Direct electron transfer to cytochrome c oxidase investigated by electrochemistry and time-resolved surface-enhanced infrared absorption spectroscopy

Cytochrom c Oxidase (CcO), der Komplex IV der Atmungskette, ist eine der Häm-Kupfer enthaltenden Oxidasen und hat eine wichtige Funktion im Zellmetabolismus. Das Enzym enthält vier prosthetische Gruppen und befindet sich in der inneren Membran von Mitochondrien und in der Zellmembran einiger aerober Bakterien. Die CcO katalysiert den Elektronentransfer (ET) von Cytochrom c zu O2, wobei die eigentliche Reaktion am binuklearen Zentrum (CuB-Häm a3) erfolgt. Bei der Reduktion von O2 zu zwei H2O werden vier Protonen verbraucht. Zudem werden vier Protonen über die Membran transportiert, wodurch eine elektrochemische Potentialdifferenz dieser Ionen zwischen Matrix und Intermembranphase entsteht. Trotz ihrer Wichtigkeit sind Membranproteine wie die CcO noch wenig untersucht, weshalb auch der Mechanismus der Atmungskette noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Das Ziel dieser Arbeit ist, einen Beitrag zum Verständnis der Funktion der CcO zu leisten. Hierzu wurde die CcO aus Rhodobacter sphaeroides über einen His-Anker, der am C-Terminus der Untereinheit II angebracht wurde, an eine funktionalisierte Metallelektrode in definierter Orientierung gebunden. Der erste Elektronenakzeptor, das CuA, liegt dabei am nächsten zur Metalloberfläche. Dann wurde eine Doppelschicht aus Lipiden insitu zwischen die gebundenen Proteine eingefügt, was zur sog. proteingebundenen Lipid-Doppelschicht Membran (ptBLM) führt. Dabei musste die optimale Oberflächenkonzentration der gebundenen Proteine herausgefunden werden. Elektrochemische Impedanzspektroskopie(EIS), Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) und zyklische Voltammetrie (CV) wurden angewandt um die Aktivität der CcO als Funktion der Packungsdichte zu charakterisieren. Der Hauptteil der Arbeit betrifft die Untersuchung des direkten ET zur CcO unter anaeroben Bedingungen. Die Kombination aus zeitaufgelöster oberflächenverstärkter Infrarot-Absorptionsspektroskopie (tr-SEIRAS) und Elektrochemie hat sich dafür als besonders geeignet erwiesen. In einer ersten Studie wurde der ET mit Hilfe von fast scan CV untersucht, wobei CVs von nicht-aktivierter sowie aktivierter CcO mit verschiedenen Vorschubgeschwindigkeiten gemessen wurden. Die aktivierte Form wurde nach dem katalytischen Umsatz des Proteins in Anwesenheit von O2 erhalten. Ein vier-ET-modell wurde entwickelt um die CVs zu analysieren. Die Methode erlaubt zwischen dem Mechanismus des sequentiellen und des unabhängigen ET zu den vier Zentren CuA, Häm a, Häm a3 und CuB zu unterscheiden. Zudem lassen sich die Standardredoxpotentiale und die kinetischen Koeffizienten des ET bestimmen. In einer zweiten Studie wurde tr-SEIRAS im step scan Modus angewandt. Dafür wurden Rechteckpulse an die CcO angelegt und SEIRAS im ART-Modus verwendet um Spektren bei definierten Zeitscheiben aufzunehmen. Aus diesen Spektren wurden einzelne Banden isoliert, die Veränderungen von Vibrationsmoden der Aminosäuren und Peptidgruppen in Abhängigkeit des Redoxzustands der Zentren zeigen. Aufgrund von Zuordnungen aus der Literatur, die durch potentiometrische Titration der CcO ermittelt wurden, konnten die Banden versuchsweise den Redoxzentren zugeordnet werden. Die Bandenflächen gegen die Zeit aufgetragen geben dann die Redox-Kinetik der Zentren wieder und wurden wiederum mit dem vier-ET-Modell ausgewertet. Die Ergebnisse beider Studien erlauben die Schlussfolgerung, dass der ET zur CcO in einer ptBLM mit größter Wahrscheinlichkeit dem sequentiellen Mechanismus folgt, was dem natürlichen ET von Cytochrom c zur CcO entspricht.

Zur Struktur und Funktion der Typ-3-Kupferproteine sowie der Lichtsammlerkomplexe LHCI und LHCII

In der vorliegenden Arbeit wurden die bioinformatischen Methoden der Homologie-Modellierung und Molekularen Modellierung dazu benutzt, die dreidimensionalen Strukturen verschiedenster Proteine vorherzusagen und zu analysieren. Experimentelle Befunde aus Laborversuchen wurden dazu benutzt, die Genauigkeit der Homologie-Modelle zu erhöhen. Die Ergebnisse aus den Modellierungen wurden wiederum dazu benutzt, um neue experimentelle Versuche vorzuschlagen. Anhand der erstellten Modelle und bekannten Kristallstrukturen aus der Protein-Datenbank PDB wurde die Struktur-Funktionsbeziehung verschiedener Tyrosinasen untersucht. Dazu gehörten sowohl die Tyrosinase des Bakteriums Streptomyces als auch die Tyrosinase der Hausmaus. Aus den vergleichenden Strukturanalysen der Tyrosinasen resultierten Mechanismen für die Monophenolhydroxylase-Aktivität der Tyrosinasen sowie für den Import der Kupferionen ins aktive Zentrum. Es konnte der Beweis geführt werden, daß die Blockade des CuA-Zentrums tatsächlich der Grund für die unterschiedliche Aktivität von Tyrosinasen und Catecholoxidasen ist. Zum ersten Mal konnte mit der Maus-Tyrosinase ein vollständiges Strukturmodell einer Säugetier-Tyrosinase erstellt werden, das dazu in der Lage ist, die Mechanismen bekannter Albino-Mutationen auf molekularer Ebene zu erklären. Die auf der Basis des ermittelten 3D-Modells gewonnenen Erkenntnisse über die Wichtigkeit bestimmter Aminosäuren für die Funktion wurde durch gerichtete Mutagenese an der rekombinant hergestellten Maus-Tyrosinase getestet und bestätigt. Weiterhin wurde die Struktur der Tyrosinase des Krebses Palinurus elephas durch eine niedrigaufgelöste 3D-Rekonstruktion aus elektronenmikroskopischen Bildern aufgeklärt. Der zweite große Themenkomplex umfasst die Strukturanalyse der Lichtsammlerkomplexe LHCI-730 und LHCII. Im Falle des LHCII konnte der Oligomerisierungszustand der LHCMoleküle mit diskreten Konformationen des N-Terminus korreliert werden. Auch hier kam eine Kombination von Homologie-Modellierung und einer experimentellen Methode, der Elektronen-Spin-Resonanz-Messung, zum Einsatz. Die Änderung des Oligomerisierungszustands des LHCII kontrolliert den Energiezufluß zu den Photosystemen PS I und PS II. Des Weiteren wurde ein vollständiges Modell des LHCI-730 erstellt, um die Auswirkungen gerichteter Mutagenese auf das Dimerisierungsverhalten zu untersuchen. Auf Basis dieses Modells wurden die Wechselwirkungen zwischen den Monomeren Lhca1 und Lhca4 evaluiert und potentielle Bindungspartner identifiziert.

Erste Messung der Pi-0-Photoproduktion an transversal polarisierten Protonen nahe der Schwelle

Diese Arbeit befasst sich mit der photoinduzierten Erzeugung neutraler Pionen, sehr nahe an der Schwellenenergie. Dabei werden zwei Ziele verfolgt: Zum einen die Überprüfung von Vorhersagen dieser effektiven Theorien und Modelle, zum anderen werden hier erstmals alle relevanten Partialwellenamplituden modellunabhängig aus gemessenen Observablen bestimmt. Diese Methode soll in Zukunft auch bei höheren Energien im Bereich der Nukleonresonanzen Anwendung finden. rnrnKonkret wird die Durchführung und Analyse eines Experiments vorgestellt, welches am Mainzer Mikrotron (MAMI) in den Jahren 2010 bis 2013 mit zirkular polarisiertem Photonenstrahl stattfand. Der Photonenstrahl wurde an einer Anlage zur Erzeugung energiemarkierter Bremsstrahlung aus dem Elektronenstrahl von MAMI gewonnen. Zum Nachweis der Reaktionsprodukte diente das hermetische 4pi CB/TAPS-Detektorsystem. Erstmalig standen bei derartigen Messungen auch transversal polarisierte Protonen zur Verfügung. Dazu wird Butanol in einer speziellen Apparatur dynamisch polarisiert. Molekularer Wasserstoff lässt sich aufgrund der para-Konfiguration nicht polarisieren. Wegen der Verwendung von Butanol als Targetmaterial, bei dem weniger als 5% aller erzeugten Pionen an polarisierten Protonen produziert wurden, ist die Behandlung des Untergrunds eine zentrale Aufgabe. rnrnEs werden zwei Methoden der Untergrundseparation vorgestellt, wovon die bessere in der Analyse angewendet wurde. Abschließend findet eine ausführliche Bewertung systematischer Fehler statt.rnrnDie erstmalige Verwendung transversal polarisierter Protonen ermöglicht den Zugang zu bisher nicht gemessenen Spin"=Freiheitsgraden. In Kombination mit einem komplementären Vorläufer-Experiment aus dem Jahr 2008 mit linear polarisiertem Photonenstrahl konnten aus den gewonnenen Daten erstmals alle komplexen s- und p-Partialwellenamplituden modellunabhängig bestimmt werden. rnrnDarüber hinaus wurden im Rahmen dieser Arbeit wesentliche Verbesserungen am apparativen Aufbau erzielt. Beispiele sind ein Elektronenstrahl-Polarimeter, ein zellularer CB-Multiplizitätstrigger, sowie signifikante Verbesserungen der Datennahmeelektronik und des Triggersystems, die teilweise in dieser Arbeit vorgestellt werden.

Aerosol-cloud interactions studied with a chemistry-climate model

This study aims at a comprehensive understanding of the effects of aerosol-cloud interactions and their effects on cloud properties and climate using the chemistry-climate model EMAC. In this study, CCN activation is regarded as the dominant driver in aerosol-cloud feedback loops in warm clouds. The CCN activation is calculated prognostically using two different cloud droplet nucleation parameterizations, the STN and HYB CDN schemes. Both CDN schemes account for size and chemistry effects on the droplet formation based on the same aerosol properties. The calculation of the solute effect (hygroscopicity) is the main difference between the CDN schemes. The kappa-method is for the first time incorporated into Abdul-Razzak and Ghan activation scheme (ARG) to calculate hygroscopicity and critical supersaturation of aerosols (HYB), and the performance of the modied scheme is compared with the osmotic coefficient model (STN), which is the standard in the ARG scheme. Reference simulations (REF) with the prescribed cloud droplet number concentration have also been carried out in order to understand the effects of aerosol-cloud feedbacks. In addition, since the calculated cloud coverage is an important determinant of cloud radiative effects and is influencing the nucleation process two cloud cover parameterizations (i.e., a relative humidity threshold; RH-CLC and a statistical cloud cover scheme; ST-CLC) have been examined together with the CDN schemes, and their effects on the simulated cloud properties and relevant climate parameters have been investigated. The distinct cloud droplet spectra show strong sensitivity to aerosol composition effects on cloud droplet formation in all particle sizes, especially for the Aitken mode. As Aitken particles are the major component of the total aerosol number concentration and CCN, and are most sensitive to aerosol chemical composition effect (solute effect) on droplet formation, the activation of Aitken particles strongly contribute to total cloud droplet formation and thereby providing different cloud droplet spectra. These different spectra influence cloud structure, cloud properties, and climate, and show regionally varying sensitivity to meteorological and geographical condition as well as the spatiotemporal aerosol properties (i.e., particle size, number, and composition). The changes responding to different CDN schemes are more pronounced at lower altitudes than higher altitudes. Among regions, the subarctic regions show the strongest changes, as the lower surface temperature amplifies the effects of the activated aerosols; in contrast, the Sahara desert, where is an extremely dry area, is less influenced by changes in CCN number concentration. The aerosol-cloud coupling effects have been examined by comparing the prognostic CDN simulations (STN, HYB) with the reference simulation (REF). Most pronounced effects are found in the cloud droplet number concentration, cloud water distribution, and cloud radiative effect. The aerosol-cloud coupling generally increases cloud droplet number concentration; this decreases the efficiency of the formation of weak stratiform precipitation, and increases the cloud water loading. These large-scale changes lead to larger cloud cover and longer cloud lifetime, and contribute to high optical thickness and strong cloud cooling effects. This cools the Earth's surface, increases atmospheric stability, and reduces convective activity. These changes corresponding to aerosol-cloud feedbacks are also differently simulated depending on the cloud cover scheme. The ST-CLC scheme is more sensitive to aerosol-cloud coupling, since this scheme uses a tighter linkage of local dynamics and cloud water distributions in cloud formation process than the RH-CLC scheme. For the calculated total cloud cover, the RH-CLC scheme simulates relatively similar pattern to observations than the ST-CLC scheme does, but the overall properties (e.g., total cloud cover, cloud water content) in the RH simulations are overestimated, particularly over ocean. This is mainly originated from the difference in simulated skewness in each scheme: the RH simulations calculate negatively skewed distributions of cloud cover and relevant cloud water, which is similar to that of the observations, while the ST simulations yield positively skewed distributions resulting in lower mean values than the RH-CLC scheme does. The underestimation of total cloud cover over ocean, particularly over the intertropical convergence zone (ITCZ) relates to systematic defficiency of the prognostic calculation of skewness in the current set-ups of the ST-CLC scheme.rnOverall, the current EMAC model set-ups perform better over continents for all combinations of the cloud droplet nucleation and cloud cover schemes. To consider aerosol-cloud feedbacks, the HYB scheme is a better method for predicting cloud and climate parameters for both cloud cover schemes than the STN scheme. The RH-CLC scheme offers a better simulation of total cloud cover and the relevant parameters with the HYB scheme and single-moment microphysics (REF) than the ST-CLC does, but is not very sensitive to aerosol-cloud interactions.