea al agraecosistema. (3,27) Con este estudio se pretende tratar de comprobar la hipótesis de que aplicaciones de insecticidas quimico ( chilorpyrifos lorsban) afectan a poblaciones de parásitos y depredadores de cogollero( spodoptera frugiperda). De esta forma se puede contribuir a la reafirmación de la necesidad del uso del control biológico y disminuir así el uso indiscriminado de esto producto, para no afectar en gran medida al control ejercido por la fauna benéfica. Sustracción y formulación de hipótesis 1) parásitos Aplicaciones de chierpyricos (lograban) en diferente periodo no tienen ningún efecto sobre parasito de cogollero (spodoptera frugiperda). _ aplicaciones de chlorpyrifos (lograban) en diferente periodo de cogollero (spodoptera frugiperda). 2) depredadores - aplicaciones de chlorpyrifos (lograban) en diferente parásitos no tienen ningún efecto sobre depredadores de cogollero (spedeprera frugiperda) - aplicaciones de chlorpyrifos (lograban) en diferente periodos tienen efecto sobre depredadores de cogollero (spedeprera frugiperda).

Estudo da expressão e participação de osteopontina durante a interação taquizoíto de Toxoplasma gondii célula hospedeira.

Toxoplasma gondii é um parasito do filo Apicomplexa que infecta uma grande variedade de hospedeiros, incluindo os humanos. O parasito invade a célula hospedeira por penetração ativa, com a participação das proteínas de suas organelas secretoras durante esse processo. Até o momento, somente um número limitado de proteínas secretoras tem sido descoberto, além disso, as moléculas efetoras envolvidas na invasão e sobrevivência do parasito não estão completamente compreendidas. A osteopontina (OPN) é uma glicofosfoproteína adesiva secretada, multifuncional, que contém o domínio arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) de ligação à integrina, que está envolvida em uma variedade de eventos fisiológicos e patológicos, incluindo sinalização e sobrevivência celular. Pela primeira vez, nós demonstramos pelas técnicas de imunofluorescência e imunocitoquímica ultraestrutural que há uma intensa marcação para uma proteína OPN-like nos grânulos densos de taquizoítos de T. gondii extracelulares. O western blotting e o RT-PRC confirmaram a expressão de OPN-like nos taquizoítos. Nossos resultados também mostram que após a invasão dos macrófagos, a proteína OPN-like está localizada na membrana do vacúolo parasitóforo. Esses dados sugerem que os grânulos densos secretam uma proteína OPN-like, e nós podemos especular que essa proteína participa durante o processo de interação do parasito com as células hospedeiras. .

A atividade da pterocarpanoquinona LQB 118 in vitro e in vivo em Leishmania braziliensis

As leishmanioses estão entre as mais importantes endemias brasileiras e encontram-se entre as doenças mais negligenciadas no mundo. O arsenal terapêutico disponível é restrito, tóxico, caro e em algumas situações ineficazes, devido ao surgimento de cepas resistentes do parasito. No Brasil são registrados anualmente mais de 20 mil casos de leishmaniose tegumentar e a Leishmania braziliensis é a principal espécie causadora das formas clínicas cutânea e mucosa. Portanto tornam-se importantes estudos que conduzam ao desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade da pterocarpanoquinona denominada LQB118 sobre Leishmania braziliensis in vitro e in vivo usando hamsters como modelo experimental. O efeito antiparasitário foi avaliado sobre o crescimento in vitro das formas promastigotas e sobre amastigotas intracelulares em macrófagos peritoneais de camundongos. Para avaliar o modo ação in vitro foi investigada a indução de apoptose usando marcação por TUNEL e Anexina V-FITC. O efeito sobre a modulação da ativação de macrófagos murinos foi analisada pela dosagem de óxido nítrico (reagente de Griess) e de citocinas IL-12, TNF-alfa e IL-10 (por ELISA) nos sobrenadantes de macrófagos. In vivo a atividade terapêutica da LQB 118 foi estudada em grupos de hamsters infectados com L.braziliensis na pata, tratados com a LQB118 pelas vias intralesional (100M/3x/semana) ou oral (0,5mg/5x/semana) após 7 dias de infecção durante oito semanas. A ação terapêutica foi analisada através do tamanho da lesão. A resposta imune foi avaliada durante o tratamento, pela resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) ao antígeno total de L. braziliensis. A ação da LQB118 in vitro foi dose-dependente tanto na forma promastigota inibindo 45%, 64,7% e 99,95%, quanto nas amastigotas intracelulares 22%, 72% e 81% nas concentrações de 5M, 10M e 20M, respectivamente para ambas as formas evolutivas. A LQB118 foi capaz de induzir a externalização de fosfatidilserina em promastigotas (18,57% das células incubadas por 24 h e em 25,79% de células tratadas por 48h) e também promoveu aumento da fluorescência nas duas formas evolutivas da Leishmania quando comparadas aos controles, demonstrando a indução de fragmentação do DNA do parasito. Esta substância também foi capaz de modular a resposta dos macrófagos infectados por 24 horas aumentando de forma dose-dependente a IL-12 e NO, mantendo constante TNF-α. In vivo, na sétima semana de tratamento, observamos uma redução significativa do tamanho das lesões nos animais tratados com LQB 118 intralesional (p<0, 001) e no grupo tratado pela via oral (p<0,05) quando comparado com o controle. Estes resultados demonstram que a atividade anti-Leishmania da LQB118 é direta sobre o parasito pela indução de morte por apoptose, apresentando também uma ação moduladora da resposta dos macrófagos contribuindo para ação leishmanicida, sem alterar a morfologia da célula hospedeira e que a LQB 118 apresenta uma atividade terapêutica no modelo hamster e pode ser uma importante molécula para o desenvolvimento de um novo fármaco.

Análise de uma heme oxigenase funcional em Trypanosoma cruzi

O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, transmitida através de insetos vetores triatomíneos durante a alimentação no hospedeiro vertebrado. Os triatomíneos ingerem numa única alimentação cerca de 10 mM de heme ligado à hemoglobina. O heme é uma importante molécula no metabolismo dos organismos. Um mecanismo intracelular importante no controle de sua homeostase é a degradação enzimática pela Heme Oxigenase (HO) formando biliverdina (Bv), monóxido de carbono e ferro. Como esta enzima não está presente no genoma de T. cruzi, esse trabalho tem por objetivo identificar uma atividade funcional de HO neste parasito, uma vez que dados do nosso laboratório mostram a presença de biliverdina nas incubações dessas células com heme. No presente trabalho testamos o efeito do SnPPIX (inibidor da HO-1), CoPPIX (indutor da HO-1) e Bv sobre a proliferação da forma epimastigota do parasito. A adição de SnPPIX diminuiu a proliferação do parasito na tanto na ausência quanto na presença de heme. Quando a Bv foi adicionada à cultura esse efeito foi revertido; a Bv aumenta a proliferação celular na presença de heme. Por outro lado, a adição de CoPPIX não interferiu na proliferação. Posteriormente, mostramos através da técnica de immunoblotting, utilizando anticorpo monoclonal contra a HO-1, um aumento da expressão de uma proteína em resposta ao heme. Diferentemente das HO-1 já descritas que possuem massa molecular de 32 kDa, a única banda reconhecida pelo anticorpo apresenta 45 kDa. Analisamos também a expressão da HO-1 na presença de CoPPIX, SnPPIX e biliverdina, e somente o CoPPIX foi capaz de modular os níveis de expressão da HO-1. A análise estrutural através da técnica de imunocitoquímica mostrou uma maior expressão da enzima na presença de heme, e que a HO-1 de T. cruzi pode ter mais de uma localização, apresentando marcação citoplasmática e glicossomal. A fim de investigar a sequência da HO-1 de T. cruzi, o DNA genômico foi extraído para amplificação por PCR do gene da HO-1 utilizando oligonucleotídeos desenhados no genoma de T. cruzi. Os dois pares de oligonucleotídeos utilizados nao foram capazes de amplificar uma sequência equivalente a uma HO. Em seguida, utilizamos a técnica de imunoprecipitação, seguida de immunoblotting, com anticorpo anti-HO-1, com objetivo de concentrar a proteína alvo, e observamos um aumento significativo do imunocomplexo nas células tratadas com heme 300 mM, cerca de 2 vezes em relação ao controle. Dando seguimento à tentativa de identificação da HO-1 de T. cruzi, utilizamos a técnica de espectrometria de massa a partir de eletroforese unidimensional, que mostrou uma grande alteração do perfil protéico na presença de heme, mas futuros experimentos são necessários, como eletroforese 2D, para a identificação da proteína alvo

Avaliação da heterogeneidade molecular de Cryptosporidium sp. em amostras clínicas

O Cryptosporidium é um parasito coccídeo reconhecido por causar diarréia em humanos e animais em todo o mundo. O gênero compreende pelo menos 20 espécies confirmadas, sendo o C. hominis e C. parvum as principais espécies causadoras de criptosporidiose em humanos. Ferramentas moleculares têm sido desenvolvidas para detectar e diferenciar espécies/genótipos e subgenótipos de Cryptosporidium. O objetivo do trabalho foi avaliar a heterogeidade molecular de Cryptosporidium sp. obtidos de amostras clínicas provenientes dos municípios do Rio de Janeiro e de Salvador, através da PCR em tempo real e seqüenciamento automático. Foram analisadas 85 amostras, distribuídas em 3 grupos distintos, sendo 45 delas do município do Rio de Janeiro e 40 amostras provenientes de Salvador, Bahia. Todas as amostras foram positivas para Cryptosporidium sp. pelo método de coloração de Kinyoun a frio. O ensaio da PCR em tempo real combinou uma reação multiplex para a detecção do gênero Cryptosporidium e da espécie C. parvum e uma reação simples para a detecção de C. hominis. Na detecção do gênero Cryptosporidium foram utilizados par de primers e uma sonda TaqMan desenhados a partir do alinhamento de seqüências conservadas do gene 18S rRNA de várias espécies de Cryptosporidium disponíveis no GenBank. Para a detecção das espécies C. parvum e C. hominis foram utilizados primers e sondas específicos obtidos a partir de seqüências de cada espécie disponíveis no GenBank. A detecção do gênero Cryptosporidium através da sonda 18S rRNA, na reação duplex, foi visualizada em 63 de 85 amostras totais. Destas, a sonda TaqMan específica para C. parvum detectou 6 amostras e a sonda TaqMan específica para C. hominis detectou 42 amostras. Quinze amostras não puderam ser detectadas pelas sondas C. hominis ou C. parvum. Nos ensaios da PCR para o gene 18S, 31 amostras foram positivas e 27 delas sequenciadas. As análises filogenéticas confirmaram a presença de C. hominis, C. parvum e C. felis nas amostras estudadas. Na análise da topologia da árvore filogenética obtida por Neighbor Joining, observou-se-se que as sequências obtidas neste estudo se agruparam com espécies do gênero Cryptosporidium já descritas, com 99% ou 100% de similaridade. Conclui-se que os dois métodos utilizados são importantes ferramentas para o diagnóstico da criptosporidiose e diferenciação de C. hominis e C. parvum em investigações epidemiológicas, assim como avaliação da heterogeneidade molecular de Cryptosporidium sp