Cyclodextrine als molekulare Reaktionsgefäße

Zusammenfassung:In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch die Anwendung von Cyclodextrinen in der Polymerchemie ein neuer Weg gefunden wurde, Homo- und Copolymerisationen von hydrophoben, fluorophilen sowie ionischen Monomeren in wässrigem Medium durchzuführen, die bislang nur durch den Einsatz von Emulgatoren oder in organischen Lösemittelgemischen möglich waren. Standardmonomere wie z.B. Styrol konnten erfolgreich aus wässriger Phase in Gegenwart von Cyclodextrin polymerisiert werden; unter Anwendung des Zulauf-Verfahrens wurden stabile Latices mit monodisperser Teilchengrössenverteilung erhalten. Durch Verwendung von Cyclodextrinen als Löslichkeitsvermittler konnten fluorierte Methacrylate in wässriger Lösung in fast quantitativer Ausbeute homo- bzw. mit Styrol copolymerisiert werden, während bei Abwesenheit von Cyclodextrin keine bzw. nur geringe Umsätze erzielt wurden. Weiterhin ließen sich auch sehr unterschiedliche Monomerpaare wie 1H,1H,2H,2H-Perfluordecylacrylat mit Stearylmethacrylat in wässriger Phase unter Verwendung von Cyclodextrin copolymerisieren. Ein ebenfalls gegensätzliches Monomerenpaar, das sich als Cyclodextrin-Komplex in hohen Ausbeuten und zu hohen Molekulargewichten copolymerisieren ließ, war Natrium-4-(acrylamido)-phenyldiazosulfonat und Styrol, dessen Copolymerisation bislang nur in org. Lösemittelgemischen möglich war. In der Synthese leitfähiger Polymere konnte ein neuer, umweltfreundlicher Weg zur Herstellung von Polyheterocyclen durch oxidative Polymerisation der komplexierten Monomere in Wasser, wie z.B. 3,4-Ethylendioxythiophen oder Pyrrol, die ihre Anwendung zur Herstellung leitfähiger Polymere finden, erarbeitet werden.Zur Variation der Polymereigenschaften wurde auch erstmalig die neue Substanzklasse von 2H-Benzo[5,6][1,4]dioxino[2,3-c]pyrrol-Derivaten synthetisiert.

Characterisation of human co-culture systems for applications in bone tissue engineering

For the successful integration of bone tissue engineering constructs into patients, an adequate supply with oxygen and nutrients is critical. Therefore, prevascularisation of bone tissue engineering constructs is desirable for bone formation, remodelling and regeneration. Co-culture systems, consisting of human endothelial cells and primary osteoblasts (pOB) as well as osteosarcoma cell lines, represent a promising method for studying the mechanisms involved in the vascularisation of constructs in bone tissue en- gineering and could provide new insights into the molecular and cellular mechanisms that control essential processes during angiogenesis. The present study demonstrated the im- portant components of co-culture systems with a focus on bone tissue replacement and the angiogenic effects of pOB and osteosarcoma cell lines on human endothelial cells. Furthermore, the studies emphasised an overall approach for analysis of signal molecules that are involved in the angiogenic activation of human endothelial cells by the regulation of VEGF-related pathways at the transcriptional and translational levels. The osteosarcoma cell lines Cal-72, MG-63 and SaOS-2, as well as pOB from several donors, differed in their angiogenesis-inducing potential in 2-D and 3-D co-culture systems. SaOS-2 cells appeared to have a high osteogenic differentiation level with no detectable angiogenesis-inducing potential in co-culture with human endothelial cells. The angiogenic potential of the osteoblast-like cells is mainly correlated with the upregulation of essential angiogenic growth factors, such as VEGF, bFGF and HGF and the downregulation of the angiogenesis inhibitor, endostatin. However, other factors involved in angiogenic regulation were found to differ between SaOS-2 cells, compared to Cal-72 and MG-63. The present study focuses on VEGF pathway-effecting genes as key players in the regulation of angiogenesis. The levels of VEGF and VEGF-effecting genes, such as TGF-α and TIMP-2 are down-regulated in SaOS-2 cells. In contrast, direct regulators of VEGF, such as IL6, IL8 and TNF are strongly upregulated, which indicates disruptions in growth factor regulating pathways in SaOS-2 cells. Potential pathways, which could be involved include MEK, PI3K, MAPK, STAT3, AKT or ERK. Additional treatment of co-cultures with single growth factors did not accelerate or improve the angiogenesis-inducing potential of SaOS-2 cells. Knowledge of the detailed molecular mechanisms involved in angiogenesis control will hopefully allow improved approaches to be developed for prevascularisation of bone tissue engineering constructs.

Etablierung einer Ko-Kultur von Alveolarepithel und mikrovaskulärem Endothel als in-vitro-Modell einer humanen respiratorischen Einheit

Ziel der Promotionsarbeit war die Etablierung einer humanen respiratorischen Einheit in vitro zur Untersuchung von Wirkmechanismen einer akuten Lungenschädigung. Als Ko-Kulturmodell wurde eine Kultur humaner Alveoloarepithelzellen vom Typ II (A549, NCI H441, primäre hATII Zellen) mit mikrovaskulären Endothelzellen (ISO-HAS-1, primäre HPMEC) auf den beiden Seiten einer mikroporösen Filtermembran (Bilayer) gewählt. Ein differenzierter Monolayer von NCI H441 konnte in Bilayer-Ko-Kultur mit ISO-HAS-1 oder HPMEC durch die Zugabe von Dexamethason (1 µM) unter Verwendung eines serumhaltigen Mediums induziert werden. Dabei wurde eine von Tag 10 bis Tag 12 phänotypisch stabile Ko-Kultur mit TER-Werten um 500 Ohm x cm2 erhalten. Im Hinblick auf die Freisetzung von IL-8 und MCP-1 und die fehlende Freisetzung von RANTES nach Stimulation waren NCI H441 den hATII Zellen ähnlicher als die häufig als hATII-analog eingesetzte Zell-Linie A549, die RANTES freisetzte. Außerdem bildeten A549 trotz zahlreicher Variatione

Pseudodifferential analysis in Psi*-algebras on transmission spaces, infinite solving ideal chains and K-theory for conformally compact spaces

The present thesis is a contribution to the theory of algebras of pseudodifferential operators on singular settings. In particular, we focus on the $b$-calculus and the calculus on conformally compact spaces in the sense of Mazzeo and Melrose in connection with the notion of spectral invariant transmission operator algebras. We summarize results given by Gramsch et. al. on the construction of $Psi_0$-and $Psi*$-algebras and the corresponding scales of generalized Sobolev spaces using commutators of certain closed operators and derivations. In the case of a manifold with corners $Z$ we construct a $Psi*$-completion $A_b(Z,{}^bOmega^{1/2})$ of the algebra of zero order $b$-pseudodifferential operators $Psi_{b,cl}(Z, {}^bOmega^{1/2})$ in the corresponding $C*$-closure $B(Z,{}^bOmega^{12})hookrightarrow L(L^2(Z,{}^bOmega^{1/2}))$. The construction will also provide that localised to the (smooth) interior of Z the operators in the $A_b(Z, {}^bOmega^{1/2})$ can be represented as ordinary pseudodifferential operators. In connection with the notion of solvable $C*$-algebras - introduced by Dynin - we calculate the length of the $C*$-closure of $Psi_{b,cl}^0(F,{}^bOmega^{1/2},R^{E(F)})$ in $B(F,{}^bOmega^{1/2}),R^{E(F)})$ by localizing $B(Z, {}^bOmega^{1/2})$ along the boundary face $F$ using the (extended) indical familiy $I^B_{FZ}$. Moreover, we discuss how one can localise a certain solving ideal chain of $B(Z, {}^bOmega^{1/2})$ in neighbourhoods $U_p$ of arbitrary points $pin Z$. This localisation process will recover the singular structure of $U_p$; further, the induced length function $l_p$ is shown to be upper semi-continuous. We give construction methods for $Psi*$- and $C*$-algebras admitting only infinite long solving ideal chains. These algebras will first be realized as unconnected direct sums of (solvable) $C*$-algebras and then refined such that the resulting algebras have arcwise connected spaces of one dimensional representations. In addition, we recall the notion of transmission algebras on manifolds with corners $(Z_i)_{iin N}$ following an idea of Ali Mehmeti, Gramsch et. al. Thereby, we connect the underlying $C^infty$-function spaces using point evaluations in the smooth parts of the $Z_i$ and use generalized Laplacians to generate an appropriate scale of Sobolev spaces. Moreover, it is possible to associate generalized (solving) ideal chains to these algebras, such that to every $ninN$ there exists an ideal chain of length $n$ within the algebra. Finally, we discuss the $K$-theory for algebras of pseudodifferential operators on conformally compact manifolds $X$ and give an index theorem for these operators. In addition, we prove that the Dirac-operator associated to the metric of a conformally compact manifold $X$ is not a Fredholm operator.

Wirkmechanismen der trifunktionalen Antikörper catumaxomab und ertumaxomab in humanen Tumorsphäroid-Kokulturen

Ein neuer Ansatz der immunologischen Krebstherapie ist die Verwendung der bispezifischen, trifunktionalen Antikörper catumaxomab (anti-EpCAM x anti-CD3) und ertumaxomab (anti-Her2/neu x anti-CD3). Die Bispezifität besteht in der Bindung eines Tumor-assoziierten Antigens (EpCAM bzw. Her2/neu) und des CD3 Moleküls auf der Oberfläche von T-Zellen. Darüber hinaus stellt die Interaktion des Fc-Teils mit FcγRI/IIa/III positiven akzessorischen Immunzellen die dritte Funktion der Antikörper dar. Diese einzigartige Kombination ermöglicht theoretisch die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes. In klinischen Studien konnte bereits die Wirksamkeit beider Antikörper nachgewiesen werden. Die eigentlichen Wirkmechanismen der trifunktionalen Antikörper jedoch sind noch nicht ausreichend bekannt. Um die Wechselwirkung zwischen den stark EpCAM- und schwach Her2/neu-positive FaDu- sowie den stabil mit humanem Her2/neu transfizierten FaDu E593-Tumorzellen, peripheren Blutmonozyten (PBMC) und trifunktionalen Antikörpern systematisch zu untersuchen wurde ein 3D-Tumormodell, die so genannten multizellulären Tumorsphäroide (MCTS), angewandt. Als Endpunkte zur Beurteilung der Therapieeffizienz dienten das Volumenwachstum der Sphäroide, sowie die Klonogenität und die Zellvitalität. Zur Beurteilung der PBMC-Penetration in die Sphäroide erfolgten immunhistochemische Färbungen und molekularbiologische Nachweise der Abwehrzellantigene. Entsprechend wurden in den Sphäroiden die Proliferationsrate über eine Ki67-Färbung sowie die Apoptoserate über eine FragEL-Markierung identifiziert. Die Aktivität der PBMC wurde durch die Bestimmung ausgewählter Zytokine (ELISA) und der Zellzahl aus den Medienüberständen charakterisiert. Die an den FaDu- und E593-Sphäroiden erzielten Ergebnisse zeigten, dass catumaxomab und ertumaxomab eine konzentrations- und zeitabhängige Abnahme des Sphäroidvolumens bewirkten. Die Schrumpfung der Tumorsphäroide ging mit einer Reduktion des proliferativen und mit einer Steigerung des apoptotischen Tumorzellanteils einher. Die histologischen Befunde weisen darauf hin, dass die Volumenreduktion durch eine gesteigerte Anzahl infiltrierender Leukozyten bedingt ist. Auf verschiedenen Methoden basierende Analysen der Immunzellsubtypen zeigten eine dominierende Infiltration von zytotoxischen T-Zellen in die Tumorsphäroide. Der Aktivitätsnachweis der T-Zellen wurde über die Detektion der IL-2 mRNA und des sekretierten Zytokins erbracht. Einen zusätzlichen Hinweis auf eine zelluläre Immunantwort liefert das Zytokinmuster mit hohen Konzentrationen an IFN-γ. Der direkte Vergleich beider Antikörper zeigte, dass der anti-tumorale Effekt abhängig von der Antigenexpression auf den Tumorzellen war. Die Analyse von Medienüberständen wies auf eine mehrheitlich höhere Zytokinausschüttung in Gegenwart des Tumorantigens hin. Sphäroid-Kokulturen, die mit dem parentalen anti-EpCAM Antikörper behandelt wurden, zeigten keine Volumenreduktion. Im Gegensatz dazu führte der parentale CD3-Antikörper, das CD3- und Tumorzell-bindende catumaxomab F(ab')2 Fragment oder eine Kombination beider parentaler Antikörper zu einer anti-tumoralen Wirkung, die jedoch nicht so stark war wie die des trifunktionalen Antikörpers catumaxomab. Demnach ist für catumaxomab gezeigt, dass für die Effektivität des Antikörpers die Trifunktionalität unabdingbar ist. Daraus leitet sich ab, dass die Aktivierung der Abwehrzellen durch kostimulatorische Signale notwendig ist und über die Tumorantigenbindung Mechanismen wie ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) zum Tragen kommen. Die Experimente mit gleichzeitiger Gabe von trifunktionalen Antikörpern und Immunsuppressiva haben gezeigt, dass eine Kombination beider Agenzien möglich ist. Die Konzentrationen sind jedoch sorgfältig derart zu wählen, dass die Zytokinausschüttung und die damit verbundenen Nebenwirkungen reduziert sind, ohne dass die anti-tumorale Wirkung der Antikörper maßgeblich beeinflusst wird. T-Zellen bedienen sich nach Aktivierung für die rasche Proliferation einer gesteigerten aeroben Glykolyse. Unter Behandlung der Kokulturen mit catumaxomab konnte im Vergleich zu anderen immunstimulatorischen Agenzien die größte Steigerung der Laktatproduktion bzw. der Azidifizierungs- und Sauerstoffverbrauchsrate detektiert werden. Diese Effekte weisen auf eine metabolische Aktivierung der PBMC durch catumaxomab hin. Das von den Tumorzellen abgegebene Laktat kann die Immunzellen jedoch inhibieren. Daher wäre die Kombination mit Glykolyseinhibitoren ein möglicher Ansatz, um die Therapieeffizienz weiter zu steigern. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine Komedikation der trifunktionalen Antikörper mit Chemotherapeutika zu einer gesteigerter Wirkung führte. Insgesamt liegt die Zukunft der Immuntherapien wohl in der Kombination mit anderen Wirkstoffklassen, die anti-tumorale Effekte verstärken oder immunsupprimierende Mechanismen inhibieren.

Entwicklung eines pharmakologischen Modells zur Prüfung immuntherapeutischer Antikörper mit dreidimensionalen Tumorzellkulturen in vitro

In den letzten Jahren hat die Tumorbehandlung mit immunologischen Präparaten an Bedeutung gewonnen. Der allgemeine Ablauf der Testung eines Arzneimittelkandidaten sieht vor, zunächst in Zellkulturversuchen und Tierversuchen Wirkweise und Sicherheit, sowie voraussichtliche Abbauwege und mögliche Gefahren so beurteilen zu können, dass sie für einen Einsatz im Menschen in Frage kommen. Zur präklinischen in vitro-Testung werden dabei in der Regel Monolayer-Zellkulturen oder Einzelzellsuspensionen eingesetzt. Der Einsatz von 3D-Zellkulturmodellen, welche den Aufbau von Mikrometastasen oder intervaskuläre Areale in Tumoren exakter widerspiegeln, führt zu wesentlich besseren Voraussagen bezüglich der klinischen Wirksamkeit neuer Präparate. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung und Anwendung eines neuen 3D-Zellkulturbasierten Systems zur Testung trifunktionaler bispezifischer Antikörper für die Tumorbehandlung, welches sich auch auf andere vergleichbare Präparate übertragen lässt.rnIn meiner Arbeit konnte ich mehrere humane Tumorzelllinien definieren, mit denen es gelang, stabile Co-Kulturen von Multi Cellular Tumour Spheroids (MCTS) mit Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) in miniaturisierten Spinner-Flaschen zu etablieren. Spinner-Flaschen, in denen die im Kulturmedium befindlichen Immunzellen, MCTS und Therapeutika ständig frei zirkulieren, sind besonders für eine wirklichkeitsnahe Nachbildung der in vivo-Simulation mit disseminierten Tumorzellen oder mit malignem Aszites geeignet. Diese Art der Kultivierung erlaubte Beobachtungszeiten von ≥20 Tagen für eine große Bandbreite Analysemethoden. Zu den mit dem erstellten Protokoll standardmäßig durchführbaren Analysemethoden zählen unter anderem immunhistochemische Färbungen an Sphäroid-Gefrierschnitten, Vitalitätstest, Untersuchung der Plattierungs-Effizienz, Bestimmung der Sphäroidvolumina, Zytokinbestimmungen aus dem Medienüberstand mit Cytokine Bead Arrays, PCR-Analysen immunzellspezifischer Antigene, sowie durchflusszytometrische Analysen. Diese Methodenkombination erlaubt einen sehr detaillierten Einblick in die Wirkweise und Effizienz neuer Immuntherapeutika aus verschiedensten Blickwinkeln und stellt ein reproduzierbares Testsystem zur präklinischen Testung von Immuntherapeutika dar, das zukünftig als Bindeglied zwischen Monolayer-Zellkulturen und klinischen Prüfungen einen festen Platz einnehmen könnte.rnMit dem beschriebenen 3D-Zellkultur-System wurden in der vorliegenden Arbeit die trifunktionalen bispezifischen Antikörper catumaxomab (unter dem Handelsnamen Removab® für die Behandlung maligner Ascites zugelassen) und ertumaxomab (derzeit in klinischen Prüfungen) hinsichtlich ihrer Wirkweise untersucht. Die Antikörper besitzen im Gegensatz zu herkömmlichen monoklonalen Antikörpern zwei verschiedene Bindungsarme, einer gegen CD3 auf T-Zellen, der zweite gegen EpCAM respektive Her2/neu - beides weit verbreitete Tumorantigene - gerichtet. An ihrem Fc-Teil besitzen sie eine dritte Bindungskapazität, über welche sie an Fcγ RI, -IIa und -III positive akzessorische Zellen binden. Diese Kombination ermöglicht theoretisch die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes aus T-Zelle, Tumorzelle und akzessorischer Zelle. Dies stellt eine wirkungsvolle Therapieoption unter Ausnutzung der körpereigenen, immunologischen Abwehr dar. rnIm Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass beide Antikörper eine Größenreduktion der Sphäroide mit den entsprechenden Tumorantigenen in gleichem Maße bewirkten und die Plattierungseffizienz durch ertumaxomab dosisabhängig reduziert wurde. Mit dem erstellten Testsystem konnte der Wirkmechanismus von catumaxomab auf Sphäroide der Zelllinie FaDu (Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom) detaillierter gezeigt werden: catumaxomab wirkte dosisabhängig auf die Reduktion der Sphäroidvolumina und die zunehmende Infiltration von CD45+ Zellen, die als T-, NK- und/oder dendritische Zellen identifiziert wurden. Des Weiteren rief die catumaxomab-Gabe eine verstärkte Ausschüttung der Zytokine IL-2, IFN-γ und TNF-α hervor. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass catumaxomab die zelluläre Immunantwort aktiviert.rnDie Standard-Tumorbehandlung beinhaltet die Gabe von Chemotherapeutika. Oft werden dafür Zytostatika mit dem unerwünschten Nebeneffekt auch gesunde proliferierende Zellen anzugreifen verwendet. Dies kann prinzipiell auch die Wirksamkeit der Antikörper-Therapie beeinflussen. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit zusätzlich vergleichende Kombinations-Versuche mit catumaxomab und einem gängigen Zytostatikum - Cisplatin - durchgeführt. Mit Untersuchungen der Sphäroidvolumina, Vitalitätstests und Plattierungseffizienz konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von catumaxomab bei gleichzeitiger Anwendung beider Therapeutika aufrecht erhalten bleibt und diese sogar additiv verstärkt wird. Eine Kombinationstherapie im Menschen ist daher denkbar.rnrn

Role of outgrowth endothelial cells for applications in tissue engineering

Co-culture systems, consisting of outgrowth endothelial cells (OEC) and primary osteoblasts (pOB), represent a prom¬ising instrument to mimick the natural conditions in bone repair processes and provide a new concept to develop constructs for bone replacement. Furthermore, co-culture of OEC and pOB could provide new insights into the molecular and cellular mechanisms that control essential processes during bone repair. The present study described several advantages of the co-culture of pOB and OEC for bone tissue engineering applications, including beneficial effects on the angiogenic activation of OEC, as well as on the assembly of basement membrane matrix molecules and factors involved in vessel maturation and stabilization. The ongoing angiogenic process in the co-culture system proceeded during the course of co-cultivation and correlated with the upregulation of essential angiogenic factors, such as VEGF, angiopoietins, basement membrane molecules and mural cell-specific markers. Furthermore the co-culture system appeared to maintain osteogenic differentiation capacity.rnrnAdditional treatment of co-cultures with growth factors or morphogens might accelerate and improve bone formation and furthermore could be useful for potential clinical applications. In this context, the present study highlights the central role of the morphogen, sonic hedgehog, which has been shown to affect angiogenic activation as well as osteogenic differentiation in the co-culture model of OEC and pOB. Treatment of co-cultures with sonic hedgehog resulted in an increased formation of microvessel-like structures as early as after 24 hours. This proangiogenic effect was induced by the upregulation of the proangiogenic factors, VEGF, angiopoietin1 and angiopoietin 2. In contrast to treatment with a commonly used proangiogenic agent, VEGF, Shh stimulation induced an increased expression of factors associated with vessel maturation and stabilization, mediated through the upregulation of growth factors that are strongly involved in pericyte differentiation and recruitment, including PDGF-BB and TGFbeta. In addition, Shh treatment of co-cultures also resulted in an upregulation of osteogenic differentiation markers like alkaline phosphatase, osteocalcin, osteonectin and osteopontin, as well as an increased matrix calcification. This was a result of upregulation of the osteogenic differentiation regulating factors, BMP2 and RUNX2 which could be assessed in response to Shh treatment. rn

Differentiation and extracellular matrix interactions of chondrocytes in response to signaling molecules and biomaterials for cartilage repair = Differenzierung und Interaktionen von Chondrozyten mit der extrazellulären Matrix als Reaktion auf Signalmoleküle und Biomaterialien für die Wiederinstandsetzung von Knorpel

Chondrocytes live isolated in the voluminous extracellular matrix of cartilage, which they secrete and is neither vascularized nor innervated. Nutrient and waste exchanges occur through diffusion leading to low oxygen tension around the cells. Consequently even normal cartilage under normal physiological conditions suffers from a poor reparative potential that predisposes to degenerative conditions, such as osteoarthritis of the joints, with significant clinical effects.rnOne of the key challenges in medicine is the structural and functional replacement of lost or damaged tissues. Current therapeutical approaches are to transplant cells, implant bioartificial tissues, and chemically induce regeneration at the site of the injury. None of them reproduces well the biological and biomechanical properties of hyaline cartilage.rnThis thesis investigates the re-differentiation of chondrocytes and the repair of cartilage mediated by signaling molecules, biomaterials, and factors provided in mixed cellular cultures (co-culture systems). As signaling molecules we have applied prostaglandin E2 (PGE2) and bone morphogenetic protein 1 (BMP-1) and we have transfected chondrocytes with BMP-1 expressing vectors. Our biomaterials have been hydrogels of type-I collagen and gelatin-based scaffolds designed to mimic the architecture and biochemistry of native cartilage and provide a suitable three-dimensional environment for the cells. We have brought chondrocytes to interact with osteosarcoma Cal 72 cells or with murine preosteoblastic KS483 cells, either in a cell-to-cell or in a paracrine manner.rnExogenous stimulation with PGE2 or BMP-1 did not improve the differentiation or the proliferation of human articular chondrocytes. BMP-1 induced chondrocytic de-differentiation in a dose-dependent manner. Prostaglandin stimulation from gelatin-based scaffolds (three-dimensional culture) showed a certain degree of chondrocyte re-differentiaton. Murine preosteoblastic KS483 cells had no beneficial effect on human articular chondrocytes jointly cultivated with them in hydrogels of type I collagen. Although the hydrogels provided the chondrocytes with a proper matrix in which the cells adopted their native morphology; additionally, the expression of chondrocytic proteoglycan increased in the co-cultures after two weeks. The co-culture of chondrocytes with osteoblast-like cells (in transwell systems) resulted in suppression of the regular de-differentiation program that passaged chondrocytes undergo when cultured in monolayers. Under these conditions, the extracellular matrix of the chondrocytes, rich in type-II collagen and aggrecan, was not transformed into the extracellular matrix characteristic of de-differentiated human articular chondrocytes, which is rich in type-I collagen and versican.rnThis thesis suggests novel strategies of tissue engineering for clinical attempts to improve cartilage repair. Since implants are prepared in vitro (ex-vivo) by expanding human articular chondrocytes (autologous or allogeneic), we conclude that it will be convenient to provide a proper three-dimensional support to the chondrocytes in culture, to supplement the culture medium with PGE2, and to stimulate chondrocytes with osteoblastic factors by cultivating them with osteoblasts.rn

Volatile anesthetics influence blood-brain barrier integrity by modulation of tight junction protein expression in traumatic brain injury

Disruption of the blood-brain barrier (BBB) results in cerebral edema formation, which is a major cause for high mortalityrnafter traumatic brain injury (TBI). As anesthetic care is mandatory in patients suffering from severe TBI it may be importantrnto elucidate the effect of different anesthetics on cerebral edema formation. Tight junction proteins (TJ) such as zonularnoccludens-1 (ZO-1) and claudin-5 (cl5) play a central role for BBB stability. First, the influence of the volatile anestheticsrnsevoflurane and isoflurane on in-vitro BBB integrity was investigated by quantification of the electrical resistance (TEER) inrnmurine brain endothelial monolayers and neurovascular co-cultures of the BBB. Secondly brain edema and TJ expression ofrnZO-1 and cl5 were measured in-vivo after exposure towards volatile anesthetics in native mice and after controlled corticalrnimpact (CCI). In in-vitro endothelial monocultures, both anesthetics significantly reduced TEER within 24 hours afterrnexposure. In BBB co-cultures mimicking the neurovascular unit (NVU) volatile anesthetics had no impact on TEER. In healthyrnmice, anesthesia did not influence brain water content and TJ expression, while 24 hours after CCI brain water contentrnincreased significantly stronger with isoflurane compared to sevoflurane. In line with the brain edema data, ZO-1 expressionrnwas significantly higher in sevoflurane compared to isoflurane exposed CCI animals. Immunohistochemical analysesrnrevealed disruption of ZO-1 at the cerebrovascular level, while cl5 was less affected in the pericontusional area. The studyrndemonstrates that anesthetics influence brain edema formation after experimental TBI. This effect may be attributed tornmodulation of BBB permeability by differential TJ protein expression. Therefore, selection of anesthetics may influence thernbarrier function and introduce a strong bias in experimental research on pathophysiology of BBB dysfunction. Futurernresearch is required to investigate adverse or beneficial effects of volatile anesthetics on patients at risk for cerebral edema.

Mikrobiologie der Fermentation in NawaRo-Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung des Abbaus von Propionsäure

In NawaRo-Biogasanlagen (BGA) kann es durch das Angebot an leicht fermentierbaren Kohlenstoff¬quel¬len zu einer bakteriell bedingten Übersäuerung durch unerwünschte kurzkettige Fettsäuren kommen. Häufiger kommt es zur Akkumulation von Propionsäure. Methanogene Archaea können bei niedrigen pH-Werten nicht mehr wachsen. Somit kann der gesamte Prozess der mikrobiellen Bildung von Biogas zum Erliegen kom¬men, was für die Biogasbetreiber zu erheblichen finanziellen Verlusten führt. Das Ziel dieser Disserta¬tion war die Aufklärung der anaeroben bakteriellen Population, die in Biogasanlagen Propionsäure ab¬bauen kann. Aus Propionat entsteht dabei Acetat und Wasserstoff. Da dieser anaerobe Prozess endergon verläuft, kann Propionsäure anaerob nur abgebaut werden, wenn der Wasserstoffpartialdruck niedrig ge¬halten wird. Diese Aufgabe erfüllen in Biogasanalgen methanogene Archaea. Die sog. sekundären Gärer leben somit in synthropher Kultur mit methanogenen Archaea.rnIn dieser Arbeit wurden die Mikroorganismen von Propionsäure-abbauenden Anreicherungskulturen aus vier NawaRo-BGA‘s identifiziert und ihr Substrat- und Produktspektrum analysiert. Die Anreicherungskul¬turen wurden vom Prüf- und Forschungsinstitut e. V. in Pirmasens zur Verfügung gestellt. Durch Analyse der bakteriellen 16S rDNA-Sequenzen der erhaltenen stabilen Propionsäure-abbauenden Mischkulturen wurde gezeigt, dass sich unter den Bakterien hauptsächlich Verwandte von den Clostridiales, aber auch Bacteroides sp., δ-, ε- so¬wie γ-Proteobakterien, Spirochäten, Synergistales und ungewöhnlicher Weise auch Thermotogales befanden. Aus Propionsäure-abbauenden Mischkulturen und aus Fermentern mesophiler NawaRo-Biogasanlagen wurden anaerobe Bakterien und methanogene Archaea angereichert und isoliert. Es wurden aus den Propionsäure-abbauenden Mischkulturen Stämme in Reinkultur erhalten, die entsprechend der 16S rDNA-Analyse als Clostridium sartagoforme Stamm Ap1a520 und Proteiniphilum acetatigenes Stamm Fp1a520 identifiziert wurden. Sowohl aus Fermentern und Nachgärern von drei NawaRo-BGA‘s als auch aus zwei Laborfermentern des Leibniz-Instituts für Agrartechnik in Potsdam-Bornim e.V. (ATB) wurden Reinkulturen von methanogenen Archaea erhalten. Diese konnten den Species Methanobacterium formicicum, Metha¬noculleus bourgensis, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, Methanosarcina sp., Methanosaeta concilii und Methanomethylovorans sp. zugeordnet werden. Damit wurden in dieser Arbeit unter anderem die typischen bisher nur durch molekularbiologische Methoden identifizierten Species methanogener Ar¬chaea aus unterschiedlichen Fermentern in Reinkultur erhalten. Dabei wurde gezeigt, dass die specifically amplified polymorphic DNA-PCR (SAPD-PCR) eine geeignete Methode darstellt, Stämme der gleichen Art methanogener Archaea voneinander zu unterscheiden. Die Methanproduktion der kultivierten methanoge¬nen Archaea wurde gaschromatographisch analysiert. Es zeigte sich, dass die hydrogenotrophe Metha¬nogenese der effizientere und ergiebigere Weg zur Bildung von Methan ist. Mit der Bestimmung der Zellzahl des Isolates Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 bei gleichzeitiger Messung der Methanbildung wurde gezeigt, dass die Methanbildung nicht zwangsläufig mit dem Wachstum korreliert. Ne-ben Pflanzenfasern beinhalteten das hergestellte Reaktorfiltrat in den Kultivierungsansätzen Acetat, die essentielle Aminosäure Valin und den Zuckeralkohol Glycerol. Gezielte Misch¬kul¬turen von sekundären Gärern mit methanogenen Isolaten ergaben einen fördernden Einfluss auf diese Bak¬terien durch hydrogenotrophe Archaea. Diese Bakterien bauten Substrate ab oder bildeten Produkte, die sie unter den gegebenen Bedingungen ohne hydrogenotrophe Archaea nicht umsetzen konnten.

Tissue engineering strategies for biomaterial-based anticancer drug delivery and enhancement of angiogenesis in tumor-resected bone

Patienten, die an Osteosarkom leiden werden derzeit mit intravenös applizierten krebstherapeutischen Mitteln nach Tumorresektion behandelt, was oftmals mit schweren Nebenwirkungen und einem verzögerten Knochenheilungsprozess einhergeht. Darüber hinaus treten vermehrt Rezidive aufgrund von verbleibenden neoplastischen Zellen an der Tumorresektionsstelle auf. Erfolgreiche Knochenregeneration und die Kontrolle von den im Gewebe verbleibenden Krebszellen stellt eine Herausforderung für das Tissue Engineering nach Knochenverlust durch Tumorentfernung dar. In dieser Hinsicht scheint der Einsatz von Hydroxyapatit als Knochenersatzmaterial in Kombination mit Cyclodextrin als Medikamententräger, vielversprechend. Chemotherapeutika können an Biomaterial gebunden und direkt am Tumorbett über einen längeren Zeitraum freigesetzt werden, um verbliebene neoplastische Zellen zu eliminieren. Lokal applizierte Chemotherapie hat diverse Vorteile, einschließlich der direkten zytotoxischen Auswirkung auf lokale Zellen, sowie die Reduzierung schwerer Nebenwirkungen. Diese Studie wurde durchgeführt, um die Funktionsfähigkeit eines solchen Arzneimittelabgabesystems zu bewerten und um Strategien im Bereich des Tissue Engineerings zu entwickeln, die den Knochenheilungsprozess und im speziellen die Vaskularisierung fördern sollen. Die Ergebnisse zeigen, dass nicht nur Krebszellen von der chemotherapeutischen Behandlung betroffen sind. Primäre Endothelzellen wie zum Beispiel HUVEC zeigten eine hohe Sensibilität Cisplatin und Doxorubicin gegenüber. Beide Medikamente lösten in HUVEC ein tumor-unterdrückendes Signal durch die Hochregulation von p53 und p21 aus. Zudem scheint Hypoxie einen krebstherapeutischen Einfluss zu haben, da die Behandlung sensitiver HUVEC mit Hypoxie die Zellen vor Zytotoxizität schützte. Der chemo-protektive Effekt schien deutlich weniger auf Krebszelllinien zu wirken. Diese Resultate könnten eine mögliche chemotherapeutische Strategie darstellen, um den Effekt eines zielgerichteten Medikamenteneinsatzes auf Krebszellen zu verbessern unter gleichzeitiger Schonung gesunder Zellen. Eine erfolgreiche Integration eines Systems, das Arzneimittel abgibt, kombiniert mit einem Biomaterial zur Stabilisierung und Regeneration, könnte gesunden Endothelzellen die Möglichkeit bieten zu proliferieren und Blutgefäße zu bilden, während verbleibende Krebszellen eliminiert werden. Da der Prozess der Knochengeweberemodellierung mit einer starken Beeinträchtigung der Lebensqualität des Patienten einhergeht, ist die Beschleunigung des postoperativen Heilungsprozesses eines der Ziele des Tissue Engineerings. Die Bildung von Blutgefäßen ist unabdingbar für eine erfolgreiche Integration eines Knochentransplantats in das Gewebe. Daher ist ein umfangreich ausgebildetes Blutgefäßsystem für einen verbesserten Heilungsprozess während der klinischen Anwendung wünschenswert. Frühere Experimente zeigen, dass sich die Anwendung von Ko-Kulturen aus humanen primären Osteoblasten (pOB) und humanen outgrowth endothelial cells (OEC) im Hinblick auf die Bildung stabiler gefäßähnlicher Strukturen in vitro, die auch effizient in das mikrovaskuläre System in vivo integriert werden konnten, als erfolgreich erweisen. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um prä-vaskularisierte Konstrukte herzustellen, die den Knochenheilungsprozess nach der Implantation fördern. Zusätzlich repräsentiert das Ko-Kultursystem ein exzellentes in vitro Model, um Faktoren, welche stark in den Prozess der Knochenheilung und Angiogenese eingebunden sind, zu identifizieren und zu analysieren. Es ist bekannt, dass Makrophagen eine maßgebliche Rolle in der inflammatorisch-induzierten Angiogenese spielen. In diesem Zusammenhang hebt diese Studie den positiven Einfluss THP-1 abgeleiteter Makrophagen in Ko-Kultur mit pOB und OEC hervor. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anwendung von Makrophagen als inflammatorischer Stimulus im bereits etablierten Ko-Kultursystem zu einer pro-angiogenen Aktivierung der OEC führte, was in einer signifikant erhöhten Bildung blutgefäßähnlicher Strukturen in vitro resultierte. Außerdem zeigte die Analyse von Faktoren, die in der durch Entzündung hervorgerufenen Angiogenese eine wichtige Rolle spielen, eine deutliche Hochregulation von VEGF, inflammatorischer Zytokine und Adhäsionsmoleküle, die letztlich zu einer verstärkten Vaskularisierung beitragen. Diese Resultate werden dem Einfluss von Makrophagen zugeschrieben und könnten zukünftig im Tissue Engineering eingesetzt werden, um den Heilungsprozess zu beschleunigen und damit die klinische Situation von Patienten zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Kombination der auf Ko-Kulturen basierenden Ansätze für das Knochen Tissue Engineering mit einem biomaterial-basierenden Arzneimittelabgabesystem zum klinischen Einsatz kommen, der die Eliminierung verbliebener Krebszellen mit der Förderung der Knochenregeneration verbindet.

Liquid crystalline elastomers as stimuli-responsive microactuators

Liquid crystalline elastomers (LCEs) are known to perform a reversible change of shape upon the phase transition from the semi-ordered liquid crystalline state to the chaotic isotropic state. This unique behavior of these “artificial muscles” arises from the self-organizing properties of liquid crystals (mesogens) in combination with the entropy-elasticity of the slightly crosslinked elastomer network. In this work, micrometer-sized LCE actuators are fabricated in a microfluidic setup. The microtubular shear flow provides for a uniform orientation of the mesogens during the crosslinking, a perquisite for obtaining actuating LCE samples. The scope of this work was to design different actuator geometries and to broaden the applicability of the microfluidic device for different types of liquid crystalline mesogens, ranging from side-chain to main-chain systems, as well as monomer and polymer precursors. For example, the thiol-ene “click” mechanism was used for the polymerization and crosslinking of main-chain LCE actuators. The main focus was, however, placed on acrylate monomers and polymers with LC side chains. A LC polymer precursor, comprising mesogenic and crosslinkable side-chains was synthesized. Used in combination with an LC monomer, the polymeric crosslinker promoted a stable LC phase, which allowed the mixture to be isothermally handled in the microfluidic reactor. If processed without the additional LC components, the polymer precursor yielded actuating fibers. A suitable co-flowing continuous phase facilitates the formation of a liquid jet and lowers the tendency for drop formation. By modification of the microfluidic device, it was further possible to prepare core-shell particles, comprised of an LCE shell and filled with an isotropic liquid. In analogy to the heart, a hollow muscle, the elastomer shell expels the inner liquid core upon its contraction. The feasibility of the core-shell particles as micropumps was demonstrated. In general, the synthesized LCE microactuators may be utilized as active components in micromechanical and lab-on-chip systems.

The fabrication and application of semi-crystalline and thermoset-thermoplastic composite colloidal particles with well-defined microstructures

Die Zielsetzung der Arbeit besteht darin, neue Ansätze zur Herstellung strukturierter Kompositpartikel in wässrigem Medium zu entwickeln, welche als die Bildung genau definierter heterogener Strukturen in Kolloidsystemen angesehen werden können. Im Allgemeinen wurden zwei verschiedene Herangehensweisen entwickelt, die sich aufgrund des Ursprungs der gebildeten heterogenen Strukturen unterscheiden: Heterogenität oder Homogenität. Der Erste Ansatz basiert auf der Aggregation heterogener Phasen zur Bildung strukturierter Kolloidpartikel mit Heterogenität in der zugrunde liegenden Chemie, während der Zweite Ansatz auf der Bildung heterogener Phasen in Kolloidpartikeln aus homogenen Mischungen heraus durch kontrollierte Phasenseparation beruht.rnIm Detail beschäftigt sich der erste Teil der Dissertation mit einer neuen Herstellungsmethode für teilkristalline Komposit-Kolloidpartikel mit hoher Stabilität basierend auf der Aggregation flüssiger Monomertropfen an teilkristalline Polyacrylnitrilpartikel. Nach der Aggregation wurden hochstabile Dispersionen bestehend aus strukturierten, teilkristallinen Kompositpartikeln durch freie radikalische Polymerisation erhalten, während ein direktes Mischen der PAN Dispersionen mit Methacrylat-Polymerdispersionen zur unmittelbaren Koagulation führte. In Abhängigkeit von der Glastemperatur des Methacrylatpolymers führt die anschließende freie radikalische Polymerisation zur Bildung von Rasberry oder Kern-Schale Partikeln. Die auf diese Weise hergestellten Partikel sind dazu in der Lage, kontinuierliche Filme mit eingebetteten teilkristallinen Phasen zu bilden, welche als Sauerstoffbarriere Anwendung finden können.rnDer zweite Teil der Dissertation beschreibt eine neue Methode zur Herstellung strukturierter Duroplast-Thermoplast Komposit-Kolloidpartikel. Die Bildung eines Duroplastnetzwerks mit einer thermoplastischen Hülle wurde in zwei Schritten durch verschiedene, separate Polymerisationsmechanismen erreicht: Polyaddition und freie radikalische Polymerisation. Es wurden stabile Miniemulsionen erhalten, welche aus Bisphenol-F basiertem Epoxidharz, Phenalkamin-basiertem Härter und Vinlymonomere bestehen. Sie wurden durch Ultraschall mit nachfolgender Härtung bei verschiedenen Temperaturen als sogenannte Seed-Emulsionen hergestellt. Weitere Vinylmonomere wurden hinzugegeben und nachfolgend polymerisiert, was zur Bildung von Kern-Schale, beziehungsweise Duroplast-Thermoplast Kolloidpartikeln führte. Dabei findet in beiden Fällen zwischen der duroplastischen und der thermoplastischen Phase eine chemisch induzierte Phasenseparation statt, welche essenziell für die Bildung heterogener Strukturen ist. Die auf diese Weise hergestellten Kompositpartikel sind dazu in der Lage, transparente Filme zu bilden, welche unter geeigneten Bedingungen deutlich verbesserte mechanische Eigenschaften im Vergleich zu reinen Duroplastfilmen bereitstellen.rn

Complementary mass spectrometric techniques for the characterization of the organic fraction in atmospheric aerosols

Aerosol particles are strongly related to climate, air quality, visibility and human health issues. They contribute the largest uncertainty in the assessment of the Earth´s radiative budget, directly by scattering or absorbing solar radiation or indirectly by nucleating cloud droplets. The influence of aerosol particles on cloud related climatic effects essentially depends upon their number concentration, size and chemical composition. A major part of submicron aerosol consists of secondary organic aerosol (SOA) that is formed in the atmosphere by the oxidation of volatile organic compounds. SOA can comprise a highly diverse spectrum of compounds that undergo continuous chemical transformations in the atmosphere.rnThe aim of this work was to obtain insights into the complexity of ambient SOA by the application of advanced mass spectrometric techniques. Therefore, an atmospheric pressure chemical ionization ion trap mass spectrometer (APCI-IT-MS) was applied in the field, facilitating the measurement of ions of the intact molecular organic species. Furthermore, the high measurement frequency provided insights into SOA composition and chemical transformation processes on a high temporal resolution. Within different comprehensive field campaigns, online measurements of particular biogenic organic acids were achieved by combining an online aerosol concentrator with the APCI-IT-MS. A holistic picture of the ambient organic aerosol was obtained through the co-located application of other complementary MS techniques, such as aerosol mass spectrometry (AMS) or filter sampling for the analysis by liquid chromatography / ultrahigh resolution mass spectrometry (LC/UHRMS).rnIn particular, during a summertime field study at the pristine boreal forest station in Hyytiälä, Finland, the partitioning of organic acids between gas and particle phase was quantified, based on the online APCI-IT-MS and AMS measurements. It was found that low volatile compounds reside to a large extent in the gas phase. This observation can be interpreted as a consequence of large aerosol equilibration timescales, which build up due to the continuous production of low volatile compounds in the gas phase and/or a semi-solid phase state of the ambient aerosol. Furthermore, in-situ structural informations of particular compounds were achieved by using the MS/MS mode of the ion trap. The comparison to MS/MS spectra from laboratory generated SOA of specific monoterpene precursors indicated that laboratory SOA barely depicts the complexity of ambient SOA. Moreover, it was shown that the mass spectra of the laboratory SOA more closely resemble the ambient gas phase composition, indicating that the oxidation state of the ambient organic compounds in the particle phase is underestimated by the comparison to laboratory ozonolysis. These observations suggest that the micro-scale processes, such as the chemistry of aerosol aging or the gas-to-particle partitioning, need to be better understood in order to predict SOA concentrations more reliably.rnDuring a field study at the Mt. Kleiner Feldberg, Germany, a slightly different aerosol concentrator / APCI-IT-MS setup made the online analysis of new particle formation possible. During a particular nucleation event, the online mass spectra indicated that organic compounds of approximately 300 Da are main constituents of the bulk aerosol during ambient new particle formation. Co-located filter analysis by LC/UHRMS analysis supported these findings and furthermore allowed to determine the molecular formulas of the involved organic compounds. The unambiguous identification of several oxidized C 15 compounds indicated that oxidation products of sesquiterpenes can be important compounds for the initial formation and subsequent growth of atmospheric nanoparticles.rnThe LC/UHRMS analysis furthermore revealed that considerable amounts of organosulfates and nitrooxy organosulfates were detected on the filter samples. Indeed, it was found that several nitrooxy organosulfate related APCI-IT-MS mass traces were simultaneously enhanced. Concurrent particle phase ion chromatography and AMS measurements indicated a strong bias between inorganic sulfate and total sulfate concentrations, supporting the assumption that substantial amounts of sulfate was bonded to organic molecules.rnFinally, the comprehensive chemical analysis of the aerosol composition was compared to the hygroscopicity parameter kappa, which was derived from cloud condensation nuclei (CCN) measurements. Simultaneously, organic aerosol aging was observed by the evolution of a ratio between a second and a first generation biogenic oxidation product. It was found that this aging proxy positively correlates with increasing hygroscopicity. Moreover, it was observed that the bonding of sulfate to organic molecules leads to a significant reduction of kappa, compared to an internal mixture of the same mass fractions of purely inorganic sulfate and organic molecules. Concluding, it has been shown within this thesis that the application of modern mass spectrometric techniques allows for detailed insights into chemical and physico-chemical processes of atmospheric aerosols.rn