Suscetibilidade de microorganismos relacionados com a contaminação de alimentos em biofilme artificial e em suspensão frente a desinfetantes

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Cultura de tecidos desdiferenciados e embriões somáticos de Petiveria alliacea L. visando à produção de substâncias bioativas

Petiveria alliacea L. pertence à família Phytolaccacceae e é conhecida popularmente como guiné ou amansa-senhor, entre outros nomes. Tem sido muito utilizada na medicina popular como agente terapêutico, devido à diversas propriedades farmacológicas. Estudos fitoquímicos têm contribuído para a descoberta de grande variedade de substâncias biologicamente ativas produzidas em diferentes partes da planta (saponinas, alcalóides, flavonóides, sulfetos, taninos, cumarinas, entre outros). A análise química da raiz tem revelado grande quantidade de derivados sulfurados, principalmente o dibenzil trissulfeto (DTS), com atividade antifúngica, antibacteriana, antioxidante e anticancerígena. Visando avaliar a produção biotecnológica do DTS, o presente trabalho teve como objetivo, otimizar a cultura de novas linhagens de calos, células em suspensão e embriões somáticos, a partir de plantas de P. alliacea L. mantidas in vitro, com o monitoramento da capacidade biossintética das culturas. Os resultados mostraram que a produção de calos friáveis foi possível em explantes foliares inoculados em meio MS suplementado com PIC ou 2,4-D. Além da resposta calogênica, foi observada a produção de estruturas globulares caracterizadas como embriões somáticos. A ocorrência de embriogênese somática direta foi confirmada através da análise histológica do processo regenerativo. A indução de embriões somáticos gerou um processo de embriogênese secundária altamente repetitivo até 150 dias de cultura e conversão a plantas em freqüência de 5%. Em relação à cultura de células em suspensão a partir dos calos friáveis, observou-se uma diminuição do crescimento celular ao longo das subculturas. As culturas em suspensão originadas de tecido embriogênico secundário continuaram o processo repetitivo em meio líquido e apresentaram conversão a plantas em taxas mais baixas que as obtidas em meio sólido. A obtenção de plantas completas a partir dos embriões somáticos demonstrou a possibilidade de utilização desse sistema para a micropropagação dessa espécie. O monitoramento fitoquímico dos sistemas de cultura in vitro e plantas de campo mantidas em casa de vegetação durante 02 anos apresentou diferenças significativas, confirmando que a cultura de tecidos pode alterar as rotas metabólicas. A cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas realizada com extrato em diclorometano de embriões secos e hexânico de embriões frescos e raízes secas de plantas provenientes de embriões somáticos, demonstrou a presença do DTS, constituindo, portanto, sistemas in vitro importantes para a modulação desta substância.

Produção de carotenoides em culturas in vitro de Cleome rosea Vahl ex DC (Capparaceae) e avaliação de sua toxicidade e potencial antioxidante

A produção e a otimização de substâncias de valor medicinal têm sido alcançadas pelo uso das técnicas de cultura de tecidos vegetais, que têm apresentado grande relevância quando se considera o status de conservação de uma espécie ou sua ocorrência em ambientes ameaçados. No presente trabalho foi avaliada a produção de carotenoides em culturas de calos e células em suspensão de Cleome rosea Vahl ex DC, espécie nativa encontrada em áreas de restinga nos estados do Rio de Janeiro e de São Paulo. Plantas micropropagadas obtidas a partir de raízes produzidas in vitro foram usadas como fonte de explantes para o início das culturas de calos. A produção de massa calogênica foi avaliada em meio MS suplementado com diferentes concentrações das auxinas ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ácido 4-amino- 3,5,6-tricloropicolínico, na presença de luz ou no escuro. O uso de diferentes meios básicos de cultura (B5, Nitsch, White) também foi avaliado. A calogênese foi induzida em todos os tratamentos, entretanto a maior produção de biomassa foi alcançada pelas culturas mantidas na presença de luz. A maior produção de massa calogênica foi obtida em culturas iniciadas no meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D. A exposição das culturas à luz foi um fator essencial para a produção de carotenoides, que só ocorreu nas culturas mantidas nessa condição. Culturas de calos foram submetidas a tratamentos com substâncias elicitoras (extrato de levedura, metil jasmonato, quitosana) em diferentes concentrações e por um período de exposição de sete ou 14 dias visando otimizar a produção do pigmento. A maior produção de carotenoides nas culturas elicitadas foi alcançada com o tratamento com metil jasmonato (MJ) na concentração de 300 μM, independentemente do tempo de exposição ao elicitor. Análises cromatográficas mostraram que o processo de elicitação com MJ induziu ao aumento na produção de β-caroteno. Calos elicitados nessa condição foram usados para iniciar culturas de células em suspensão (CCS). Estas culturas foram acompanhadas por três subculturas realizadas a cada 20 dias, durante a fase exponencial de crescimento. Embora as CCS tenham mantido uma produção de biomassa constante ao longo das subculturas, os valores de produção de carotenoides foram inferiores àqueles alcançados pelas culturas de calos e não houve diferenças estatísticas significativas quando comparadas às CCS iniciadas a partir de calos não elicitados. Extratos de calos produzidos em meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D foram avaliados quanto à sua capacidade antioxidante por meio da incubação dos extratos com DNA plasmidial em presença de cloreto estanoso (SnCl2), um potente agente redutor capaz de produzir quebras na molécula de DNA. Os extratos foram avaliados em concentrações crescentes (25 - 500 μg.mL-1) e apresentaram uma proteção dose dependente à ação do SnCl2. Estudos de toxicidade com o modelo de Artemia salina demonstraram que os extratos não apresentaram toxicidade nas concentrações avaliadas. Os resultados alcançados mostram que a elicitação foi eficiente para a otimização da produção de β-caroteno nas culturas in vitro e que os extratos obtidos a partir desses materiais apresentaram atividade antioxidante, indicando o êxito das técnicas de cultura de tecidos para a produção deste metabólito sob condição in vitro.

Cultura de tecidos e análise do potencial antioxidante de Passiflora alata Curtis

Passiflora alata Curtis, comumente conhecida como maracujá-doce, é uma das espécies do gênero Passiflora cultivadas comercialmente, sendo consumida in natura devido ao seu gosto adocicado. Ela também é utilizada em todo o mundo como ornamental e na medicina popular. O objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de diferentes estratégias para a cultura in vitro de P. alata e a análise da produção de substâncias antioxidantes nos materiais obtidos in vitro, em comparação com as plantas in vivo. Diferentes tratamentos visando à quebra da dormência das sementes foram avaliados para a germinação in vitro ou in vivo, além da incubação das sementes sob tipos distintos de luz. Para o estabelecimento das culturas primárias, apices caulinares e segmentos nodais das plântulas derivadas da germinação in vitro foram cultivados em meio MSM . A taxa de alongamento dos brotos e o número de nós por brotos das culturas primárias foram aumentados pela adição de água de coco ao meio. Plantas derivadas dessas culturas foram utilizadas como fontes de explantes nodais, internodais e foliares. O potencial morfogênico de sementes sem tegumento foi também avaliado. Calos friáveis foram induzidos a partir de segmentos nodais e foliares na presença de PIC, e aqueles obtidos a partir de folhas em meio suplementado com PIC a 28,9 μM foram selecionados para o estabelecimento de culturas de células em suspensão. Após o desenvolvimento de diferentes estratégias in vitro para P. alata, folhas de plantas in vivo foram utilizadas para a avaliação de parâmetros que afetam a extração de substâncias antioxidante. O potencial antioxidante foi determinado pelo ensaio DPPH e o conteúdo de fenóis totais foi determinado utilizando o método Folin-Ciocalteau. Após o desenvolvimento do protocolo de extração, a atividade antioxidante dos diferentes materiais in vitro foi também avaliada. A eficiência antirradicalar variou entre os sistemas de cultura estudados, sendo diretamente proporcional ao conteúdo de fenóis totais dos extratos. Esses resultados indicam que as estratégias para cultura in vitro de P. alata desenvolvidas neste trabalho representam alternativas para a multiplicação de plantas e produção de substâncias fenólicas com ação antioxidante.

Avaliação do potencial leishmanicida e antibacteriano de Annona mucosa (Jacq.) - Annonaceae cultivada in vitro e in vivo

A biodiversidade brasileira abrange plantas de importância medicinal que podem ser utilizadas na formulação de novos fármacos. Contudo, tem sido reduzida em velocidade alarmante, em função de diferentes ações antrópicas. A cultura de tecidos vegetais propicia a conservação e uso do germoplasma permitindo a obtenção de substâncias de importância medicinal. As leishmanioses são consideradas um problema de saúde pública mundial sendo a espécie Leishmania braziliensis de maior importância epidemiológica no Brasil. Recentemente tem-se registrado aumento da resistência à linha de tratamento usual. Do mesmo modo, o uso indiscriminado de antibióticos levou ao aumento de bactérias multirresistentes, que representam sério risco de infecção. A espécie Annona mucosa (Jacq.) possui substâncias, como acetogeninas e alcaloides, que apresentam atividades antiparasitária e antimicrobiana. Nesse sentido, o objetivo do trabalho foi avaliar o potencial leishmanicida e antibacteriano de extratos de A. mucosa de material produzido in vitro e in vivo. Foi proposto um protocolo de germinação in vitro, ainda não reportada para a espécie, com vistas à obtenção de plântulas axênicas. Em meio WPM foram cultivados explantes hipocotiledonares e foliares em meio MS, suplementados com PIC e diferentes concentrações de KIN, BAP ou TDZ. Os calos obtidos foram cultivados em meio líquido de mesma composição para a produção de suspensões celulares. Os materiais foram submetidos à extração metanólica e posterior fracionamento em hexano e diclorometano. Para a avaliação da atividade dos extratos sobre L. braziliensis foi usado o modelo in vitro, com a forma promastigota, e in vivo na forma amastigota, a partir do tratamento de macrófagos peritoneais de camundongos infectados com o parasito. Ambas as formas foram tratadas com os extratos por 96 e 48h, respectivamente. A atividade antimicrobiana foi avaliada por macrodiluição do extrato em Mueller-Hinton, sendo avaliado o crescimento das cepas após 16h de incubação a 48C. A germinação in vitro da espécie foi alcançada em substrato vermiculita estéril umedecido com solução de sais do meio MS, com taxa média de 85%. A maior produção de calos friáveis foi obtida em meios contendo KIN, com potencial uso para cultivo em suspensões celulares. Os extratos do material in situ e in vitro apresentaram atividade leishmanicida, apesar da toxicidade para macrófagos. Culturas de células em suspensão apresentaram potencial leishmanicida in vitro e redução da infecção em macrófagos. Os extratos do material avaliado apresentaram atividade antimicrobiana seletiva, com inibição do crescimento de Streptococcus pyogenes e Bacillus thurigiensis em diferentes concentrações avaliadas. Os métodos biotecnológicos empregados permitiram a obtenção de materiais com propriedades medicinais para as atividades leishmanicida e antibacteriana, assim como o material in vivo, constituindo este estudo o primeiro relato para as atividades propostas em A. mucosa.

Produção in vitro, análise fitoquímica e avaliação da atividade antineoplásica de metabólitos de Hovenia dulcis Thunb. (Rhamnaceae) obtidos por diferentes estratégias biotecnológicas

Hovenia dulcis Thunberg, natural da Ásia Oriental, é cultivada no Brasil onde é conhecida como uva-do-japão. A espécie possui várias indicações na medicina popular e alguns estudos apontam o seu potencial antineoplásico, tripanocida e hepatoprotetor. Metabólitos secundários são substâncias não essenciais para a sobrevivência celular, mas que fornecem vantagens adaptativas aos vegetais, sendo atribuído, para algumas delas, atividades biológicas importantes. Substâncias de interesse medicinal têm sido obtidas por técnicas da cultura de tecidos vegetais, como a calogênese e a cultura de células em suspensão, que permitem a síntese de matéria-prima de forma contínua e homogênea, independentemente de fatores ambientais e sazonais. O presente estudo objetivou o estabelecimento de culturas in vitro de H. dulcis, visando à produção de metabólitos de interesse, com vistas à avaliação do seu potencial antineoplásico sobre células K562. Foram testados protocolos para o estabelecimento de diferentes sistemas, como culturas de calos, de células em suspensão (CCS) e compact callus clusters (CCC) e ainda a avaliação do uso de elicitores na otimização de metabólitos produzidos in vitro. Foi verificado que a adição dos fitorreguladores KIN e TDZ, substituindo o BAP, não foi capaz de induzir a formação de calos friáveis, bem como a manutenção das culturas em ausência de luz. O uso do nitrato de prata promoveu a friabilidade de calos em todas as concentrações testadas, considerando-se 2,0 mg.L-1 a melhor concentração. Foram alcançadas taxas de 100% de formação de CCS tanto na presença, quanto em ausência de AgNO3. O maior acúmulo de biomassa foi verificado na concentração mais baixa de PIC (0,625 mg.L-1). A análise dos espectros de RMN indicou a presença de (+)-dihidromiricetina, (+)-galocatequina, hovenitina II, hovenosideo G, hodulosideo III, hodulosideo IV, hodulosideo I e hovenidulciosideo B1 nas culturas de calos friáveis. No estabelecimento de culturas CCC, observou-se a formação de calos compactos verdes em todas as concentrações de ANA testadas. O aumento da velocidade de rotação para 135 rpm aumentou a dispersão das células com consequente formação dos agregados celulares desejados. A seleção de linhagens celulares demonstrou ser um método eficiente na uniformização do tamanho desses agregados e tal uniformidade se manteve estável por mais de cinco subcultivos em 100% das culturas. Uma fração rica em saponinas foi obtida a partir dos agregados celulares, correspondendo a 1,46% da massa seca. A análise por RMN sugeriu a presença das saponinas Hovenosideo G e dos hovenidulciosideos A2 e B2. O uso de elicitores em cultura de calos mostrou-se adequado à produção de metabólitos secundários, sem alterações morfológicas nos mesmos. A elicitação alterou o perfil cromatográfico analisado por HPLC. Na elicitação com 5,0 mg.L-1 de extrato de levedura foi verificado um aumento de quase três vezes (12,280 3,396 equivalentes de quercetina/mg de extrato) na síntese de flavonoides. Finalmente, os estudos de ação antitumoral in vitro demonstraram citotoxicidade dos extratos de calos não elicitados de H. dulcis sobre linhagem de leucemia mieloide crônica (IC50 de 74,05 μg.mL-1.) e inibição do crescimento de tais células (K562), sugerindo o potencial antineoplásico para um produto biotecnológio (calo) desta espécie.

Metodologia e aplicação da citometria de fluxo na hematologia veterinária

A citometria de fluxo é um método emergente na medicina veterinária que permite a identificação e quantificação de células em suspensão. Apesar do custo elevado e da necessidade de técnicos especializados para realização da avaliação citofluorométrica, esta técnica tem uma ampla aplicação na hematologia veterinária, incluindo a avaliação de células-tronco hematopoiéticas, eritrócitos, leucócitos e plaquetas. O grande potencial de aplicação clínica da citometria de fluxo inclui a quantificação das células CD34+ como indicação da capacidade de reconstituição hematopoiética após o transplante de células-tronco e das subpopulações linfocitárias para avaliação da resposta imune frente aos transplantes e às doenças que acometem os animais. Projetos científicos sobre a avaliação citofluorométrica das células-tronco e subpopulações linfocitárias de cães têm sido desenvolvidos com sucesso por pesquisadores da área de hematologia veterinária na Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de Jaboticabal. Portanto, no futuro, a citometria de fluxo deve se tornar uma técnica de rotina em laboratórios veterinários no Brasil.

Poliaminas na embriogênese somática em cenoura (Daucus carota L.)

As poliaminas, putrescina (put), espermidina (spd) e espermina (spm) são amplamente distribuídas na natureza, desempenhando importante papel em vários eventos celulares. Considerando que as poliaminas estão envolvidas no processo embriogênico, torna-se importante conhecer as bases para estas alterações no metabolismo. O objetivo do presente trabalho foi observar os teores de poliaminas durante as diferentes fases da embriogênese somátka da cenoura. As análises foram realizadas, através da modificação do método de Flores e Galston a cada 96 horas durante 50 dias da cultura de células em suspensão. As células foram obtidas a partir de calos e inoculadas em meio de Murashige & Skoog (MS), modificado e acrescido de 0,2 mg/l de 2,4-D e 0,1 mg/l de cinetina durante os primeiros 14 dias da cultura, sendo que no restante do período permaneceram em meio MS desprovido de fiorreguladores. Os teores de poliaminas oscilaram durante todo o processo embriogênico, sendo que a putrescina foi a que apresentou maior acúmulo. Estes resultados sugerem que os níveis de espermidina e espermina são reduzidos em relação a putrescina devido a intensa utilização da spd e spm no processo de divisão e diferenciação celular, enquanto que a put parece ter apenas a função de sintetizar as outras duas amidas.

Antioxidative responses of cell suspension cultures of two Coffea arabica varieties to low aluminum levels at pH 5.8

The effects of aluminum (Al) on the activities of antioxidant enzymes and ferritin expression were studied in cell suspension cultures of two varieties of Coffea arabica, Mundo Novo and Icatu, in medium with pH at 5.8. The cells were incubated with 300 µM Al3+, and the Al speciation as Al3+ was 1.45% of the mole fraction. The activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione S-transferase (GST) were increased in Mundo Novo, whereas glutathione reductase (GR) and guaiacol peroxidase (GPOX) activities remained unchanged. SOD, GR, and GST activities were increased in Icatu, while CAT activity was not changed, and GPOX activity decreased. The expression of two ferritin genes (CaFer1 and CaFer2) were analyzed by Real-Time PCR. Al caused a downregulation of CaFER1 expression and no changes of CaFER2 expression in both varieties. The Western blot showed no alteration in ferritin protein levels in Mundo Novo and a decrease in Icatu. The differential enzymes responses indicate that the response to Al is variety-dependent.

Avaliação de oleuropeína e de sanitizantes químicos, isolados ou associados, para eliminação de biofilmes de Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes e Escherichia coli em superfícies inertes

Este estudo avaliou a eficiência da oleuropeína (OLE) (composto fenólico extraído das folhas de Oliveira) isolada e associada aos sanitizantes comerciais ácido peracético 2% (APA), hipoclorito de sódio 2% (HS), peróxido de hidrogênio 3% (PH), digluconato de clorexidina 2% (DC), cloreto de benzalcônio 1% (CB) e iodofor 2% (IO), para inativação de células em suspensão e biofilmes monoespécie e multiespécie formados em superfícies de aço inoxidável ou microplaca de poliestireno por Listeria monocytogenes (ATCC 7644), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Escherichia coli (ATCC 25922), todas classificadas como fortes produtores de biofilmes. Os isolados foram semeados em caldo TSB (caldo tripticase soja), incubados (37°C/24h) e corrigidos a ~108células/mL (escala 0,5 McFarland). Para bactérias em suspensão, a resistência a sanitizantes foi determinada pela Concentração Inibitória Mínima (CIM) em tubos e pelo método de Disco Difusão em Ágar (DDA), no qual as bactérias foram plaqueadas em ágar TSA contendo discos de 6mm de papel filtro embebidos nos sanitizantes. Após a incubação, a medição dos halos de inibição foi feita com paquímetro. Para os ensaios de resistência dos biofilmes aos compostos sanitizantes, foram utilizadas microplacas de poliestireno 96 poços, as quais foram preparadas para incubação-fixação dos biofilmes e submetidas à leitura em espectrofotômetro de ELISA (600 nm). Em seguida, as placas foram lavadas com solução salina tamponada (PBS, pH 7.4) e os sanitizantes inseridos por 1 minuto. Após neutralização com tiossulfato de sódio (5 minutos), as placas foram lavadas com PBS e metanol, coradas com cristal violeta 1% e coradas com ácido acético glacial (33%) para nova leitura a 570nm. A eficácia da remoção do biofilme pelos sanitizantes foi comparada pelo índice de formação de biofilme (IFB). As imagens do aço inoxidável após tratamento com sanitizante foram feitas através de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Microscopia Confocal, para visualizar a persistência dos biofilmes. Os valores de CIM (diluição 1:2) mostraram que OLE não teve atividade bactericida. No método DDA, L. monocytogenes, foi resistente à OLE, enquanto E. coli e S. aureus apresentaram resistência intermediária. Os sanitizantes comerciais apresentaram boa atividade bactericida nos ensaios de CIM e DDA, sendo que as associações de OLE aos sanitizantes comerciais aumentaram o efeito germicida. Nos ensaios com biofilmes em monoespécie, somente os sanitizantes comerciais, isolados ou associados com OLE, foram eficazes de reduzir o valor de BFI em microplaca de poliestireno. Em biofilmes multiespécie, OLE apresentou efeito antimicrobiano, sobretudo sobre a associação de L. monocytogenes + E. coli + S. aureus (redução: 91,49%). Nenhum dos compostos avaliados foi capaz de inativar completamente os biofilmes nas superfícies de aço inoxidável, uma vez que células viáveis foram observadas após os tratamentos com os sanitizantes, indicando persistência dos biofilmes. Os resultados indicam que a oleuropeína apresentou potencial para incrementar o efeito bactericida de sanitizantes comerciais para eliminação de biofilmes em superfícies inertes, sendo necessários estudos para compreender os mecanismos de ação dessas combinações.

Purificação, modelagem e simulação da adsorção de bioprodutos por troca iônica em coluna de leito expandido

A produção de proteínas através de microrganismos tornou-se uma técnica muito importante na obtenção de compostos de interesse da indústria farmacêutica e alimentícia. Extratos brutos nos quais as proteínas são obtidas são geralmente complexos, contendo sólidos e células em suspensão. Usualmente, para uso industrial destes compostos, é necessário obtê-los puros, para garantir a sua atuação sem interferência. Um método que vem recebendo destaque especialmente nos últimos 10 anos é o uso da cromatografia de troca iônica em leito expandido, que combina em uma única etapa os passos de clarificação, concentração e purificação da molécula alvo, reduzindo assim o tempo de operação e também os custos com equipamentos para realização de cada etapa em separado. Combinado a este fato, a última década também é marcada por trabalhos que tratam da modelagem matemática do processo de adsorção de proteínas em resinas. Está técnica, além de fornecer informações importantes sobre o processo de adsorção, também é de grande valia na otimização da etapa de adsorção, uma vez que permite que simulações sejam feitas, sem a necessidade de gasto de tempo e material com experimentos em bancada, especialmente se é desejado uma ampliação de escala. Dessa forma, o objetivo desta tese foi realizar a modelagem e simulação do processo de adsorção de bioprodutos em um caldo bruto na presença de células, usando inulinase e C-ficocianina como objeto de estudo e purificar C-ficocianina utilizando resina de troca iônica em leito expandido. A presente tese foi então dividida em quatro artigos. O primeiro artigo teve como objeto de estudo a enzima inulinase, e a otimização da etapa de adsorção desta enzima em resina de troca iônica Streamline SP, em leito expandido, foi feita através da modelagem matemática e simulação das curvas de ruptura em três diferentes graus de expansão (GE). As máximas eficiências foram observadas quando utilizadas maiores concentrações de inulinase (120 a 170 U/mL), e altura de leito entre 20 e 30 cm. O grau de expansão de 3,0 vezes foi considerado o melhor, uma vez que a produtividade foi consideravelmente superior. O segundo artigo apresenta o estudo das condições de adsorção de C-ficocianina em resina de troca iônica, onde foi verificado o efeito do pH e temperatura na adsorção e após construída a isoterma de adsorção. A isoterma de adsorção da C-ficocianina em resina Streamline Q XL feita em pH 7,5 e a 25°C (ambiente), apresentou um bom ajuste ao modelo de Langmuir (R=0,98) e os valores qm (capacidade máxima de adsorção) e Kd (constante de equilíbrio) estimados pela equação linearizada da isoterma, foram de 26,7 mg/mL e 0,067mg/mL. O terceiro artigo aborda a modelagem do processo de adsorção de extrato não clarificado de C-ficocianina em resina de troca iônica Streamline Q XL em coluna de leito expandido. Três curvas de ruptura foram feitas em diferentes graus de expansão (2,0, 2,5 e 3,0). A condição de adsorção de extrato bruto não clarificado de C-ficocianina que se mostrou mais vantajosa, por apresentar maior capacidade de adsorção, é quando se alimenta o extrato até atingir 10% de saturação da resina, em grau de expansão 2,0, com uma altura inicial de leito de 30 cm. O último artigo originado nesta tese foi sobre a purificação de C-ficocianina através da cromatografia de troca iônica em leito expandido. Uma vez que a adsorção já havia sido estudada no artigo 2, o artigo 4 enfoca na otimização das condições de eluição, visando obter um produto com máxima pureza e recuperação. A pureza é dada pela razão entre a absorbância a 620 nm pela absorbância a 280 nm, e dizse que quando C-ficocianina apresenta pureza superior a 0,7 ela pode ser usada em como corante em alimentos. A avaliação das curvas de contorno indicou que a faixa de trabalho deve ser em pH ao redor de 6,5 e volumes de eluição próximos a 150 mL. Tais condições combinadas a uma etapa de pré-eluição com 0,1M de NaCl, permitiu obter C-ficocianina com pureza de 2,9, concentração 3 mg/mL, e recuperação ao redor de 70%.

Establishment of a protocol for the cryopreservation of cell sheets of adipose tissue stem cells

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016

Caracterização reológica e hidrodinâmica de uma suspensão de células vegetais de Centaurea calcitrapa em reactor biológico

Tese de dout., Ciências Biotecnológicas, Faculdade de Engenharia e de Recursos Naturais, Univ. do Algarve, 2003

Influência de pré-tratamentos de células epiteliais com penicilina e eritromicina na aderência e na viabilidade intracelular de Corynebacterium diphtheriae

A difteria é uma síndrome toxêmica causada pelo Corynebacterium diphtheriae. Embora programas de imunização mantenham a doença sob controle em países desenvolvidos, a difteria ainda permanece endêmica em diversas partes do mundo, especialmente em indivíduos parcialmente imunizados para toxina diftérica. Junto a isso, nos últimos 20 anos, tem-se observado a ocorrência crescente de quadros de infecções sistêmicas causados por cepas atoxinogênicas. A penicilina e eritromicina são as principais drogas de escolha no tratamento destas infecções, entretanto, a escassez de trabalhos reavaliando a terapia de escolha e a influência dos antibióticos no processo de interação bacteriana com células epiteliais humanas são escassos, logo compreendem aspectos que justificam o presente estudo. O objetivo principal deste projeto consiste na análise da influência do pré-tratamento de células epiteliais Hep-2 com os antimicrobianos penicilina e eritromicina na colonização e viabilidade intracelular de amostras de C. diphtheriae. As monocamadas foram submetidas ao tratamento prévio com doses séricas terapêuticas de penicilina (5g mL1) e eritromicina (1,92 g mL1) por 24 horas e os antibióticos foram removidos por lavagens com PBS antes da interação com a suspensão bacteriana (MOI de 107). Três horas após a infecção, o padrão de aderência foi investigado como também, realizada a análise das bactérias viáveis associadas e internalizadas nas monocamadas. O pré-tratamento com penicilina induziu a formação de perfil de aderência difuso (AD) pelas amostras estudadas. Microorganismos que normalmente apresentam padrão de aderência localizado (AL) passaram a expressar perfil (AD) após pré-tratamento das camadas com ambos antimicrobianos. A expressão do tipo agregativo (AA) não foi influenciada pela presença de eritromicina. A penicilina e a eritromicina reduziram o número de bactérias viáveis associadas às células HEp-2 na maioria das oportunidades. Entretanto, a penicilina interferiu em maior magnitude nesse processo. As três amostras invasoras de C. diphtheriae (HC01, HC04 e BR5015), apresentaram maior capacidade de sobrevivência no compartimento intracelular, independente do pré-tratamento. A expressão dos perfis de aderência assim como a capacidade de sobrevivência no compartimento intracelular frente aos antimicrobianos testados mostraram-se independentes da produção de toxina e dos percentuais de associação com as células HEp-2. Foi observada uma maior eficiência da eritromicina na eliminação de bactérias viáveis internalizadas reforçando a utilização clínica da eritromicina tanto no tratamento de pacientes quanto na erradicação do estado de portador. Novos estudos serão desenvolvidos para investigar alterações na expressão de fatores de virulência por amostras de C. diphtheriae na interação com células HEp-2 pré-tratadas com antimicrobianos e a influência sobre a evolução clínica das infecções por corinebactérias

Efeito das células do cumulus e cisteamina durante o cultivo de maturação in vitro de oócitos bovinos sobre a maturação nuclear e aquisição da competência para desenvolvimento embrionário

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)