Einfluss immunevasiver Strategien des humanen Cytomegalovirus auf die MHC-Klasse-I-Präsentation der viralen Antigene pp65 und IE1

Das Humane Cytomegalovirus (HCMV) stellt eine große Bedrohung für Patienten mit geschwächtem oder unausgereiftem Immunsystem dar. Bei immunkompetenten Personen hingegen werden schwere Erkrankungen insbesondere durch die Wirkung antiviraler zytotoxischer CD8+-T-Lymphozyten (CTL) weitgehend verhindert. Aus Zellkultur-Systemen war bekannt, dass virale Glykoproteine, welche in der US2-US11-Region des HCMV-Genoms kodiert werden, inhibitorisch in den MHC-Klasse-I-Präsentationsweg eingreifen und somit die entsprechende Präsentation durch infizierte Zellen behindern. Über die Bedeutung dieser US2-US11-vermittelten Immunevasion für die Präsentation viraler Antigene im Kontext der Virusinfektion war jedoch nichts bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte daher der Einfluss der Immunevasion auf die MHC-Klasse-I-Präsentation der beiden wichtigsten CTL-Zielstrukturen von HCMV, dem Tegumentprotein pp65 und dem regulatorischen immediate early Protein IE1, untersucht werden. In Ergänzung dazu sollte das immunevasive Potential eines durch HCMV kodierten Homologs des immunmodulatorischen Zytokins Interleukin-10 (cmvIL-10) analysiert werden. Hierzu wurden über Peptidimmunisierung HLA-A2-transgener Mäuse CTL-Klone hergestellt, welche ausgesuchte Peptide aus pp65 und IE1 in Assoziation mit HLA-A2 mit hoher Spezifität und Sensitivität erkannten. Auf diese Weise konnte eine direkte Beeinflussung der MHC-Klasse-I-Präsentation durch cmvIL-10 falsifiziert und somit der Hypothese, dass das von infizierten Zellen freigesetzte Zytokin die MHC-Klasse-I-Präsentation nicht infizierter Nachbarzellen beeinflussen könnte, widersprochen werden. Mit Hilfe einer US2-US11-Deletionsmutante des Virus konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Präsentation von sowohl pp65 als auch IE1 durch die Immunevasion beeinträchtigt wird. Dabei war die Präsentation des IE1-Peptids zu jedem untersuchten Zeitpunkt nach Infektion vollständig unterdrückt. Die Präsentation des pp65-Peptids hingegen war noch bis zu 72 Stunden nach Infektion detektierbar. Diese anhaltende Präsentation wurde dabei durch MHC-Klasse-I-Komplexe hervorgerufen, die trotz der Expression der US2-US11-Region an die Zelloberfläche transportiert wurden. Anhand des pp65 konnte somit erstmals gezeigt werden, dass die Immunevasion von HCMV Bildung und Transport bestimmter MHC-Klasse-I-Peptid-Komplexe zwar beeinträchtigen, jedoch nicht vollständig blockieren kann. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Präsentation von IE1-Peptiden durch das Vorhandensein des pp65-Proteins nicht beeinflusst wurde. Damit konnten aus der Literatur bekannte Daten anderer widerlegt werden. Mit Hilfe einer weiteren Virusmutante konnte schließlich gezeigt werden, das die Expression eines der Immunevasine, des gpUS11, hinreichend ist, die IE1-Präsentation vollständig zu unterdrücken, jedoch keinerlei messbaren Einfluss auf die Präsentation von pp65 ausübt. Die vorliegende Arbeit hat wichtige Erkenntnisse erbracht, die die Grundlage für weiterführende Untersuchungen zur Aufklärung der Bedeutung der einzelnen Immunevasionsgene für die Präsentation viraler Antigene im Rahmen der Virusinfektion darstellen.

Immunevasion des murinen Cytomegalovirus: Regulatoren der MHC-Klasse-I vermittelten Antigenpräsentation

Zu den Immunevasionsmechanismen des murinen Cytomegalovirus, die sich im Laufe der Koevolution von Virus und Wirt entwickelt haben, gehört die Interferenz von drei viralen Regulatoren mit der Antigenpräsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle, wodurch die Aktivierung von zytotoxischen CD8 T-Zellen beeinflusst wird: Während m152/gp40 peptidbeladene MHC-Klasse-I-Komplexe im cis-Golgi-Kompartiment akkumuliert, führt m06/gp48 diese Komplexe der lysosomalen Degradation zu. Im Gegensatz dazu vermittelt m04/gp34 deren Transport an die Zelloberfläche, wurde in der Literatur bisher aber trotzdem als Inhibitor der CD8 T-Zellaktivierung beschrieben. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss dieser viralen Proteine auf die Peptidpräsentation bzw. die T-Zellaktivierung zu untersuchen. Dazu wurde ein Set von Viren verwendet, das neben mCMV-WT aus mCMV-Deletionsmutanten besteht, die jedes der regulatorischen Proteine einzeln bzw. in allen möglichen Kombinationen exprimieren, einschließlich einer Mutante, die keines der Proteine besitzt. Entgegen der bisher gültigen Annahme konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass m04/gp34 die Antigenpräsentation nicht inhibiert. Wird es allein exprimiert, bleibt die T-Zellaktivierung unbeeinflusst. Wird es zusammen mit m152/gp40 exprimiert, stellt es die T-Zellaktivierung wieder her, indem es den herunter regulierenden Effekt von m152/gp40 antagonisiert. Dieser positiv regulierende Effekt von m04/gp34 wird wiederum durch m06/gp48 aufgehoben. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, wie die verschiedenen Effekte dieser Virusproteine in vivo das Überleben im infizierten Wirt steuern. So wird im adoptiven Transfermodell die Infektion mit der Deletionsmutante, die m152/gp40 alleine exprimiert, schlechter kontrolliert als die Infektion mit der m152/gp40 und m04/gp34 exprimierenden Mutante. Dieser die CD8 T-Zellkontrolle verbessernde Effekt von m04/gp34 wird durch m06/gp48 wieder aufgehoben. Dass ein viraler Erreger nicht nur negative Regulatoren der Antigenpräsentation exprimiert, sondern auch einen positiven Regulator, der den Effekt eines negativen Regulators wieder aufhebt, ist in der Literatur beispiellos. Durch differentielle Expression dieser Regulatoren eröffnet sich damit dem Virus die Möglichkeit, die Antigenpräsentation gezielt zu modulieren.

Charakterisierung der Latenz des murinen Cytomegalovirus in vivo

Die primäre, produktive Cytomegalovirus (CMV)-Infektion wird im immunkompetenten Patienten effizient durch antivirale CD8+ T-Zellen kontrolliert. Das virale Genom besitzt jedoch die Fähigkeit, in einem nicht replikativen, Latenz genannten Zustand, in gewissen Zelltypen zu persistieren, ohne dass infektiöse Nachkommenviren produziert werden. Die molekularen Mechanismen, welche der Etablierung und Aufrechterhaltung der Latenz zugrundeliegen, sind noch weitestgehend unbekannt. Es gibt Hinweise darauf, dass zelluläre Verteidigungsmechanismen die Zirkularisierung und Chromatinisierung viraler Genome hervorrufen und dadurch die virale Genexpression größtenteils verhindert wird (Marks & Spector, 1984; Reeves et al., 2006).rnAllerdings liegen die Genome nicht in einem komplett inaktiven Zustand vor. Vielmehr konnte für das murine CMV (mCMV) bereits die sporadische Transkription der Gene ie1 und ie2 während der Latenz nachgewiesen werden (Kurz et al., 1999; Grzimek et al., 2001).rnIn der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal eine umfassende in vivo Latenz-Analyse zur Charakterisierung der viralen Transkription in einer Kinetik anhand der alle drei kinetischen Klassen repräsentierenden Transkripte IE1, IE3, E1, m164, M105 und M86 vorgenommen.rnNach Latenz-Etablierung, verifiziert durch Abwesenheit von infektiösem Virus, konnten alle getesteten Transkripte in der Lunge quantifiziert werden. Interessanterweise war die transkriptionelle Aktivität zu keinem Analyse-Zeitpunkt mit der klassischen IE-E-L-Kinetik der produktiven Infektion kompatibel. Stattdessen lag eine stochastische Transkript-Expression vor, deren Aktivität mit voranschreitender Zeit immer weiter abnahm.rnWährend der Latenz exprimierte Transkripte, die für antigene Peptide kodieren, können infizierte Zellen für das Immunsystem sichtbar machen, was zu einer fortwährenden Restimulation des memory T-Zell-pools führen würde. Durch zeitgleiche Analyse der Transkript-Expression, sowie der Frequenzen Epitop-spezifischer CD8+ T-Zellen während der Latenz (IE1, m164, M105), wurde eine möglicher Zusammenhang zwischen der transkriptionellen Aktivität und der Expansion des memory T-Zell-pools untersucht. Die weitere Charakterisierung von Subpopulationen der Epitop-spezifischen CD8+ T-Zellen identifizierte die SLECs (short-lived-effector cells; CD127low CD62Llow KLRG1high) als die dominante Population in Lunge und Milz während der mCMV-Latenz.rnIn einem weiteren Teil der Arbeit sollte untersucht werden, ob IE-Genexpression zur Etablierung von Latenz notwendig ist. Mit Hilfe der Rekombinanten mCMV-Δie2-DTR, die die Gensequenz des Diphtherietoxin-Rezeptors (DTR) anstelle des Gens ie2 trägt, konnten infizierte, DTR exprimierende Zellen durch eine DT-Applikation konditional depletiert werden.rnIm latent infizierbaren Zelltyp der Leber, den LSECs (liver sinusoidal endothelial cells) wurde die virale Load durch 90-stündige DT–Applikation nach mCMV-Δie2-DTR Infektion auf das Level latent infizierter LSECs reduziert. Diese Daten sprechen für die Hypothese eines von Beginn an inaktiven Genoms, das keine IE-Genexpression zur Latenz-Etablierung benötigt. Zusätzlich stellt dieser Ansatz ein neues Tier-Modell zur Latenz-Etablierung dar. Verringerte Wartezeiten bis zur vollständigen Latenz-Etablierung, im Vergleich zum bisherigen Knochenmarktransplantations-Modell, könnten anfallende Tierhaltungskosten erheblich reduzieren und das Voranschreiten der Forschung beschleunigen.