Optimization of ultrasound-assisted extraction to obtain mycosterols from Agaricus bisporus L. by response surface methodology and comparison with conventional Soxhlet extraction

Ergosterol, a molecule with high commercial value, is the most abundant mycosterol in Agaricus bisporus L. To replace common conventional extraction techniques (e.g. Soxhlet), the present study reports the optimal ultrasound-assisted extraction conditions for ergosterol. After preliminary tests, the results showed that solvents, time and ultrasound power altered the extraction efficiency. Using response surface methodology, models were developed to investigate the favourable experimental conditions that maximize the extraction efficiency. All statistical criteria demonstrated the validity of the proposed models. Overall, ultrasound-assisted extraction with ethanol at 375 W during 15 min proved to be as efficient as the Soxhlet extraction, yielding 671.5 ± 0.5mg ergosterol/100 g dw. However, with n-hexane extracts with higher purity (mg ergosterol/g extract) were obtained. Finally, it was proposed for the removal of the saponification step, which simplifies the extraction process and makes it more feasible for its industrial transference.

Obtenção de extratos de agaricus bisporus com ergosterol para incorporação em iogurtes e procedimentos de microencapsulação

Além de ser o cogumelo mais consumido no mundo, Agaricus bisporus é um dos cogumelos mais ricos em ergosterol, representando esta molécula quase 90% da sua fração de esteróis. Vários estudos têm atribuído ao ergosterol diferentes bioatividades, incluindo efeitos hipocolesterolémicos semelhantes aos exibidos pelos fitoesteróis. Isto torna o ergosterol uma molécula interessante para ser estudada como composto nutracêutico. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial de utilização dos extratos de A. bisporus ricos em ergosterol na produção de bebidas lácteas funcionais. Para o efeito, foram realizados testes de incorporação do extrato e do ergosterol puro em iogurtes que se compararam com bebidas lácteas funcionais comerciais (aditivadas com fitoesteróis). As amostras de A. bisporus foram submetidas a uma extração assistida por ultrassons e os extratos obtidos (IEXT), bem como a molécula de ergosterol em diferentes concentrações (IERG1 e IERG2), foram incorporados em iogurtes, e comparadas com amostras controlo (amostras de iogurte sem aditivos) (ICN) e iogurtes comerciais contendo fitoesteróis (ICP). Todas as amostras foram analisadas imediatamente após a incorporação (T0), e após sete dias de armazenagem a 4°C (T1), em relação aos parâmetros nutricionais, atividade antioxidante e propriedades citotóxicas em linhas celulares tumorais humanas e numa cultura primária de células de fígado de porco (não tumoral) para avaliação da toxicidade. O teor de ergosterol incorporado na forma pura, ou presente nos extratos, foi monitorizado por HPLC-UV. Adicionalmente, foi realizado um estudo de microencapsulação utilizando a técnica de coacervação, tendo o quitosano e o isolado proteico de soro como materiais encapsulantes. Num ensaio preliminar determinou-se o pH conducente a um maior rendimento de encapsulação e, seguidamente, verificou-se a influência da razão proteína:quitosano (P/Q) e da temperatura utilizada, no rendimento de encapsulação (Y1), na eficiência de encapsulação (Y2) e na carga (teor de ergosterol nas microesferas) (Y3). Posteriormente, o estudo foi realizado baseando-se nas melhores condições para encapsular ergosterol, sendo também avaliadas as respostas Y1, Y2 e Y3. Além de ser o cogumelo mais consumido no mundo, Agaricus bisporus é um dos cogumelos mais ricos em ergosterol, representando esta molécula quase 90% da sua fração de esteróis. Vários estudos têm atribuído ao ergosterol diferentes bioatividades, incluindo efeitos hipocolesterolémicos semelhantes aos exibidos pelos fitoesteróis. Isto torna o ergosterol uma molécula interessante para ser estudada como composto nutracêutico. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial de utilização dos extratos de A. bisporus ricos em ergosterol na produção de bebidas lácteas funcionais. Para o efeito, foram realizados testes de incorporação do extrato e do ergosterol puro em iogurtes que se compararam com bebidas lácteas funcionais comerciais (aditivadas com fitoesteróis). As amostras de A. bisporus foram submetidas a uma extração assistida por ultrassons e os extratos obtidos (IEXT), bem como a molécula de ergosterol em diferentes concentrações (IERG1 e IERG2), foram incorporados em iogurtes, e comparadas com amostras controlo (amostras de iogurte sem aditivos) (ICN) e iogurtes comerciais contendo fitoesteróis (ICP). Todas as amostras foram analisadas imediatamente após a incorporação (T0), e após sete dias de armazenagem a 4°C (T1), em relação aos parâmetros nutricionais, atividade antioxidante e propriedades citotóxicas em linhas celulares tumorais humanas e numa cultura primária de células de fígado de porco (não tumoral) para avaliação da toxicidade. O teor de ergosterol incorporado na forma pura, ou presente nos extratos, foi monitorizado por HPLC-UV. Adicionalmente, foi realizado um estudo de microencapsulação utilizando a técnica de coacervação, tendo o quitosano e o isolado proteico de soro como materiais encapsulantes. Num ensaio preliminar determinou-se o pH conducente a um maior rendimento de encapsulação e, seguidamente, verificou-se a influência da razão proteína:quitosano (P/Q) e da temperatura utilizada, no rendimento de encapsulação (Y1), na eficiência de encapsulação (Y2) e na carga (teor de ergosterol nas microesferas) (Y3). Posteriormente, o estudo foi realizado baseando-se nas melhores condições para encapsular ergosterol, sendo também avaliadas as respostas Y1, Y2 e Y3. As bebidas funcionalizadas com o extrato (IEXT) e com ergosterol na mesma concentração existente no extrato (IERG1) revelaram uma atividade antioxidante similar às bebidas comerciais com fitoesteróis. No entanto, as bebidas com ergosterol na mesma concentração do extrato de A. bisporus e de fitoesteróis (IERG2) revelaram uma atividade antioxidante superior. Além disso, apenas IEXT, IERG1 e IERG2 apresentaram um aumento na atividade antioxidante de T0 para T1, com destaque para a atividade exibida por IERG2, significando que o ergosterol e os extratos foram capazes de proteger a bebida láctea da oxidação, aumentando a vida de prateleira do produto. IERG2 foi a amostra que revelou a maior citotoxicidade para as linhas celulares tumorais, enquanto as bebidas com fitoesteróis mostraram a menor atividade, sem diferenças significativas entre T0 e T1. Os estudos de microencapsulação revelaram ainda que a técnica de coacervação permite obter cápsulas de distintos tamanhos e que as condições ótimas do processo ocorrem a pH 5,5, com temperatura de 55ºC e razão P/Q de 0,5, com um menor rendimento de encapsulação, mas com uma maior carga em ergosterol. Este trabalho contribuiu para o estudo do potencial da utilização de extratos de A. bisporus com ergosterol no desenvolvimento de novas bebidas funcionais. Constituiu um primeiro passo que necessita de estudos subsequentes relacionados com a avaliação da viabilidade da sua utilização ao nível industrial e demonstração clara da sua bioatividade in vivo.

Extraction and detection of mycotoxins in medicinal and aromatic plants: a case study with Aloysia citrodora P.

Plants frequently suffer contaminations by toxigenic fungi, and their mycotoxins can be produced throughout growth, harvest, drying and storage periods. The objective of this work was to validate a method for detection of toxins in medicinal and aromatic plants, through a fast and highly sensitive method, optimizing the joint co-extraction of aflatoxins (AF: AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2) and ochratoxin A (OTA) by using Aloysia citrodora P. (lemon verbena) as a case study. For optimization purposes, samples were spiked (n=3) with standard solutions of a mix of the four AFs and OTA at 10 ng/g for AFB1, AFG1 and OTA, and at 6 ng/g of AFB2 and AFG2. Several extraction procedures were tested: i) ultrasound-assisted extraction in sodium chloride and methanol/water (80:20, v/v) [(OTA+AFs)1]; ii) maceration in methanol/1% NaHCO3 (70:30, v/v) [(OTA+AFs)2]; iii) maceration in methanol/1% NaHCO3 (70:30, v/v) (OTA1); and iv) maceration in sodium chloride and methanol/water (80:20, v/v) (AF1). AF and OTA were purified using the mycotoxin-specific immunoaffinity columns AflaTest WB and OchraTest WB (VICAM), respectively. Separation was performed with a Merck Chromolith Performance C18 column (100 x 4.6 mm) by reverse-phase HPLC coupled to a fluorescence detector (FLD) and a photochemical derivatization system (for AF). The recoveries obtained from the spiked samples showed that the single-extraction methods (OTA1 and AF1) performed better than co-extraction methods. For in-house validation of the selected methods OTA1 and AF1, recovery and precision were determined (n=6). The recovery of OTA for method OTA1 was 81%, and intermediate precision (RSDint) was 1.1%. The recoveries of AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2 ranged from 64% to 110% for method AF1, with RSDint lower than 5%. Methods OTA1 and AF1 showed precision and recoveries within the legislated values and were found to be suitable for the extraction of OTA and AF for the matrix under study.

Ultrasound and microwave assisted extraction of ergosterol from Agaricus bisporus L.: optimization through response surface methodology

There is scientific evidence demonstrating the benefits of mushrooms ingestion due to their richness in bioactive compounds such as mycosterols, in particular ergosterol [I]. Agaricus bisporus L. is the most consumed mushroom worldwide presenting 90% of ergosterol in its sterol fraction [2]. Thus, it is an interesting matrix to obtain ergosterol, a molecule with a high commercial value. According to literature, ergosterol concentration can vary between 3 to 9 mg per g of dried mushroom. Nowadays, traditional methods such as maceration and Soxhlet extraction are being replaced by emerging methodologies such as ultrasound (UAE) and microwave assisted extraction (MAE) in order to decrease the used solvent amount, extraction time and, of course, increasing the extraction yield [2]. In the present work, A. bisporus was extracted varying several parameters relevant to UAE and MAE: UAE: solvent type (hexane and ethanol), ultrasound amplitude (50 - 100 %) and sonication time (5 min-15 min); MAE: solvent was fixed as ethanol, time (0-20 min), temperature (60-210 •c) and solid-liquid ratio (1-20 g!L). Moreover, in order to decrease the process complexity, the pertinence to apply a saponification step was evaluated. Response surface methodology was applied to generate mathematical models which allow maximizing and optimizing the response variables that influence the extraction of ergosterol. Concerning the UAE, ethanol proved to be the best solvent to achieve higher levels of ergosterol (671.5 ± 0.5 mg/100 g dw, at 75% amplitude for 15 min), once hexane was only able to extract 152.2 ± 0.2 mg/100 g dw, in the same conditions. Nevertheless, the hexane extract showed higher purity (11%) when compared with the ethanol counterpart ( 4% ). Furthermore, in the case of the ethanolic extract, the saponification step increased its purity to 21%, while for the hexane extract the purity was similar; in fact, hexane presents higher selectivity for the lipophilic compounds comparatively with ethanol. Regarding the MAE technique, the results showed that the optimal conditions (19 ± 3 min, 133 ± 12 •c and 1.6 ± 0.5 g!L) allowed higher ergosterol extraction levels (556 ± 26 mg/100 g dw). The values obtained with MAE are close to the ones obtained with conventional Soxhlet extraction (676 ± 3 mg/100 g dw) and UAE. Overall, UAE and MAE proved to he efficient technologies to maximize ergosterol extraction yields.