Funktionelle und strukturelle Charakterisierung des Ovastacins in vivo und in vitro

Die Metalloprotease Ovastacin, ein Vertreter der Astacin-Familie, wurde erstmals 2004 beschrieben. Im Ovar von Säugetieren ist Ovastacin-mRNA im Zeitfenster vom Stadium der Sekundärfollikel bis kurz nach der Befruchtung der Eizelle zu finden. Der Expressionsort und -zeitpunkt sowie die Sequenzähnlichkeit von über 60% mit sogenannten „Schlüpfenzymen“ (engl. hatching enzymes), die man in den Eizellen und Zygoten niederer Wirbeltiere und Wirbelloser gefunden hatte, ließen die Vermutung aufkommen, es könnte sich hier um das Säugerhomolog dieser Proteasen handeln. Generell lösen hatching Enzyme die derben embryonalen Hüllstrukturen (bei Säugern die Zona pellucida, ZP) beim Schlüpfvorgang auf. Die essentielle Bedeutung des Ovastacins für die Befruchtung wird durch die um ca. 30% reduzierte Fruchtbarkeit von Ovastacin defizienten Mäusen belegt. Hochinteressant war in diesem Zusammenhang die Entdeckung des Ovastacins in den Cortikalgranula der Oocyten sowie seine Fähigkeit, das Zona pellucida Protein 2 zu schneiden. Die dadurch bewirkte Verhärtung der Zona pellucida verhindert das Eindringen weiterer Spermien, das heißt sie baut eine Barriere gegen Polyspermie auf. Ziel dieser Arbeit war es, Belege für die physiologische Funktion des Ovastacins zu finden. Vor allem galt es, potentielle Aktivatoren zu identifizieren, da das Enzym wie alle Astacine als inaktive Vorstufe gebildet wird, die proteolytisch aktiviert werden muss. Zu diesem Zweck exprimierte ich rekombinantes Pro-Ovastacin in Insektenzellen. Aktivierungsstudien in vitro zeigten, dass ein saures Milieu zu einer Aktivierung führt, ohne die Abspaltung des Propeptids zu bewirken. Sequenzalignments und ein homologes Strukturmodell des Ovastacins wiesen auf Trypsin- oder Elastase-ähnliche Serinproteasen als potentielle Aktivierungsenzyme hin. Tatsächlich konnte mit diesen beiden Proteasetypen zum ersten Mal aktives Ovastacin aus Pro-Ovastacin erzeugt werden. Trypsin kommt als physiologischer Aktivator allerdings nicht in Betracht, da es bisher in keinem der Gewebe nachgewiesen werden konnte, in dem Ovastacin exprimiert wird. Die neutrophile Elastase dagegen konnte in der Leber, im Herz sowie im Blutplasma nachgewiesen werden. Mit Hilfe spezifischer Antikörper konnte das Herz als Expressionsort für Ovastacin bestätigt werden. Somit wäre Elastase ein potentieller physiologischer Aktivator von Ovastacin. Die Identifikation des Ovastacins in Geweben wie Leber, Herz, Nabelschnur und im Blutplasma weist auf eine Rolle der Protease in proteolytischen Netzwerken außerhalb der Spermien-Ei-Interaktion hin. Die Bedeutung der biologischen Kontrolle des Ovastacins bei der Befruchtung der Säugereizelle wird durch die Beobachtung untermauert, dass das Leberprotein Fetuin B als physiologischer Ovastacininhibitor fungiert und dadurch eine vorzeitige Verhärtung der Zona pellucida verhindert, die andernfalls die Penetration von Spermien prinzipiell verhindern würde.

Synthese, Charakterisierung und Testung von Phenylacrylsäure-Derivaten, Benzothiazolen und Diarylthioethern als potentielle Inhibitoren der Dengue-Virus-Typ-2-NS2B-NS3-Protease

Dengue-Fieber ist eine durch Stechmücken der Gattungen Aedes aegypti und Aedes albopticus übertragene, virale Infektionskrankheit des Menschen, welche eine zunehmende Bedrohung für die Weltbevölkerung darstellt; das Infektionsrisiko betrifft vorwiegend Menschen, die in tropischen und subtropischen Gebieten der Erde (Asien, Afrika, Amerika) leben. Bei dem Erreger handelt es sich um ein Flavivirus, bestehend aus einer positiv polarisierten Einzelstrang-RNA, welches in vier verschiedenen Serotypen existiert. Eine Infektion mit Dengue-Viren zeigt sich durch drei mögliche Krankheitsbilder: Klassisches Dengue-Fieber (DF), hämorrhagisches Dengue-Fieber (DHF) oder Dengue-Schock-Syndrom (DSS). Das Dengue-Virus-Genom codiert eine Serin-Protease mit einer klassischen katalytischen Triade, bestehend aus den Aminosäuren His51, Asp75 und Ser135. Die Funktion der Dengue-Virus-Protease besteht in der post-translationalen, proteolytischen Prozessierung des viralen Polyprotein-Vorläufers, womit sie essentiell für die Virus-Replikation ist und damit einen wichtigen therapeutischen Ansatz für die Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen Dengue-Fieber darstellt. Die Ziele der vorliegenden Arbeit bestanden darin, neue potentielle Inhibitoren der Dengue-Virus Typ 2 NS2B-NS3 Protease (DEN-2 NS2B-NS3pro) zu synthetisieren, deren Hemmwirkung sowie den Inhibitionstyp mithilfe fluorimetrischer Enzym-Assays zu bestimmen, Struktur-Wirkungs-Beziehungen (u.a. mithilfe von Molecular Docking-Rechnungen) zu analysieren und die erhaltenen Leitstrukturen zu optimieren. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Substanzklassen und damit zwei Teilprojekte behandelt: Phenylacrylsäureamide im ersten Teilprojekt, Benzothiazole und Diarylthioether zusammen im zweiten Teilprojekt. Im ersten Teilprojekt zeigten einige Phenylacrylsäureamide eine schwache Hemmung der DEN-2 NS2B-NS3pro zwischen ca. 50 und 61 % bei einer Inhibitorkonzentration von 50 µM sowie eine nicht-kompetitive Hemmung, welche jedoch durch vielfältige Derivatisierung kaum verändert oder verbessert werden konnte. Darüber hinaus wurden die endogenen Serin-Proteasen alpha-Chymotrypsin und Trypsin durch einige Phenylacrylsäureamide erheblich stärker gehemmt als die DEN-2 NS2B-NS3pro. Das zweite Teilprojekt befasste sich mit der Synthese und Testung von Diarylthioethern mit hydroxy-substituierten Benzothiazol-Bausteinen sowie der Testung einiger methoxy-substituierter Synthese-Vorstufen der Endverbindungen, um die Relevanz und den Einfluss der einzelnen Bausteine auf die Hemmung der DEN-2 NS2B-NS3pro zu untersuchen. Der in der vorliegenden Arbeit synthetisierte, potenteste Inhibitor der DEN-2 NS2B-NS3pro (Hemmung: 90 % [50 µM]; IC50 = 3.6 +/- 0.11 µM) und der DEN-3 NS2B-NS3pro (Hemmung: >99 % [100 µM]; IC50 = 9.1 +/- 1.02 µM), SH65, ein Diarylthioether-Benzothiazol-Derivat, entstand aufgrund der Vorhersage zweier möglicher Bindungsmodi (kompetitiv und nicht-kompetitiv) mithilfe von Molecular Docking-Experimenten an der Röntgen-Kristall-struktur der DEN-3 NS2B-NS3pro (PDB-Code: 3U1I). Nach experimenteller Bestimmung der IC50-Werte bei unterschiedlichen Substratkonzentrationen erwies sich SH65 jedoch als nicht-kompetitiver Inhibitor der DEN-2 NS2B-NS3pro. Trypsin wurde von SH65 vergleichbar stark gehemmt (96% [50 µM]; IC50 = 6.27 +/- 0.68 µM) wie die beiden getesteten Dengue-Virus-Proteasen, nicht jedoch alpha-Chymotrypsin (nur 21% Hemmung bei 50 µM), wodurch diesem Inhibitor zumindest eine relative Selektivität gegenüber Serin-Proteasen zugeschrieben werden kann. SH65 zeigte lediglich Protease-Hemmung in den Enzym-Assays, jedoch keine antivirale Aktivität bei der Testung an Dengue-Virus-infizierten Zellen, was aber wiederum bei der synthetisierten Vorstufe von SH65, welche anstelle der beiden Hydroxy-Gruppen über Methoxy-Gruppen verfügt, der Fall war. Diarylthioether mit mehrfach hydroxy-substituiertem Benzothiazol-Baustein stellen hiermit eine neue, vielversprechende Wirkstoffgruppe zur Hemmung sowohl der Dengue-Virus Typ 2- als auch der Dengue-Virus Typ 3 NS2B-NS3 Protease dar.

Untersuchungen über Wechselwirkungen zwischen Proteinen der Leber und dem großen Hüllprotein des Hepatitis-B-Virus

Zusammenfassung:Im Infektionszyklus des Hepatitis-B-Virus spielt das große L-Hüllprotein mit seiner einzigartigen PräS1-Domäne eine zentrale Rolle. Es vermittelt die Bindung und Aufnahme in die Leberzelle, die Verpackung der Nukleokapside in die Virushülle, die Regulation der cccDNA-Amplifikation und eine transkriptionelle Aktivierung in der Wirtszelle. Zur Erfüllung seiner vielfältigen Aufgaben benötigt das L-Protein Unterstützung durch Wirtzellfaktoren, von denen einige im Rahmen dieser Untersuchung durch Verwendung von PräS1-Konstrukten als Fängerproteine im Hefe-Zwei-Hybrid-System identifiziert wurden. Mehrere Klone, die im Hefe-Zwei-Hybrid-Test mit dem C-terminalen PräS1-Fängerprotein (Aminosäure 44-108) isoliert worden waren, enthielten Teile der cDNA von gamma2-Adaptin, einem mutmaßlichen Mitglied der Clathrin-Adaptor-Proteine. Diese sind für intrazelluläre Membrantransportprozesse mittels clathrinumhüllter Vesikel verantwortlich. Unter den interagierenden Klonen, die mit dem N-terminalen Konstrukt des L-Proteins (Aminosäure 1-70) isoliert worden waren, befand sich überproportional häufig eine cDNA, die der schweren Kette H4 der Inter-Alpha-Trypsin-Inhibitor-Familie homolog war. H4 besitzt vermutlich bei der 'Akute-Phase-Reaktion', die Entzündungen folgt, und bei der Stabilisierung der extrazellulären Matrix physiologische Bedeutung. Weitere Klone kodierten für die Serinprotease C1r. Diese ist Bestandteil des C1-Komplex, der ersten Komponente des klassischen Komplementsystems. Die Spezifität der Bindung zwischen den positiven Klonen und der PräS1-Domäne wurde in weiteren biochemischen Interaktionstests bestätigt, sodaß H4, C1r und gamma2-Adaptin als Wirtszellfaktoren in der Physiologie des Hepatitis-B-Virus wahrscheinlich eine Rolle spielen.Abstract:Little is known about host cell factors necessary for hepatitis B virus assembly and infectivity. Central to virogenesis is the large L envelope protein that mediates hepatocyte receptor binding, envelopment of viral capsids, regulation of supercoiled DNA amplification and transcriptional transactivation. To assess its multiple functions and host-protein assistance involved, we here initiated a yeast two-hybrid screen using the L-specific preS1 domain as bait to screen a human liver cDNA library for L-interacting proteins. One of the most prominent cDNAs interacting with aminoacid sequence 44-108 of L-protein encodes for gamma2-adaptin, a novel clathrin adaptor-related protein responsible for protein sorting and trafficking. Among the clones interacting with the N-terminal construct of L-protein (aminoacid sequence 1-70), a frequently isolated cDNA corresponds to the gene for inter-alpha-trypsin family heavy chain H4, likely to be involved in acute inflammatory phase response and stabilization of extracellular matrices. Some other interacting clones were found to carry the cDNA for the serine protease C1r, a subunit of the C1 complex which initiates the classical complement cascade. The specificity of the interaction between the positive clones and the preS1 domain was further confirmed in independent biochemical experiments. Taken together, the results suggest a role for H4, C1r and gamma2-adaptin as host-cell factors in L-mediated process of viral biogenesis and/or pathogenesis.

Das wasserlösliche Chlorophyll-Protein (WSCP): biochemische Charakterisierung und Untersuchungen zur biologischen Funktion

Das WSCP (water-soluble chlorophyll protein) der Brassicaceen ist das einzig bekannte Chlorophyll-bindende Protein, welches keine Carotinoide bindet. Es ist ein wasserlösliches, ca. 80 kDa großes Homotetramer mit 1-4 gebundenen Chlorophyllen. Das Protein ist äußerst stabil und vermag die gebundenen Chlorophylle vor Photooxidation zu schützen. Seine Funktion in der Pflanze ist bis heute ein Rätsel und sollte in dieser Arbeit zusammen mit seinen biochemischen Eigenschaften weiter aufgeklärt werden. Es wurden Versuche durchgeführt mit nativem und rekombinantem WSCP aus Blumenkohl (BoWSCP bzw. BoWSCPhis) und aus Arabidopsis thaliana (AtWSCP bzw. AtWSCPhis). Die Expressionsausbeute von BoWSCPhis konnte verbessert werden und zusätzlich wurde die Rekonstitutionsmethode für das rekombinante WSCP optimiert, sodass das pigmentierte Protein mit hoher Ausbeute und großer Reinheit gewonnen werden konnte. Zudem wurde ein neuer WSCP-Klon hergestellt, mBoWSCPhis, der in seiner Sequenz dem maturen nativen BoWSCP entspricht und weitaus weniger Aggregationsprobleme zeigte als BoWSCPhis. Weiterführende Versuche zur Stabilität und dem Oligomerisierungsgrad von WSCP haben die neue Erkenntnis erbracht, dass die Phytolschwänze der von WSCP gebundenen Chlorophylle zwar essentiell sind für die Stabilität von WSCP-Oligomeren, nicht aber für die Oligomerisierung selbst, wie es in der Literatur bislang postuliert wurde. Zusätzlich zu ihrer außerordentlichen Hitzestabilität erwiesen sich die Chl-WSCP-Komplexe als stabil in einem breiten pH-Spektrum. AtWSCPhis besaß eine vergleichbare Stabilität, und auch das Oligomerisierungsverhalten zeigte Ähnlichkeiten zu BoWSCPhis. Im Rahmen einer Forschungskooperation mit dem Institut für Optik und Atomare Physik der TU Berlin wurden zeitaufgelöste Absorptionsspektren sowie Tieftemperatur-Fluoreszenzspektren an Chl-WSCP-Komplexen gemessen. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass die WSCP-gebundenen Chlorophylle excitonisch gekoppelt sind und wiesen zudem auf unterschiedliche Chl-Bindungsmodi hin. Aufgrund seines einfachen Aufbaus und seines geringen Chlorophyllgehalts hat sich WSCP bei diesen Versuchen als sehr geeignetes Modellsystem erwiesen, um Messungen zur Chlorophyllbindung mit Vorhersagen aus theoretischen Modellen zu vergleichen. Bei den Experimenten zur biologischen Funktion wurden einerseits Arabidopsis thaliana WSCP-„knock-out“-Pflanzen unter verschiedenen Bedingungen charakterisiert, andererseits wurden Experimente mit rekombinantem WSCP durchgeführt, um eine mögliche Interaktion mit anderen Proteinen zu detektieren. Die vegetativen Stadien der Mutante zeigten keinen Phänotyp; das native Arabidopsis-WSCP konnte später bei der Wildtyp-Pflanze ausschließlich in jungen Schoten lokalisiert werden, was eine Erklärung hierfür lieferte. Rekombinantes WSCP konnte Chlorophylle aus nativem LHCII entfernen, eine Interaktion mit Chlorophyllase konnte jedoch nicht nachgewiesen werden; daher konnte auch die Hypothese, WSCP sei ein Chl-Carrier beim Chl-Abbau, nicht untermauert werden. Bei den durchgeführten Enzym-Assays wurde eine geringfügige Inhibition der Cysteinprotease Papain beobachtet, aber keine Inhibition der Serinprotease Trypsin, obwohl Blumenkohl-WSCP N-proximal das Motiv der Künitz-Proteaseinhibitoren besitzt. Die Frage nach der biologischen Funktion von WSCP bleibt also weiterhin offen.

Aktivität der humanen Meprin-Metalloproteasen unter Berücksichtigung potentieller Aktivatoren

Die Metalloproteasen Meprin α und Meprin β sind an essentiellen (patho)physiologischen Prozessen beteiligt. Um die Funktion dieser Proteasen zu verstehen, ist es von Bedeutung, sie nicht isoliert, sondern im gesamten proteolytischen Netzwerk zu betrachten.rnDie Meprine werden in einer Vielzahl von Geweben, in Leukozyten, aber auch in Krebszellen exprimiert. In der Haut konnten die beiden Enzyme in unterschiedlichen dermalen Schichten detektiert werden, wo sie u.a. an der Kollagenassemblierung durch Abspaltung der Propeptide beteiligt sind. rnIm Zuge von Proteomics Analysen konnten mehr als 3000 proteolytische Schnittstellen von fünf Astacin-Metalloproteasen (Meprin α, Meprin β, Astacin, LAST und LAST_MAM) in Peptiden und nativen Substraten identifiziert werden und somit eine Aussage über die Spaltspezifität getroffen werden. In der vorliegenden Arbeit konnten diese Spaltspezifitäten mit Hilfe von fluorogenen Substraten in vitro verifiziert werden. Bemerkenswert hierbei ist die starke Präferenz der beiden Meprine und LAST_MAM für die Aminosäuren Aspartat und Glutamat in der P1‘ Position. rnMeprine werden als Zymogene exprimiert und müssen durch proteolytische Prozessierung einer tryptischen Protease aktiviert werden. Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit waren Aktivitätsbestimmungen beider Meprine unter Berücksichtigung potentieller Aktivatoren und Substrate. Es konnten die kallikrein-related peptidases (KLK) 4, 5 und 8 als spezifische Aktivatoren identifiziert werden, wobei nur KLK5 beide Proteasen aktiviert. Sowohl KLK4 als auch KLK8 sind lediglich in der Lage, das Propeptid von Meprin β abzuspalten. Außerdem konnte biochemisch und mittels Proteomics gezeigt werden, dass proKLK7 von Meprin β prozessiert wird. Durch N-terminale Sequenzierung wurde eine Schnittstelle zwei Aminosäuren N-terminal der eigentlichen Aktivierungsstelle identifiziert. Dieser Schritt beschleunigt die Aktivierung von KLK7, wenn durch Trypsin noch das verbliebene Dipeptid abgespalten wird. rnDa einige Vertreter der humanen kallikrein-related peptidases (KLK) als Meprin-Aktivatoren identifiziert werden konnten, sollten diese im Zuge dieser Arbeit im Modellorganismus Danio rerio untersucht werden. Durch in silico und RT-PCR Analysen konnte gezeigt werden, dass keine funktionellen KLK-Homologe im Zebrafisch codiert sind. Da somit andere tryptische Proteasen an der Aktivierung der Meprine beteiligt sein müssen, wurde die Transmembran-Serinprotease TMPRSS4 analysiert. In der Tat zeigte die Reduktion des Expressionslevels von TMPRSS4 durch Morpholino-Injektion drastische Störungen in der embryonalen Entwicklung von Zebrabärblingen. Mittels Licht- und Rasterelektronenmikroskopie ließ sich eine Fehlbildung der epidermalen Haut bis zu einem Ablösen der Keratinozyten von dem darunter liegenden Gewebe feststellen. rn

Neue wasserlösliche Cystein-Protease-Inhibitoren mit Aziridin-2,3-dicarbonsäure-Baustein

Die Leishmaniose gehört zu den „vernachlässigten tropischen Erkrankungen“. Sie wird durch parasitäre Protozoen der Gattung Leishmania ausgelöst. Weltweit sind ca. 12 Mio. Menschen infiziert, ca. 70 Tausend erliegen ihr jährlich. Die aktuelle Therapie wird überschattet von Toxizitäts- und Teratogenitätsproblemen und von aufkommenden Resistenzen. Die von den Leishmanien exprimierten Cysteinproteasen spielen vielfältige Rollen bei Wachstum und Vermehrung der Erreger. Aufgrund der evolutionären Verwandtschaft der Enzyme sind die parasitären Cysteinproteasen strukturell den humanen sehr ähnlich. Die Herausforderung bei der Entwicklung antiparasitärer Wirkstoffe, basierend auf der Hemmung dieser Proteasen, besteht deshalb darin, sehr selektive Inhibitoren zu entwickeln, die die Wirtsproteasen nicht, oder nur in einem vertretbaren Rahmen, inhibieren. Das Ziel dieser Arbeit war die Weiterentwicklung der Aziridin-2,3-dicarbonsäure-basierten Cysteinproteaseinhibitoren RV122C bzw. CS09 hinsichtlich Selektivität und Aktivität gegenüber der parasitären Cathepsin-L-ähnlichen Cystein-Protease LmCPB2.8 durch Design, incl. Docking, Synthese und Testung. Neben der gezielten Variation nicht essenzieller Gruppen wurde molekulares Docking mittels AutoDock Vina an Cruzain als verwandtes Modellenzym durchgeführt, um durch Variationen K.O.-Kandidaten für die Differenzierung zwischen zwei postulierten Bindungsmodi zu finden. Die Ergebnisse der Enzymassays zeigen eine Verbesserung der Hemmeigenschaften bei gleichzeitig verbesserter Selektivität sowie erhöhter ligand efficiency und ligand lipophilic efficiency für Derivate mit sterisch anspruchsvolleren Ester-Resten und für Derivate mit einer freien Carbonsäurefunktion am Aziridin-Ring (Halbester).

Die Isolierung und Aufreinigung der Metalloendopeptidase LysN und die Evaluierung der Spezifität der LysN E157D-Mutante und ihr Einsatz in der Proteomik und die Mechanismen der Bildung von “dendritic cell aggresome- like induced structures“ (DALIS)

Der proteolytische Verdau von Proteinen in Peptide ist ein wichtiger Schritt in der Tandem-Massenspektrometrie. Dabei werden Peptide fragmentiert und die sich ergebenden Fragmentionen geben Aufschluss über die Aminosäuresequenz des zu untersuchenden Proteins. Dabei sind für die Fragmentierung sowohl Länge und Sequenz, als auch der Ladungszustand des Peptids ungemein wichtig. Diese Parameter bedingen sich durch Endoproteasen, die für den proteolytischen Verdau eingesetzt werden. Eine Voraussetzung hierfür ist die Spezifität der Protease. Trypsin ist bei weitem die gebräuchlichste Protease zur massenspektrometrischen Probenvorbereitung. Allerdings bietet Trypsin keine Komplettlösung. Je nach Fragestellung und Applikation müssen weitere Proteasen eingesetzt werden, um eine komplette Sequenzabdeckung zu gewährleisten und möglichst alle posttranslationalen Modifikationen nachzuweisen, oder bestimmte Proteomklassen (z.B Phosphoproteom

Synthese von selektiv Protease-spaltbaren Nanopartikeln

Diese Arbeit legt, im Rahmen eines interdisziplinären BMBF Projekts, die Grundlage für eine neue, potentielle Früherkennungsmethode für Prostatakrebs. Ausgehend von der Idee, einen sensitiv detektierbaren Farbstoff in selektiv, Hepsin-spaltbare Kapseln einzubringen, wurde ein Modellsystem erarbeitet. Als Zielsubstrat für das Enzym Hepsin wurde die Sequenz RQLRVVGG identifiziert. Basierend auf dem hier entwickelten Modell, könnte in Zukunft eine Detektion von Hepsin und damit von Prostatakrebs im Frühstadium in vivo erfolgen. rnUm das Konzept der Enzymspaltbarkeit zu zeigen,wurden, basierend auf einem Modell,enzymatisch-spaltbare, polymere Nanopartikeldargestellt. In dieser Arbeit konnte die Synthese von vier Generationen spezifisch Protease-spaltbarer, hydrophober Nanopartikel gezeigt werden. Die Enzyme Pepsin und Trypsin, die selektiv die Peptidsequenz GFF spalten, wurden als Modellenzyme für das im Prostatakarzinom überexprimierte Hepsin eingesetzt. rnrnAls Ausgangspolymer diente Poly(styrol-co-acrylsäure), das in freier, radikalischer Polymerisation hergestellt und mit Molekulargewichten zwischen 8500 und 49400 g/mol erhalten wurde. Der Funktionalisierungsgrad wurde zwischen 5 und 16%-Gew. variiert. Die Charakterisierung erfolgte mittels GPC und NMR-Spektroskopie. In einer polymeranalogen Reaktion wurden die Säurefunktionen zu Aminogruppen umgesetzt. Die resultierendenPolymere wurden unter Einsatz der über Jahrzehnte entwickelten, effektiven Peptidkupplungschemie mit enzymspaltbarenPeptiden gekuppelt, um dadurch definierte Peptid-Polymer-Konjugate zu erhalten.Als enzymatisch spaltbarer Teil des Konjugats, wurden mithilfe der Festphasenpeptidsynthese (SPPS),FRET(Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer)-markiertePeptide synthetisiert, die auf der Trypsin-spaltbaren Sequenz GFF basierten. Zum Nachweis der Vernetzung der späteren Nanopartikel, wurde zusätzlich einern15N-markierte Aminosäure (Fmoc-(15N)-Glycin) am N-Terminus der Peptide eingebaut, um die Reaktion des Amins zu einem Amid verfolgen zu können.Die Charakterisierung der Peptide erfolgte mittels1H-, 13C-NMR-Spektroskopie, MALDI TOF-MS und HPLC. Aus den Polymeren und dem Peptid wurden Peptid-Polymer-Konjugate hergestellt und die erfolgreiche Anbindung mittels DOSY-NMR-Spektroskopie und HPLC nachgewiesen. Aus den Konjugaten konnten im nächsten Schritt, durch Anwendung des inversen Miniemulsionsprozesses, Nanopartikel formuliertund diese in wässriges Milieu überführt werden. Die Dispersionen konnten mittels PCCS, REM und Zetapotentialmessungen charakterisiert werden, wobei Partikeldurchmesser um 230 nm resultierten. Der Nachweis der Vernetzung des Polymers in den Partikeln konnte durch die Reaktion desrn15N-Amins zu einem 15N-Amid mittels 15N-Festkörper-NMR-Spektroskopie nachverfolgt werden. Abschließend konnten die Partikel durch Trypsin gespalten werden, was durch das eingebaute FRET-Paar über eine in situ Detektion der relativen Fluoreszenz erfolgte. rnIn dieser Arbeit konnten Peptid-vernetzte, Polystyrol basierte Nanopartikel hergestellt und in Heterophase von Trypsin gespalten werden.rn

Prozessierung des humanen GARP–Rezeptors und die physiologischen Auswirkungen

GARP (Glycoprotein A Repetitions Predominant) ist ein Oberflächenrezeptor auf regulatorischen T–Zellen (TRegs), der den latenten TGF–β (Transforming Growth Factor–β) bindet. Ein Funktionsverlust von T Regs hat gravierende Autoimmunerkrankungen wie das Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X–linked Syndrome (IPEX), Multiple Sklerose (MS) oder Rheumatoide Arthritis (RA) zur Folge. GARP stellt über eine Erhöhung der Aktivierbarkeit von TGF–β den regulatorischen Phänotyp von TRegs sicher und inhibiert die Ausbreitung von autoreaktiven TH17 Zellen.rn In dieser Arbeit stand die Regulation von GARP selbst im Mittelpunkt. Es konnte gezeigt werden, dass es sich innerhalb der kiefertragenden Vertebraten um ein strikt konserviertes Protein handelt. Datenbankanalysen machten deutlich, dass es zuerst in basalen Knochenfischen zusammen mit anderen Komponenten der adaptiven Immunantwort auftritt. Ein 3D–Modell, welches über Homologiemodellierung erstellt wurde, gab Aufschluss über die Struktur des Rezeptors und mögliche intramolekulare Disulfidbrücken. Für in vitro Versuche wurde eine lösliche Variante von GARP durch einen Austausch der Transmembrandomäne durch C–terminale Meprin α Domänen konstruiert. Diese Variante wurde in der eukaryotischen Zellkultur zuverlässig in den Überstand sezerniert und konnte chromatografisch gereinigt werden. Mit diesem rekombinanten GARP wurden Prozessierungsversuche mit Autoimmunpathogenese assoziierten Proteasen durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die Serinproteasen Trypsin, Neutrophile Elastase und Plasmin, sowie die Metalloprotease MMP2 in der Lage sind, GARP vollständig zu degradieren. In TGF–β sensitiven Proliferationsuntersuchungen stellte sich heraus, dass die entstandenen Fragmente immer noch in der Lage waren die Aktivierbarkeit von TGF–β zu erhöhen. Neben der Degradierung durch die oben genannten Proteasen konnte ebenfalls beobachtet werden, dass MMP9 und Ovastacin in der Lage sind GARP spezifisch zu schneiden. Ovastacin mRNA wurde in dieser Arbeit das erste Mal außerhalb der Oocyte, in T–Zellen beschrieben. Mit GARP wurde zudem das zweite Proteinsubstrat, neben dem Zona Pellucida Protein 2 identifiziert. Das durch MMP9 erzeugte N–terminale Fragment besitzt zwar die Eigenschaft, an TGF–β zu binden, kann aber die Aktivierbarkeit von TGF–β nicht mehr wie das intakte GARP erleichtern. rnDiese Arbeit zeigte, dass GARP durch Proteolyse reguliert wird, wobei die entstehenden Fragmente unterschiedlichen Einfluss auf die Aktivierbarkeit von TGF–β haben. Dieses Wissen bildet die Grundlage für weitere Untersuchungen im translationalen Forschungsbereich, um die gewonnenen Erkenntnisse zur Immunmodulation in der Therapie verschiedener Krankheiten einsetzen zu können.rn