Generierung und Charakterisierung von rekombinanten Cytomegaloviren mit Punktmutationen in antigenen Peptiden

Die Kontrolle der produktiven Cytomegalovirus- (CMV) Infektion ist von der effizienten Rekonstitution antiviraler CD8 T-Zellen abhängig. Dies führt jedoch nicht zur vollständigen Eliminierung des viralen Genoms aus den Zielorganen, sondern das Virus verbleibt in einem nicht-replikativen Zustand: der Latenz. Es ist bekannt, dass während der Latenz nur ein geringer Anteil latenter mCMV-Genome in der Lunge die Major Immediate Early (MIE) Gene ie1 und ie2 exprimiert, die Latenz aber dennoch bestehen bleibt, weil das differentielle Splicing des primären IE1/3-Transkripts zum Transaktivator-Transkript IE3 nicht erfolgt. Damit war neben der Initiation der IE-Genexpression am MIE-Promotor-Enhancer das IE1/3-Splicing als zweiter molekularer Latenz-Kontrollpunkt identifiziert. Parallel zur Latenz-assoziierten IE1-Genexpression sind in der Lunge aktivierte CD62L-low CD8 T-Zellen mit Spezifität für das immundominante IE1-Peptid 168-YPHFMPTNL-176 angereichert. Dies legte die Hypothese nahe, dass neben der molekularen Kontrolle der Latenz auch eine immunologische Kontrolle, beispielsweise durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen besteht. Zur Evaluierung dieser Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit mittels BAC-Mutagenese erstmals ein rekombinantes mCMV generiert, in dem das IE1-Peptid durch Punktmutation der C-terminalen MHC-Ankeraminosäure L176A zerstört ist. Dazu musste zunächst die Technik der BAC-Mutagenese herpesviraler Genome (in Anlehnung an die publizierten Arbeiten von Messerle et al., 1997; Borst et al., 1999, 2004; Wagner et al., 1999) in der Arbeitsgruppe etabliert werden. Neben der Funktionsverlust-Mutante (mCMV-IE1-L176A) wurden zur Kontrolle zwei Revertanten (mCMV-IE1-A176L und mCMV-IE1-A176L*) generiert. In letzterer, als Wobble-Revertante bezeichnet, wird wieder die authentische MHC-Ankeraminosäure L eingesetzt, es verbleibt aber ein singulärer Nukleotidaustausch A->T in der Wobble-Position des Codons als Marker zur Unterscheidung zum WT-mCMV zurück. Der immunologische Phänotyp der Funktionsverlust-Mutante, also die funktionelle Auslöschung des antigenen IE1-Peptids im Priming einer CD8 T-Zell-Antwort, entsprach der Erwartung. Entsprechend konnte nach Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante keine Reaktivität gegen das IE1-Peptid nachgewiesen werden. In den Revertanten hingegen war die Erkennung des IE1-Peptids wieder hergestellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen weiter, dass die Funktionsverlust-Mutante sowie die Revertanten ohne signifikante Beeinflussung in vitro in permissiven Fibroblasten und in vivo in verschiedenen Geweben replizieren. Wie aktuelle Daten nach Knochenmarktransplantation und Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante im Vergleich zu den Revertanten zeigen, ist die Frequenz Latenz-assoziierter IE1-Transkriptionsereignisse bei der Funktionsverlust-Mutante signifikant erhöht. Damit konnte erstmalig der Beweis für eine Kontrolle der Latenz-assoziierten IE1-Genexpression durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen und damit für eine Präsentation des IE1-Peptids während der Latenz erbracht werden.

Untersuchungen zur posttranslationalen präS-Translokation des großen Hüllproteins des Hepatitis-B-Virus

Untersuchungen zur posttranslationalen präS-Translokation des großen Hüllproteins des Hepatitis-B-Virus. Das große (L) Hüllprotin des Hepatitis-B-Virus (HBV) besitzt die ungewöhnliche Eigenschaft, mittels partieller, posttranslationaler Translokation seiner präS-Domäne durch intrazelluläre Membranen zwei unterschiedliche Transmembrantopologieen auszubilden. Unter Berücksichtigung der Hypothese eines HBV-spezifischen Transmembrankanals, der sich möglicherweise während der Virusmorphogenese bilden und die präS-Translokation ermöglichen könnte, wurden Parameter untersucht, welche die L-Topologie beeinflussen. Dazu wurden Wildtyp-L-Proteine und L-Mutanten in Säugerzellen synthetisiert und deren Topologie mittels Proteaseschutzversuchen untersucht. Ich konnte zeigen, daß alle Faktoren, für die angenommen wurde, daß sie für die Ausbildung einer HBV-spezifischen Pore und die damit verbundene präS-Reorientierung wichtig seien, entbehrlich sind. Im einzelnen konnte nachgewiesen werden, daß die posttranslationale präS-Translokation weder die Helferfunktion der HBV S und M Proteine, noch die kovalente Dimerausbildung der Hüllproteine benötigt. Weiterhin ergaben die Untersuchungen, daß keine der amphipathischen Transmembrandomänen des L-Proteins an der präS-Reorientierung beteiligt ist. Vielmehr wurde die hydrophobe Transmembrandomäne 2 (TM2) als ausreichend und essentiell für diesen Prozeß identifiziert. Zellfraktionierungsstudien ergaben weiterhin, daß die präS-Reorientierung und damit die duale Topologie des L-Proteins innerhalb des Endoplasmatischen Retikulums (ER) herbeigeführt wird. Letztlich konnte eine Interaktion des L-Proteins mit zellulären Chaperonen (Hsc70, Hsp40, BiP) gezeigt werden, was eine Beteiligung dieser Proteine am Translokationsprozeß nahelegt.